Identifikasi Mutasi Gen β Globin Ekson 1 Pada Pembawa Thalassemia PDF

ISSN 2302-1616 Vol 2, No. 1, Juni 2014, hal 63-69 Identifikasi Mutasi Gen β Globin Ekson 1 Pada Pembawa Thalassemia NIKEN SATUTI NUR HANDAYANI1, ANDIKA TRIPRAMUDYA ONGGO2 1...

ISSN 2302-1616 Vol 2, No. 1, Juni 2014, hal 63-69 Identifikasi Mutasi Gen β Globin Ekson 1 Pada Pembawa Thalassemia NIKEN SATUTI NUR HANDAYANI1, ANDIKA TRIPRAMUDYA ONGGO2 1 Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada Jl. Teknika Selatan Sekip Utara Sleman Yogyakarta 55281 email: [email protected] 2Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada Jl. Teknika Selatan Sekip Utara Sleman Yogyakarta 55281 email: [email protected] ABSTRACT Thalassemia is an autosomal recessive genetic mutation disorder with symptoms similliar to anemia that causes deficiency synthesis of the globin chains (hemoglobin component inside erythrocytes). Thalassemia is classified based on secondary protein structure abnormalities in α globin protein or β globin protein. Based on data from Indonesian Thalassemia Foundation (YTI) in Indonesia, people with thalassemia, especialy β thalassemia is constantly increasing 8 to 10% per year, so it is very impotant to have a strategy that reduce the increasing number in the population. Genetic examination on the individual is very effective to detect quickly the person with thalassemia trait carrier, to reduce the number of thalassemia carrier population. Identification of 1st exon β globin gene mutations with sequencing method is one of the way to know the specific mutation in thalassemia carriers. Identification results can be used as a reference for the rapid detection of thalassemia trait carrier. This study aims to determine the type of mutation and location of nucleotide mutations in 1st exon β globin gene on carrier of thalassemia and the changes of amino acid translated by the mutant gene. The study was conducted by isolating the genome from the β thalassemia carrier blood, amplifying and sequencing the 1st exon β globin gene. The location of point mutation analysis and the changes of amino acid, was analyzed using computational method by comparative alignment using normal β globin gene as a comparison. The results of the research showed there is a point mutation in the 59th nucleotide caused by transition (T to C) and 147th nucleotide caused by transversion (G to C). The mutation type found on this study was a silent mutation because there is no change in the translated amino acid. Keywords: β globin, exon 1, mutation, thalassemia PENDAHULUAN thalassemia β, pada protein β globin (Guyton Thalassemia merupakan kelainan genetik & Hall, 2010). Di Indonesia, penyandang akibat mutasi gen yang bersifat autosomal thalassemia, menurut Ketua Umum Yayasan resesif yang disebabkan kekurangan sintesis Talasemia Indonesia (YTI), Rinie Amaludin, rantai globin pembentuk hemoglobin darah terus meningkat 8 hingga 10% per tahun, dengan gejala mirip anemia (Galanello & sehingga diperlukan penelitian dan strategi Origa, 2010). Penyandang thalassemia untuk menekan jumlah penyandang dalam memiliki hemoglobin (Hb) dalam sel darah populasi (Ansari & Shamsi, 2010). merah (eritrosit) yang tidak dapat mengikat Pemeriksaan terhadap pembawa oksigen dengan baik. Dengan kondisi yang thalassemia sangat efektif untuk menekan demikian maka penyandang thalassemia sering jumlah populasi penyandang, melalui merasa lemas karena kekurangan oksigen pemeriksaan hematologis, yang dilanjutkan terlarut dalam darah. dengan deteksi letak mutasi. Thalassemia β Thalassemia diklasifikasikan berdasar terjadi karena mutasi gen HBB pada kelainan molekul sekunder protein α globin kromosom nomor 11 sehingga identifikasi atau protein β globin. Thalassemia α memiliki mutasi gen β globin ekson 1 pada gen HBB kelainan pada protein α globin, sedangkan kromosom nomor 11, dengan metode NIKEN SATUTI NUR HANDAYANI, ANDIKA TRIPRAMUDYA ONGGO Biogenesis 64 sekuensing merupakan cara efektif mengetahui gen β globin ekson 1 pada pembawa mutasi spesifik pada pembawa thalassemia thalassemia; serta mempelajari dan yang dapat digunakan sebagai acuan untuk mengetahui letak mutasi nukleotida yang deteksi cepat pembawa sifat thalassemia. terjadi pada gen β globin ekson 1 dan Penelitian ini untuk mempelajari dan perubahan asam amino yang disandi pada mengetahui jenis mutasi apakah yang terjadi di pembawa thalassemia. METODE Tabel 1. Rekapitulasi hasil uji hematologis dan uji PCR-SSCP sampel darah Kode Subjek Hasil Uji Hematologis Hasil Uji PCR-SSCP Penelitian CBC MC GDT HPLC Region I Region II Region III Region IV P4 + + + + + - - - P13 + + + + + - - - P14 + + + + + - - - P15 + + + + + + - - P16 + + + + + - - + P17 + + + + + + - + P18 + + + + + - - + P19 + + + + + - - - P20 + + + + + - - + P21 + + + + + - - - Keterangan: CBC: Cell Blood Count, MC: Mean Corpuscular, GDT: Gambaran Darah Tepi, HPLC: High Performance Liquid Chromatography, P4-P21: Subjek penelitian terduga pembawa sifat thalassemia β, tanda plus (+) menunjukkan adanya kondisi abnormalitas pada masing-masing parameter, tanda minus (-) menunjukkan kondisi normal pada masing-masing parameter (Priyambodo, 2014). Tabel 2. Sekuen primer untuk amplifikasi gen β globin ekson 1 (Gupta & Argawal, 2003) Primer Sekuen Ukuran amplikon Primer F 5’ CCAAGGACAGGTACGGCTGTCATC 3’ 322bp Primer R 5’ CTATTGGTCTCCTAAACCTGTCTTG 3’ Gambar 1. Representasi gen β-globin dan lokasi primer, daerah amplifikasi dan ukuran amplikon (bp). IVS, intervening sequence (intron) Bahan yang digunakan dalam penelitian Vivantis 100 bp, PCR master mix KAPA 2G™ adalah 10 sampel darah yang berasal dari Fast Ready Mix, ethidium bromide (EtBr), gel subyek penelitian sebelumnya oleh agarosa Biotechnology Grade, akuades, buffer Priyambodo pada 2014, yang sudah dideteksi Tris-Borat EDTA (TBE) 10x, EDTA, pewarna memiliki mutasi gen β globin ekson 1, dengan Good View dan primer spesifik (Tabel 2) kondisi hematologis dan hasil PCR-SSCP untuk amplifikasi segmen gen β, sehingga ditunjukkan pada Tabel 1, DNA Ladder amplikon sesuai dengan target pada Gambar 1, Vol 2, Juni 2014 Biogenesis 65 mencangkup seluruh ekson 1. Penelitian ini alignment pada urutan nukleotida ke 1 hingga dimulai dengan mengisolasi genom DNA dari ke 50 menunjukkan bahwa tidak ada whole blood pembawa thalassemia β sampel perbedaan nukleotida sama sekali, sehingga penelitian pendahulu yang dideteksi memiliki disimpulkan bahwa pada urutan nukleotida ke mutasi di region 1 (Priyambodo, 2014). Isolasi 1 hingga ke 50 tidak ada mutasi yang terjadi. genom dilakukan dengan kit produk GeneAid. Urutan nukleotida ke 1 hingga ke 50 DNA Genom yang didapat diperiksa merupakan ekson 1 gen β globin tetapi bukan kualitasnya dengan elektroforesis di agarose merupakan CDS (Coding Sequences), gel 1%. Gen β globin ekson 1 diamplifikasi sehingga urutan nukleotida ke 1 hingga ke 50 dengan Thermocyler menggunakan primer tidak ditranslasikan menjadi asam amino untuk (Tabel 2). Amplifikasi menggunakan 25 µl gen β globin. reaction mixture dengan komposisi 12,5 µl Alignment urutan nukleotida ke 51 hingga PCR Mix KAPA 2G™ Fast Ready Mix, 3 µl ke 100 menunjukkan bahwa ada perbedaan DNA template, 1,25µl forward primer (10 nukleotida gen pada 7 sampel (sampel 14, 16, pmol), 1,25 µl reverse primer (10 pmol) & 7 17, 18, 19, 20 dan 21), yaitu pada site ke 59. µl ddH2O. Suhu proses predenaturasi Mutasi yang terjadi adalah timin menjadi amplifikasi 95o C selama 3 menit. Denaturasi sitosin. Perbedaan nukleotida (tabel 3) ditandai 95 o C selama 15 detik, annealing 54 o C selama dengan format blok berwarna abu-abu dan 30 detik, elongasi 72 o C selama 45 detik, dari huruf Italic, menunjukkan adanya mutasi di denaturasi hingga elongasi diulangi sebanyak ekson 1 gen β globin. Urutan nukleotida ke 51 35 cycle. Pasca elongasi 72 o C selama 5 menit hingga ke 100 merupakan CDS, sehingga ikut & pendinginan 4 o C selama 5 menit. ditranslasikan menjadi asam amino untuk gen Amplikon yang didapat, diperiksa β globin. kualitasnya dengan elektroforesis di agarose Alignment pada urutan nukleotida ke 101 gel 1%, kemudian disekuensing oleh hingga ke 150 menunjukkan bahwa terdapat perusahaan 1stBase dengan alat sequencer perubahan nukleotida guanin menjadi sitosin AB13730XL. Hasil sekuensing dibandingkan pada urutan nukleotida ke 147 pada sampel 14, dengan database gen normal β globin 16, 17, 18, 20 dan 21. Bagian dari ekson utama (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/, dengan dari nukleotida ke 101 hingga ke 142 tidak ada Reference Sequence Accession: mutasi yang terjadi sama sekali. Urutan NC_000011.10), sehingga dapat diketahui nukleotida ke 101 hingga ke 142 merupakan mutasinya. Software yang digunakan: bagian CDS (Coding Sequences), sehingga Chromas untuk mengecek hasil sekuensing & urutan nukleotida ke 101 hingga ke 142 ikut software MEGA untuk alignment serta melihat ditranslasikan menjadi asam amino untuk gen hasil translasi digunakan. β globin, sedangkan nukleotida 143 hingga ke 150 tidak ditranslasikan. HASIL Tabel 4 menunjukkan alignment translasi Hasil sekuensing ekson 1 dari sampel kodon gen menjadi rantai asam amino. Bagian dibandingkan dengan database gen β globin paling atas (nomor 1) merupakan urutan asam dari NCBI dengan cara disejajarkan amino normal yang didapat dari NCBI. Hasil menggunakan software MEGA 6.0. Tabel 3 menunjukkan urutan asam amino protein hasil menunjukkan hasil alignment urutan translasi kodon sampel tidak ada perbedaan nukleotida ke 1 hingga ke 150 gen normal dengan urutan asam amino normal. Mutasi penyandi protein β globin dari database gen titik pada penelitian ini tidak menunjukkan/ NCBI dengan sampel yang diteliti. Gen β mengakibatkan perubahan asam amino sama globin ekson 1 adalah urutan nukleotida ke 1 sekali karena satu asam amino dapat disandi hingga ke 142 sehingga urutan nukleotida ke lebih dari satu macam kodon yang lain, artinya 143 hingga ke 150 merupakan intron. Hasil mutasi gen ini adalah mutasi diam. NIKEN SATUTI NUR HANDAYANI, ANDIKA TRIPRAMUDYA ONGGO Biogenesis 66 Tabel 3. Alignment sekuens Nukleotida urutan ke 1 hingga ke 150 dari gen normal β globin ekson 1dari database NCBI dan sekuens gen β globin ekson 1 dari sampel Subjek Urutan Nukleotida ke 1 hingga ke 50 Penelitan 1......50 Data ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC NCBI Sampel 4 ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC Sampel ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC 14 Sampel ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC 16 Sampel ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC 17 Sampel ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC 18 Sampel ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC 19 Sampel ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC 20 Sampel ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC 21 Subjek Urutan Nukleotida ke 51 hingga ke 100 Penelitan 51......100 Data ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGG NCBI Sampel 4 ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGG Sampel ATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGG 14 Sampel ATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGG 16 Sampel ATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGG 17 Sampel ATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGG 18 Sampel ATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGG 19 Sampel ATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGG 20 Sampel ATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGG 21 Subjek Urutan Nukleotida ke 101 hingga ke 150 Penelitan 101......150 Data CAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTAT NCBI Sampel 4 CAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTAT Sampel CAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGCTAT 14 Sampel CAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGCTAT 16 Vol 2, Juni 2014 Biogenesis 67 Sampel CAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGCTAT 17 Sampel CAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGCTAT 18 Sampel CAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTAT 19 Sampel CAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGCTAT 20 Sampel CAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGCTAT 21 Tabel 4. Alignment urutan asam amino hasil translasi gen normal dari database NCBI dan urutan asam amino hasil translasi gen β ekson 1 globin sampel No. Subjek Penelitan Urutan Asam Amino ke 1 hingga ke 30 1. Hasil translasi gen normal β MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG globin ekson 1 dari NCBI 2. Sampel 4 MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG 3. Sampel 14 MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG 4. Sampel 16 MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG 5. Sampel 17 MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG 6. Sampel 18 MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG 7. Sampel 19 MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG 8. Sampel 20 MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG 9. Sampel 21 MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG PEMBAHASAN dengan gen normal, jika terdapat mutasi maka Penelitian menggunakan sampel yang akan terlihat dengan mudah perbedaan telah diuji hematologis dan uji PCR-SSCP oleh nukleotida yang terjadi. Priyambodo pada 2014 (Tabel 1). Pembawa Sekuens yang diambil dari database sifat thalassemia dapat dilihat dengan NCBI gen normal Human Β globin kromosom parameter hematologis meliputi pengecekkan 11 (Gambar 2), menunjukkan bahwa MCV (Mean Corpuscular Volume), MCH nukleotida nomor 1 hingga ke 142 akan (Mean Corpuscular Hemoglobin), GDT ditranslasikan menjadi mRNA untuk ekson 1 (Gambaran Darah Tepi) dan HPLC (High- dari β globin. Nukleotida ke 273 hingga ke 495 Performance Liquid Chromatography). akan ditranslasikan menjadi mRNA untuk (Hoffbrand et al., 2006). ekson 2 dari β globin, sedangkan nukleotida Pada Tabel 1 diketahui bahwa seluruh 1346 hingga nukleotida ke 1606 akan sampel yang digunakan dalam penelitian ini ditranslasikan menjadi mRNA untuk ekson 3. memiliki mutasi di gen β globin region 1 dan Di luar dari daerah tersebut adalah intron. juga memiliki kondisi hematologis yang Secara umum intron biasanya mempunyai positif pembawa sifat thalassemia. Penelitian repeat sequences untuk melindungi ekson dari ini fokus mengidentifikasi mutasi spesifik mutasi. Database tersebut terdapat Coding nukleotida pada gen β globin ekson 1 yang Sequences (CDS) yang identik untuk tercangkup dalam region 1. Gen yang mengkode kodon protein, yaitu nukleotida ke menyandi protein β globin tersusun dari 3 51 hingga ke 142 untuk ekson 1 (pada bagian ekson pokok dalam 3 region yang berbeda dan yang diblok dengan warna abu-abu), dipisahkan oleh intron. Pada penelitian nukleotida 273 hingga ke 495 untuk translasi dilakukan alignment yaitu penjajaran basa- ekson 2 dan nukleotida ke 1346 hingga ke basa nukleotida yg telah terbaca dari hasil 1474 untuk ekson 3. Penelitian ini difokuskan sekuensing dengan gen β globin normal dari pada ekson 1 sehingga hanya data sekuens dari database gen NCBI. Saat dibandingkan nukleotida ekson 1 yang digunakan. NIKEN SATUTI NUR HANDAYANI, ANDIKA TRIPRAMUDYA ONGGO Biogenesis 68 kasus dapat mengakibatkan kesalahan pada saat splicing, yang mengakibatkan kesalahan penyandian asam amino (Cao & Galanello, 2010), sehingga diduga bahwa pada penelitian ini walaupun secara in silico pada hasil sandi asam amino tidak ada perubahan, namun secara in vivo saat splicing dapat terjadi kesalahan splicing. Berikut ini adalah hasil translasi gen β globin ekson 1 normal maupun mutan di dalam penelitian: "MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGG Gambar 2. Sekuens gen normal Human Β globin EALG". Hasil translasi yang diperoleh dengan kromosom 11 dari database NCBI analisis menggunakan software MEGA 6.0 adalah bahwa alel mutan tidak menyebabkan Alignment keseluruhan dari urutan perubahan asam amino yang dikode, maka nukleotida ke 1 hingga ke 150 (Tabel 3) analisis struktur tiga dimensi tidak dilakukan. menunjukkan bahwa terdapat perbedaan Penelitian ini adalah rintisan pertama nukleotida yang terletak pada site ke 59 dan ke identifikasi mutasi gen β globin ekson 1 di 147. Perbedaan nukleotida tersebut Indonesia sehingga penelitian lanjut untuk menunjukkan adanya mutasi di ekson 1 gen β mengetahui jenis mutasi di luar ekson 1 perlu globin. Terdapat 7 sampel (sampel 14, 16, 17, dilakukan, selain itu perlu diadakan penelitian 18, 19, 20 dan 21) di penelitian ini yang lebih lanjut secara in vivo pada saat splicing memiliki mutasi pada intron gen β globin di sehingga diketahui apakah mutasi pada intron site ke 59, sedangkan mutasi pada site ke 147 gen β globin ekson 1 mengakibatkan hanya terjadi pada 6 sampel (sampel 14, 16, 17, kesalahan splicing. 18, 20 dan 21). Mutasi pada nukleotida pada site ke 59 sering ditemukan di wilayah KESIMPULAN Thailand, yang merupakan satu wilayah Asia Pada penelitian ini terjadi mutasi berjenis Tenggara bersama Indonesia (Cao & silent mutation. Perubahan nukleotida yang Galanello, 2010). terjadi di gen β globin ekson 1 adalah di Mutasi yang terjadi & teramati nukleotida ke 59 secara transisi (T berubah dipenelitian ini adalah pada nukleotida ke 59 menjadi C) serta nukleotida ke 147 secara & nukleotida ke 147 gen β globin ekson 1. transversi (G berubah menjadi C). Mutasi ini sangat spesifik berupa perubahan satu basa nukleotida. Mutasi bertipe transisi UCAPAN TERIMAKASIH terjadi pada nukleotida ke 59 dengan Ucapan terima kasih kepada: Dr. Niken perubahan T (timin) berubah menjadi C Satuti Nur Handayani, M.Sc., Dra. Rarastoeti (sitosin). Mutasi di nukleotida ke 147 berupa Pratiwi, M.Sc., Ph.D & Dr. biol. hom. Nastiti perubahan nukleotida dari G (guanin) berubah Wijayanti, M.Si., Kedua orangtua & adik saya, menjadi C (sitosin) di bagian intron. Mutasi Tanoto Foundation yang membantu pendanaan pada site nukleotida ini berupa transversi, yaitu penelitian & publikasi, YTI & POPTI yang nukleotida purin berubah menjadi nukleotida menyediakan sampel penelitan dan membantu pirimidin atau sebaliknya. Mutasi titik pada penelitian ini, serta seluruh pihak yang tidak penelitian ini tidak menunjukkan/ dapat saya sebutkan satu persatu, yang telah mengakibatkan perubahan asam amino sama membantu pelaksanaan penyusunan naskah sekali (Tabel 4), artinya mutasi gen ini adalah ini. mutasi diam (silent mutation). Satu mutasi yang lainnya terjadi di intron. Sebelum gen DAFTAR PUSTAKA ditranslasikan intron dipotong, dipisahkan dari Ansari SH and Shamsi TS. 2010. Thalassemia ekson. Perubahan pada intron pada beberapa Prevention Programme. Karachi: National Vol 2, Juni 2014 Biogenesis 69 Institute of Blood Disease and Bone Huang SZ, Zhou XD, Zhu H, Ren ZR, Zeng Marrow Transplantation. YT. 1989. Detection of β-thalassemia Cao A and Galanello R. 2010. Β-thalassemia. Mutations in Chinese Using Amplified GeneTest Review. Genetics in Medicine. DNA from Dried Blood Specimens. Hum. vol 12 (2): 1. Genet. vol 84: 129-131. Galanello R and Origa R. 2010. Β Priyambodo. 2014. Deteksi Molekular Thalassemia. Orphanet Journal of Rare Pembawa Sifat β-Thalassemia di Daerah Diseases. vol 5 (1): 1-15. Istimewa Yogyakarta [Tesis]. Hoffbrand AV, Pettit JE, Moss PAH. 2006. Yogyakarta: Program Pascasarjana Essential Haematology Fifth Edition. Fakultas Biologi Universitas Gadjah Massachusetts: Blackwell Science, Inc. Mada.