2025 Genetik Analiz Yöntemleri PDF

Genetik Analiz Yöntemleri Amaç; Bir hastalığın genetik bozukluğa bağlı olup olmadığını belirlemek Olası genetik bozukluğu göstererek tanısını koymak ve/veya prognozunu belirlemek Bir sonraki kuşakta tekrarlama riskini belirlemek ve tekrarlamaması için önlem almak Genetik bilgi hücrede farklı za...

Genetik Analiz Yöntemleri Amaç; Bir hastalığın genetik bozukluğa bağlı olup olmadığını belirlemek Olası genetik bozukluğu göstererek tanısını koymak ve/veya prognozunu belirlemek Bir sonraki kuşakta tekrarlama riskini belirlemek ve tekrarlamaması için önlem almak Genetik bilgi hücrede farklı zamanlarda farklı şekillerde ve farklı yerlerde bulunur. KROMOZOM BOZUKLUKLARI TEK GEN BOZUKLUKLARI POLİGENİK BOZUKLUKLAR MİTOKONDRİYEL DNA BOZUKLUKLARI SOMATİK HÜCRE GENETİK HASTALIKLARI  1. GENETİK DANIŞMA AİLE HİKAYESİ, PEDİGRİ ANALİZİ YÖNTEM SEÇİMİ Hastanın yazılı onayının alınması!! 2. TANI KLASİK VE MOLEKÜLER SİTOGENETİK YÖNTEMLER  MOLEKÜLER GENETİK YÖNTEMLER 3. GENETİK DANIŞMA SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ VE ÖNERİLER Pedigri; bir ailenin bütün kuşaklarının gösterildiği şematik bir analiz yöntemidir. *genetik özelliklerin hastalık oluşumuna etkisi *kalıtım tipinin belirlenmesi *aktarılma olasılığının değerlendirilmesi * Sitogenetik Tanı Yöntemleri Sitogenetik: Fenotiplerle kromozomal anormalilerini eşleştiren bilim dalı. * Kromozomlar sayı ve yapılarına göre incelenir. SİTOGENETİK ÇALIŞMA ENDİKASYONLARI A. Postnatal endikasyonlar B. Prenatal endikasyonlar POSTNATAL TANI ENDİKASYONLARI 1. Erken dönemde büyüme ve gelişme bozuklukları  Gelişme geriliği, boy kısalığı  Dismorfik yüz görünümü  Çok sayıda malformasyon  Belirsiz (Ambigius) genitalya  Mental motor retardasyon Tek neden veya birden fazla neden bir arada olabilir. 2. Ölü doğum ve neonatal ölüm Nedeni belirlemek ve kromozom bozukluğunu dışlamak için yapılmalıdır. POSTNATAL TANI ENDİKASYONLARI 3. Fertilite problemleri  Amenore  prematür menopoz  İnfertilite  Tekrarlayan gebelik kayıpları 4. Aile öyküsü Yakın akrabaların birinde bilinen kromozom bozukluğu veya şüphesi. 5. Neoplaziler Tanısal ve prognostik bilgi sağlar. PRENATAL TANI ENDİKASYONLARI 1. İleri anne yaşı (en sık) 2. Önceki çocukta kromozom bozukluğu 3. Anne- babada kromozomal translokasyon ya da diğer yapısal ve sayısal bozukluklar 4. Etiyolojisi bilinmeyen mental retardasyon ve/ veya konjenital malformasyon öyküsü PRENATAL TANI ENDİKASYONLARI 5. Reprodüktif öyküde 2 veya daha fazla spontan abortus ve ölü doğumlar 6. Ultrasonografik taramada anomali saptanması 7. Yüksek maternal tarama testi 8. Sosyal endikasyon Sitogenetik analiz için hazırlanan kromozomlar bölünen hücrelerden elde edilirler. Kemik iliği, testis, korionik villus, neoplazi gibi bazı dokulardan direkt elde edilebileceği gibi cilt, kan, amniotik sıvı gibi diğer canlı dokulardan uzun süreli kültürler yoluyla da elde edilebilirler. KROMOZOM BOYAMA (bantlama) YÖNTEMLERİ Rutin uygulananlar: Giemsa Bantlama Yöntemi (G-bantlama) Yüksek rezolusyon bantlama Floresan Bantlama Yöntemi (Q- bantlama) Revers Bantlama Yöntemi (R- bantlama) C- bantlama Özel durumlar için kullanılanlar: Nükleolar Oluşum Bölgesi (NOR) Bantlama Yöntemi Kardeş Kromatin Bantlama Yöntemi (SCE) Frajil bölge tespiti Giemsa Tripsin bantlama yöntemi, GTG : Sitogenetik laboratuvarlarında en sık kullanılan yöntemdir. 10 Mb (1Mb= 1.000.000 baz çifti) farklılıklar Kromozomların elde edilen bant özellikleri hem fonksiyonel hem de yapısal kompozisyonu yansıtmaktadır. Koyu bantlar A+T bazlarınca zengindir, içerdikleri aktif gen sayısı azdır. Açık renk bantlar G+T zengin, korunmuş genler bulunur. Floresans bandlama yöntemi (Q bantlama): Quinacrine mustard/Quinacrine dihydrochloride gibi floresan veren boyalar kullanılarak yapılan bantlama. Parlak ve soluk bantlar elde edilir. Parlak bantlar G bantlamadaki koyu renk bandlara, soluk bandlar açık renk bantlara karşılık gelir. 1, 9 ve 16 no’lu kromozomların sentromer bölgelerinde ve Y kromozomunda farklılıklar gözlenebilir. Trizomilerde fazladan bulunan kromozomun parental orijininin tespit edilmesinde kullanılır. Revers bantlama yöntemi (R-Bantlama): G bantlamadaki koyu renk bandlar açık, açık renk bantlar koyu renkte boyanır. G bantlamanın negatifi gibidir. G ve Q bandlamada soluk olarak boyanan telomerik bölgelerin koyu olarak boyanmasına imkan tanır. Kromozomların uç kısımlarını kapsayan anomalilerin değerlendirilmesinde kullanılır. C- bantlama: Tüm kromozomlardaki heterokromatin bölgeleri koyu renkte boyanır, ökromatin bölgeleri açık renkli olarak kalır. Bu yöntemle heterokromatin bölgelerindeki miktar ve yer değişiklikleri, kromozom polimorfizmleri belirlenmiş olur. NOR boyama: Gümüş nitrat ile akrosentrik kromozomların (13, 14, 15, 21 ve 22’nin kısa kolları) satellitlerinde yer alan nükleer organizer bölgeler siyah noktalar şeklinde boyanır. Bu bölgede 18S ve 28S ribozomal RNA genleri yer almaktadır. Kardeş Kromatin Bantlama Yöntemi (SCE): Mutajen veya karsinojenlerin oluşturduğu genetik harabiyetin gösterilmesinde ve kromozom kırığı sendromlarını değerlendirmek amacıyla kullanılır (örneğin; Bloom Sendromu). Genotoksik etmenler en başta sigara olmak üzere maruz kalınan kimyasal ve fiziksel ajanlar olabileceği gibi tanı ve tedavi amacıyla kullanılan ilaçlar da olabilir. Frajil bölge tespiti: Frajil bölgeler kromozomlar üzerinde yer alan, özel kültür koşulları altında bazı faktörler tarafından indüklenince gözlenen boyanmayan aralıklar (boşluklar), kırıklar, yeniden düzenlenmeler olarak görülür. Klinik olarak anlamlı olduğu gösterilmiş olan Frajil X sendromundan sorumlu olan fra Xq27.1 bölgesidir. Frajil bölgelerde kansere yol açan genlerin yerleştiği gösterilmiştir. Karyotipleme; kromozomların yapısal olarak incelenmesi, anomalilerinin belirlenebilmesi için yapılan işlemdir. Günümüzde bu işlem özel bilgisayar programları yardımı ile daha kolay ve kısa sürede yapılabilir hale gelmiştir. Karyotiplemede kromozomlar, X kromozomu hariç, büyükten küçüğe doğru homolog çiftler halinde sıralanırlar. Homolog kromozomların yanyana olması aralarındaki bant farklılıklarının daha kolay belirlenebilmesi için gereklidir. Kromozom Morfolojisi ve Sayısı Karyotip, bir birey veya türün kromozom morfolojisi, sayısı ve büyüklüğünü ifade eder. İdiogram: Kromozomların grafik olarak gösterimidir ve bir hücre içindeki ölçüm ve gözlemlere dayanır. Bir insan karyotipi Bir insan idiogramı Kromozom anomalileri başlıca 2 gruba ayrılır: - Sayısal Anomaliler - Yapısal Anomaliler Sayısal Anomaliler: Poliploidiler : Normal diploid sayının dışında, haploid sayı olan 23’ün katları şeklinde kromozom artışlarıdır. Triploidi (69), Tetraploidi (92) gibi. Hücrede bölünme hatası ya da yumurtanın multiple fertilizasyonu nedeniyle görülür. Anöploidi : Diploid sayıdaki artış ya da eksilmelerdir. Hücre bölünmesi sırasında ayrılamama veya kromozom kayıpları nedeniyle ortaya çıkar. - Trizomiler (Down Sendromu, Patau Sendromu, Edwards Sendromu) - Monozomi X (Turner Sendromu) - Klinefelter Sendromu (XXY) - XYY, Triple X, Tetra X, Penta X Sendromu gibi örnekler verilebilir. Yapısal Anomaliler: - Translokasyonlar - Delesyonlar - İnversiyonlar - İzokromozom - Ring kromozom 44 + XY İnsan Karyotip Analizi TURNER SENDROM 45 + X0 KLİNEFELTER SENDROM 47 XXY Şekil 6: Robertsonian translokasyon taşıyıcısına ait bir karyotip görüntüsü: 45XY,der (13;14)(q10;q10)(A). Resiprokal translokasyon taşıyıcısına ait karyotip görüntüsü: 46,XY, t(7;13)(q22;q12)(B) ( Görüntüler İstanbul Memorial Hastanesi, Tüp Bebek ve Genetik Laboratuvarından alınmıştır). DOWN SENDROM DOWN SENDROMU Down sendromu, Trizomi 21 ya da Mongolizm; genetik düzensizlik sonucu fazladan bir kromozomun bulunması durumu (47 kromozom) ve bunun sonucu olarak ortaya çıkan tabloya verilen isimdir. Down sendromu sık sık zihinsel kavramadaki bozukluklar ve fiziksel gelişimin tipik yüz görünümü gibi farklı olmasıyla ilişkilendirilir. Down sendromu gebelik sırasında ya da doğumda tanımlanabilen bir rahatsızlıktır. Down sendromuna her 800 ile 1000 doğumda 1 oranında rastlanır; istatistikler anne yaşının artışıyla bu oranın yükseldiğini göstermiştir, diğer etkenlerin payı küçüktür. Down sendromunda: * el ayasında çift yerine tek derin olarak bulunan avuç içi çizgisi, *epikantik katlanmanın neden olduğu badem biçimli göz, * palebral yarık, çekilmiş kısa dudaklar, *düşük kas tonusu, * ayak baş parmağıyla ikinci parmak arası daha büyük bir boşluk ve sarkık dil morfolojisi vardır. Down sendromunun sağlığa getirdiği sorunların başında: - konjenital kalp yetmezliği riskleri, - gastroözafagal reflü hastalığı, - tekrarlayan kulak enfeksiyonları, - obstürktüf uyku apnesi - tiroid bozuklukları sayılabilir. MOLEKÜLER SİTOGENETİK YÖNTEMLER 1. İN SİTU HİBRİDİZASYON (FISH) 2. FLOW SİTOMETRİ 3. KARŞILAŞTIRMALI GENOMİK HİBRİDİZASYON(CGH) 4. ARRAY CGH İN SİTU HİBRİDİZASYON (FISH) Bu teknolojide ilk aşama; floresan özelliği taşıyan bir kimyasalın spesifik DNA dizilerini tanıyabilecek bir molekülle bağlanmasıdır. Bu işaretli moleküle prob denir. Kromozomlar, probun kromozomun üzerinde aranan DNA dizisine bağlanmasına izin verilecek şekilde hazırlanırlar. Bu işleme hibridizasyon denir. Kromozoma bağlı olan işaretli DNA probu kromozomlar UV ışığa maruz bırakıldıklarında ışıma yaparlar. Eğer probda floresan ışıma olursa gen mevcuttur, floresan ışıma yok ise delesyona uğramıştır. FLOW SİTOMETRİ Flow sitometri ile kromozomların analizi için iki lazerli floresan-aktive edici hücre sayac› “Fluorescent-Activated Cell Sorter (FACS)” kullanılır. KARŞILAŞTIRMALI GENOMİK HİBRİDİZASYON(CGH) FISH’ den farklı olarak sağlıklı bireylerin metafaz kromozomları üzerine normal ve hasta bireyin hücrelerinden hazırlanan DNA probları kullanılarak hibridizasyon yapılmaktadır. Bir kaç baz çiftinden 10 Mb’ a kadar DNA parça kayıp ve /veya kazanımlarını saptayabilir. Uygulama sonucu elde edilen floresan görüntüleri mikroskopla değerlendirilemediği için görüntüler uygun kamera sistemi ile bilgisayarlara aktarılır. CGH yazılımları ile histogramda normale karşılık hasta hücresinin DNA kayıp ve /veya kazanımları değerlendirilir. Aynı anda tüm kromozomları inceleyebilir. Delesyon, amplifikasyon gibi dengesiz yapısal anormallikleri saptar. Dengeli yapısal bozuklukları ve mozaikliği saptayamaz. ARRAY CGH Klasik CGH den farklı olarak cam preparat üzerine yerleştirilmiş DNA parçaları (oligonükleotitler) ile hibridizasyon yapılır. ** Kanser sitogenetiği - Dengeli yapısal kromozom bozukluklarını saptayamaz - Düşük oranlı mozaikliği saptayamaz - Pahalı  MOLEKÜLER GENETİK YÖNTEMLER DNA ve RNA molekülünün temel yapısı üzerindeki değişikliklerle veya bu yapının kendisiyle ilgilenir.  Tek gen hastalıkları  Mitokondriyel hastalıklar  Üçlü Baz Tekrar hastalıkları  Genomik yapıya ait polimorfizmler (SNP,VNTR,CNV) Metilasyon profilleri İfadelenme analizleri  DNA (Gen mutasyonları ve polimorfizmleri) Hibridizasyona dayalı yöntemler SOUTHERN BLOTLAMA Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) MUTASYON ANALİZLERİ Mikrodizilim (DNA çip) RNA (Transkripsiyon izleme yöntemleri) Hibridizasyona dayalı yöntemler NORTHERN BLOT “Reverse Transkriptaz” RT-PCR Mikroçip Genomik DNA, çekirdekli hücreler içeren herhangi bir insan doku örneğinden ya da 10ml kadar venöz kandaki lenfositlerden kolayca elde edilebilir. Ayrıca postmortem doku parçaları steril kuru bir tüpe alınarak sıvı azot içersinde aniden dondurulur ve DNA elde etmek üzere -80C de saklanabilir. Blastomer, saç teli, sperm gibi tek hücrelerden, veya kurumuş kan örneği gibi az miktarda hücreden de DNA eldesi mümkündür. DNA eldesi için alınan kan ve ki örnekleri EDTA lı tüpe konularak laboratuvara iletilmelidir. Elde edilen DNA miktarının belirlenmesi için spektrofotometre veya jel elektroforez kullanılabilir. Böylece DNA eldesinin başarılı olup olmadığı ve DNA kalitesi belirlenir. 260nm / 280nm : 1.8- 2.0 ise DNA da protein kontaminasyonu yoktur ve miktar olarak yeterlidir. RESTRİKSİYON ENDONÜKLEAZLAR Bakteriden elde edilen bu enzimler, DNA yı 4-6 baz uzunluğunda özgül nükleotid dizilerinden tanıma ve kesme yeteneğine sahiptir. Bu enzimlerinin bulunması ile DNA dizi analizleri yapılabilmiştir. Enzimle kesim sonrasında elde edilen DNA parçalarına restriksiyon parçaları adı verilmektedir. Aynı DNA molekülü, belirli bir enzim kullanılarak kesildiğinde her zaman aynı büyüklükte restriksiyon parçaları elde edilir. Kesilen DNA parçalarının büyüklükleri birbirinden farklı olduğu için agaroz jel elektroforezi kullanılarak birbirlerinden ayırt edilmeleri mümkün olabilmektedir. Southern Blot Genomik DNA nın bir veya daha fazla restriksiyon enzimi ile kesimi Agaroz jel elektroforezi ile büyüklüklerine göre ayrımı DNA’nın nitro sellüloz membrana aktarılması, işaretli(radyoaktif maddelerle) probla hibridizasyonu, membranın yüksek ısıda kurutulması ve DNA bantlarının immobilizasyonu en son aşamada otoradyografi ile görüntüleme şeklindedir. DNA parçaları arasında büyüklük farkı nedenleri; 50-100 baz çiftlik insersiyon veya delesyon benzeri herhangi bir genomik yeniden düzenlenme Restriksiyon kesim noktasında oluşabilecek tek bir baz değişimi sonucunda kesim noktasının ortadan kalkması Mutasyonla yeni bir kesim noktası oluşumu Tanı: Elektroforezle elde edilen bantlar, normalleriyle karşılaştırılarak mutasyonlar saptanır.  Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); 1985 Kary Mullis DNA replikasyonu in-vitro koşullarda yapılır DNA çift zinciri yüksek ısı (95 C) ile birbirinden ayrılır (denaturasyon), sentetik oligonükleotidler hedef DNA’ya bağlanır 55-60C (hibridizasyon) ve zincir uzar (polimerizasyon, çift iplikli DNA sentezi) 72-76 C Denaturasyon, hibridizasyon ve DNA sentezi bir siklusu oluşturur.  PCR KULLANIM ALANLARI 1. Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcı ve hastanın tanısı 2. Restriksiyon parçalarının uzunluk polimorfizmi 3. Prenatal /Preimplantasyon(PGD) genetik tanı 4. Adli tıp (DNA parmak izi) 5. Onkogenezis 6. Prob sentezi, klonlama ve gen ekspresyonu 7. DNA dizi analizi Genin varlığını ya da yokluğunu gösterebilir Nokta mutasyonları, üçlü tekrar artışlarını tanır Gen delesyon veya insersiyonlarını tanır Gen ifadelenmesi incelenebilir Gen dozajını belirleyebilir (real time PCR) Bilinen mutasyonların tanısında kullanılabilir Aynı anda birden fazla gen incelenmesi için geliştirilmiş teknikler gereklidir. MLPA Quantitative Fluorescent PCR (QF PCR) Real Time PCR (RT PCR) Quantitative Fluorescent PCR ( Q-F PCR) 13, 18, 21, X ve Y kromozomları üzerindeki mikrosatellit (değişken sayıda tandem tekrarlayan dinükleotidler, AC-GT gibi) kullanılarak allel dozajı belirlenir. Yapısal anormallikleri gösteremez Düşük oranlı mozaikliği gösteremez Tarama için kullanılır, kısa sürede ön bilgi verir. DNA dizileme (Sanger dizileme) - Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve en yaygın kullanılan dizi analiz tekniğidir. ALTIN STANDART. - Yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır. - Yöntemin temeli, DNA polimerazın dNTP (deoksiribonükleozid trifosfat) ve ddNTP (dideoksiribonükleozid trifosfat) leri de substrat olarak kullanabilmesi esasına dayanır. ddNTP 3’ hidroksil grubu içermez. YENİ NESİL DİZİLEME SİSTEMLERİ - İyon semikonduktör dizileme - Köprü PCR dizileme - Nano dizileme Mikroarray, “çip” olarak adlandırılan cam veya nitroselüloz membran gibi yüzeyler üzerine tutturulan tür ve gen spesifik probların DNA ve RNA çalışmalarında kullanıldığı teknolojidir. Bu sayede kısa sürede ve yüksek hassasiyette çip üzerine işlenmiş tüm probların floresan ışıma değerlerine göre çalışılan numuneye ait yapısal detaylar araştırılabilmektedir.  RNA eldesi Bir genin varlığını bilmek, onun fonksiyonel olduğunu göstermez fonsiyonu göstermek için transkripsiyonu incelenmelidir. DNA mRNA cDNA Taze doku örnekleri Arşiv materyali (parafin blok) Northern Blotlama İlgilenilen dokudan elde edilen mRNA lar kalıp olarak kullanılmaktadır. *mRNA agaroz jelde yürütülür *filtreye aktarılır *işaretli prob ile hibridize edillir *İlgilenilen dokuda hedef genin ifadelenip İfadelenmediği, *İfadelenme düzeyleri *Hedef gende olan/olması muhtemel mutasyonlar sonucunda oluşan mRNA daki büyüklük farklılıkları Reverse Transkriptaz-PCR & qPCR (gerçek zamanlı PCR) Western blotlama Proteinlerin membrana emdirilerek ilgilenilen proteinin radyoaktif izotopla ya da başka şekilde işaretlenmiş özel antikor yardımıyla membran üzerinde belirlenmesidir. Western blotting kompleks karışım içinden spesifik proteinin tanınması ve bu protein hakkında kalitatif ve semikantitatif veri elde edilmesinde kullanılır.