Mibi 03: Hefe-Genetik

Hefe-Genetik

• Die Vorlesung umfasst die Genetik der Hefe, einschließlich Nukleinsäuren, DNA, Genen, Transkription, Translation, dem Hefe-Genom, Centromeren und ARS-Elementen.

Nukleinsäuren

• Johannes Friedrich Miescher isolierte und identifizierte 1868 Nukleinsäuren und vermutete deren Beteiligung an der Vererbung.
• Albrecht Kossel erhielt 1910 den Nobelpreis für die chemische Zusammensetzung von Nukleinsäuren.
• Kossel isolierte und beschrieb die fünf organischen Komponenten von Nukleinsäuren: Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil.
• Kossel identifizierte auch die Aminosäure Histidin und sagte die Polypeptidstruktur von Proteinen voraus.
• Guanin wurde vor Kossel nach den Exkrementen von Seevögeln (Guano) benannt.
• Adenin wurde von Kossel so genannt, weil es aus der Bauchspeicheldrüse isoliert wurde ('adenas' auf Griechisch).
• Thymin und Cytosin wurden durch Hydrolyse aus Kälberthymus gefunden.
• Uracil wurde von Ascoli, einem Studenten von Kossel, durch die Hydrolyse von Nukleinsäuren entdeckt.
• RNA ist Ribonukleotid. Ribonukleinsäure
• DNA ist Desoxyribonukleotid. Desoxyribonukleinsäure
• Nukleosid enthält eine Base und Zucker.
• Nukleotid enthält eine Base, Zucker, Phosphat.

Phosphodiester-Bindung

• Nukleinsäuren sind Polymere aus Nukleotid-Monomeren, ähnlich wie Proteine aus Aminosäuren (Polypeptide).
• Phosphodiester-Bindungen verknüpfen Nukleotide, wobei eine Diester-Bindung zwischen dem 3'-C-Atom eines Zuckermoleküls und dem 5'-C-Atom des nächsten Zuckermoleküls entsteht.

Direktionalität

• Chemische Konventionen, wie die Nummerierung von C-Atomen in Ringstrukturen bestimmt, dass DNA oder RNA am 5'-Ende typischerweise mit einer Phosphatgruppe und am 3'-Ende mit einer freien OH-Gruppe der Ribose verbunden ist.
• Nukleinsäuren können in vivo nur vom 5'- zum 3'-Ende synthetisiert werden.
• Polymerasen beziehen die Energie für die Synthese aus Triphosphaten und befestigen das Monophosphat beim Aufbrechen der Bindung an das 3'-OH-Ende.

DNA als Träger der Erbinformation

• Streptococcus pneumoniae ist Gram-positiv und kommt als Diplococcus vor.
• Die Polysaccharidkapsel dient als Virulenzfaktor.
• Die S-Form (glatt) ist virulent, während die R-Form (rau) avirulent ist.
• In Deutschland sterben jährlich über 10.000 Menschen an Lungenentzündung durch Pneumokokken.
• Die Behandlung erfolgt erfolgreich mit Penicillin.
• Das Griffith-Experiment von 1928 demonstrierte die Transformation von Streptococcus pneumoniae.
• Avery et al. bewiesen, dass DNA der Träger genetischer Informationen ist, indem sie zeigten, dass DNA aus pathogenen Pneumokokken-Stämmen nicht-pathogene Stämme in S-Kolonien umwandeln kann.
• Oswald Avery, Colin MacLeod und Maclyn McCarty reinigten DNA, RNA und Proteine aus hitzeinaktivierten S-Stämmen, um zu bestimmen, welche Fraktion R-Stämme in S-Stämme transformieren kann.
• Die Behandlung mit DNasen inhibierte die Transformation, was beweist, dass das genetische Material DNA sein muss und nicht RNA oder Protein.
• Hershey und Chase (1952) bewiesen, dass DNA der Träger der Erbinformation ist.

Thymin und Uracil

• DNA verwendet Thymin anstelle von Uracil für Stabilität und Speicherung genetischer Informationen, da DNA anfällig für Veränderungen durch spontane chemische Prozesse ist.
• Die spontane Desaminierung von Cytosin zu Uracil in DNA geschieht etwa 100x pro Zelle/Tag im Genom.
• Wenn Uracil selbst eine Base in der DNA wäre, wären diese Ereignisse in der Zelle nicht erkennbar.
• Die Zelle würde nicht repariert werden und dies würde eine eine Vielzahl von Mutationen verursachen.
• DNA enthält A, C, G, T, während RNA A, C, G, U enthält.

Die Doppelhelix

• Erwin Chargaff entdeckte Regeln über die DNA, z. B., dass das Verhältnis von Guanin dem von Cytosin entspricht und das Verhältnis von Adenin gleich dem von Thymin ist (G=C und A=T).
• Die Mengen von GC und AT sind in den Arten unterschiedlich sind.
• Maurice Wilkins und Rosalind Franklin zeigten mit Hilfe der Röntgenkristallographie, dass sich die DNA als Helix aus einer Kette von Nukleotiden bildet.
• Purine müssen mit Pyrimidinen paaren, und Basenpaare werden nach einer 2- oder 3-fachen Wasserstoffbindung gebildet.
• Wasserstoffbrücken sind einzeln schwach und zusammen stark.
• Watson und Crick schlugen vor, dass DNA eine Doppelhelix ist, mit zwei verbundenen Phosphat-Zucker-Rückgraten und Basenpaarungen, für die sie zusammen mit Wilkins den Nobelpreis erhielten.
• Die DNA-Doppelhelix hat eine Breite von 2 nm.
• Eine Umdrehung/Periodizität beträgt = 3,4 nm, d. h. zwischen zwei Basenpaaren gibt es sind 0,34 nm vorhanden .
• Die Stränge in der DNA sind antiparallel und komplementär.
• Es gibt eine „major“ und eine „minor“ groove (Furche) entlang der Helixstruktur.

Genom

• Das größte Genom findet man in der Amoeba dubia, einem Einzeller mit 686.000 Mb, das 200x größer als das menschliche Genom und 40.000x größer als das Hefe-Genom.
• Saccaromyces cerevisiae enthält 6.417 Gene.
• Das Genom von Saccharomyces cerevisiae besteht aus 16 Chromosomen.
• Es gibt 16 Centromere und 352-ARS-Elemente.
• ARS sind „autonomously replicating sequences“.
• Bei der Pulsfeld-Geleelektrophorese werden Hefezellen eingebettet in Agarosenmatrix aufgelöst, um intakte chromosomale DNA mithilfe wechselnder elektrischer Felder nach Größe zu trennen.
• Saccharomyces cerevisiae Chromosom III wurde 1922 vollständig sequenziert.
• Die aktuelle Nomenklatur für Saccharomyces cerevisiae-Gene enthält die Angabe der Bezeichnung für die Hefe:
  • Chromosom (A-P)
  • Linke/rechte Arm des Chromosoms (L/R)
  • Die Bezeichnung für die Zählung nach dem Centromer (XXX) und die Transkriptionsrichtung (w/c).
• ARS(autonom replizierende Sequenzen. Sie enthalten eine zentrale Konsensussequenz und zusätzliche Sequenzen

ARS-Elemente

• Autonom replizierende Sequenzen ARSs der Hefe Saccharomyces cerevisiae wirken als Replikationsursprünge sowohl auf Plasmiden als auch auf den Chromosomen.
• ARSs erfordern eine Core Consensus Sequenz und auch zusätzliche Sequenzen 3' des T-reichen Strangs der Consensus Sequenz.
• Synthetische ARS Elemente mit verschiedenen Oligonukleotiden mit Konsensussequenzen können erstellt werden
• ARS sind effizient und ähneln den natürlichen ARS.
• ECC-DNA Elemente tragen ein ARS.

Plasmide als Werkzeuge

• Plasmide sind einfache extrachromosomale DNA-Elemente, die verwendet werden, um DNA-Fragmente zu klonen.
• Plasmide enthalten Selektionsmarker, wie dem Ampicillin Resistenzgen.
• Plasmide benötigen Replikationsursprünge, die die Replikation veranlassen.
• Plasmide kommen häufig mit multiplen Klonierungsstellen und dem lacZ-Gen, das für B-Glukosidase kodiert.
• Shuttle-Vektoren von Saccharomyces cerevisiae können verwendet werden, um die effiziente Manipulation von DNA in Saccharomyces cerevisiae zu ermöglichen.

Centromere

• Das Zentromer-DNA CEN3 der Hefe S. cerevisiae wurde isoliert.
• Minichromosomen mit CEN3 sind stabil in der Mitose.
• CEN3 ermöglicht es dass Minichromosomen vererbt werden, wie normale Hefechromosomen in der ersten und zweiten meiotischen Teilung.
• Ashbya gossypi ist funktionstüchtig in Holleyla.

Centromere: Struktur

• CENs in Saccharomyces cerevisiae(Punkt Zentromere) besitzen ein kleineres(125bp) Centromer. Diese entahlten CDE1, CDEII, CDEIII.

• Im Gegensatz zu den S.cerevisiae, die punktförmige Zentromere besitzen ,habe S.pombe (regionaleZentromere) mit einer größeren(350bp bis 100bp) Centromer.

• Menschliche Centromer sind 0.5~1.5 Mbp haben.

• Die Reduktion des GC-Gehalts um dieZentromere stimmtmit einem Modell überein, in welchemder GC-Gehalt mit derRekombinationsratte koreliertunddieRekombinationist umdieZentromere herum unterdrückt.

• Es ist die Zahl derCentromere = Zahl der Chromosomen.

• Zentromerannotationen tragen zur Zentromerfindung bei.

• Die Analyse der Gen-Evolution geschieht mithilfe von Zentromerannotationen

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