DNA Replikasyonu (2024) - Tıbbi Biyoloji

TIBBİ BİYOLOJİ DNA Replikasyonu Prof. Dr. Fatma Filiz ARI  DNA Replikasyonu neden gereklidir? Her prokaryotik canlı/ökaryotik hücre, soyunu devam ettirmek için kendine özgü genetik bilgiyi taşıyan DNA’sını özellik ve miktar olarak sabit şekilde yavru hücrelere aktarmalıdır. Ökar...

TIBBİ BİYOLOJİ DNA Replikasyonu Prof. Dr. Fatma Filiz ARI  DNA Replikasyonu neden gereklidir? Her prokaryotik canlı/ökaryotik hücre, soyunu devam ettirmek için kendine özgü genetik bilgiyi taşıyan DNA’sını özellik ve miktar olarak sabit şekilde yavru hücrelere aktarmalıdır. Ökaryotlarda somatik hücrelerin yaşam döngüsü: 1-İnterfaz (G1, S, G2) ve 2-Mitoz evrelerinden oluşur. Mitoz bölünmenin gerçekleşmesi için İnterfazın S evresinde DNA iki katına çıkartılır.  DNA’nın Kendini Eşlemesi/Replikasyon/Dublikasyon DNA çift ipliği fermuar şeklinde açılır, her bir iplik kalıp görevi görür, karşılarına tamamlayıcı iplikler sentezlenir ve şifreyi taşıyan iki yeni DNA molekülü oluşur. DNA’nın replikasyonu semi-konservatif/yarı korunumlu özellik gösterir. Replikasyon sonunda oluşan iki yeni DNA molekülünün ipliklerinden biri yeni, diğeri eskidir.  Semi-konservatif/yarı korunumlu Replikasyonun Keşfi 1958’de Matthew Meselson ve Frank Stahl E. coli bakterisinin DNA'sındaki bazları azotun radyoizotopları (N15-ağır ve N14-hafif) ile etiketleyip birkaç nesil takip ederek replikasyon olayının yarı-korunumlu olarak gerçekleştiğini belirlediler.  DNA Sentezinin-Replikasyonun Keşfi Biyokimyager Arthur Kornberg, laboratuvar ortamında (in vitro koşulda) DNA Polimeraz ve DNA Ligaz enzimlerini kullanarak DNA’nın biyolojik sentezinin nasıl gerçekleştiğini ilk kez ortaya koymuştur. 1959 Nobel Fizyoloji/Tıp Ödülü Prokaryotik ve Ökaryotik Replikasyon için -Kalıp DNA -Deoksinükleotit trifosfatlar (dNTP) -Replikasyon enzimleri -Mg++ iyonları gereklidir. Prokaryotik ve Ökaryotik replikasyonun işleyişi benzerdir 1. Replikasyon başlangıç noktalarının tayini 2. DNA çift ipliğinin çözülmesi 3. Replikasyon çatalının oluşması 4. Kalıp ipliklere komplementer yeni ipliklerin sentezlenmesi  Replikasyon orijini: Replikasyon başlangıç noktası Prokaryotlarda dairesel DNA’da bir başlangıç ve bir bitiş noktası, Ökaryotlarda lineer DNA’da çok sayıda başlangıç noktaları vardır. Başlangıç noktaları (Ori) A ve T tekrarlarından oluşur. Bu dizileri tanıyan ve "başlatıcı protein” adı verilen proteinin başlangıç noktalarına bağlanması ile replikasyonun ilk adımı atılır. Replikasyon çatalı: Kromozom üzerinde replikasyonun olduğu noktada sarmala ait zincirlerin açılmasıyla ortaya çıkan bölgedir. Önce sentezin orijin noktasında meydana gelir ve replikasyon devam ettikçe ilerler. Orijinden itibaren zıt yöne doğru ilerleyen iki replikasyon çatalı oluşur. Replikon: Replikasyonun gerçekleştiği genom birimine verilen isimdir.  Replikasyon (prokaryotik): E. coli bakterisinde dairesel kromozomda replikasyon, 245 bp uzunluğundaki oriC olarak adlandırılan tek bir orijin noktasından başlar. Replikasyon oriC’den her iki yöne doğru hareket eder. Replikasyon ilerledikçe ayrı yönlere doğru birbirlerinden uzaklaşan iki replikasyon çatalı oluşur. Çatallar tüm kromozom replike olduktan sonra ter olarak adlandırılan bitiş bölgesinde birleştiğinde kromozomların ayrılmasıyla replikasyon sona erer.  Replikasyon (ökaryotik): Daha fazla DNA içerirler (Maya hücreleri E.coli bakterisinden 4 kat fazla DNA içerir) Ökaryotik DNA Pol’ın sn’de 50 nt olan sentez hızı bakteriyal DNA polimerazlardan 20 kat daha yavaştır. * Ökaryotlarda birden çok replikasyon orijini bulunur *  E. coli’de Replikasyonda görevli moleküller DnaA proteini: OriC bölgesine bağlanan ve A-T baz tekrar dizilerindeki H-bağlarının kırılmasını sağlayarak "replikasyon baloncuğu” oluşumunu gerçekleştiren protein (ATP ile aktive edilmiş ~ 10 DnaA proteini gereklidir) DNA helikaz (DnaB): DNA çift sarmalını çözen enzim (ATP’ye ihtiyaç duymaz) Tekli DNA ipliğine bağlanan (SSB) proteinler: Açılan DNA ipliklerinin tekrar birleşmesini önleyerek replikasyon çatalının sürekliliğini sağlayan proteinler. Primaz (DnaG): DNA sentezi için gerekli olan RNA-primerlerini sentezleyen enzim RNA primeri: Kalıp DNA ipliğindeki bazlar ile eşlenen kısa RNA dizileri (~ 10 baz). DNA Polimeraz III: yeni DNA zincirini sentezleyen ana enzim DNA Polimeraz I: İşi biten RNA-primerlerini çıkartan ve yerine DNA bazları ekleyen enzim. DNA ligaz: Yeni sentezlenen iplikte kesikli noktalarda 3´-OH ve 5´-P uçlarını birleştiren enzim Topoisomeraz: DNA sarmalı açıldıkça, replikasyon çatalının önünde oluşan süper- kıvrımlı (supercoil) yapının gevşetilmesini sağlayan enzim E. coli’de Replikasyonda görevli moleküller  1968’de Reiji Okazaki ve Tsuneko Okazaki DNA zincirlerinden birinin parçalı (kesintili) olarak sentezlendiğini buldular. Bu DNA parçalarına Okazaki fragmanları adı verildi. Leading strand (sürekli sentezlenen zincir) Lagging strand (kesintili sentezlenen zincir) Sürekli ve kesintili zincirler aynı zamanda sentezlenir  E. coli DNA polimeraz I ve III’ün özellikleri 1. Her zaman tek iplikli bir kalıp DNA’ya ihtiyaç duyarlar 2. Kalıp DNA karşısına yeni ipliğin sentezini başlatamazlar (sadece 3’-OH grubuna nükleotid bağlayabilir), ve bu nedenle ilk nükleotidi ekleyebileceği başlatıcı bir dizi (primer) gereklidir. 3. Sentezi her zaman 5′  3′ yönünde gerçekleştirirler (5'  3' zincir uzatma/POLİMERİZASYON aktivitesi) 4. Sentez sırasında: yanlış eklenen nükleotid olduğunda durup bunu düzeltirler (3'  5' ekzonükleaz/ANINDA DÜZELTME aktivitesi)  5'  3' POLİMERİZASYON aktivitesi Ve 3'  5’ ANINDA DÜZELTME aktivitesi E. coli DNA polimeraz I DNA Pol I ayrıca işi biten RNA primerlerini uzaklaştırıcı 5'  3' ekzonükleaz aktivitesine sahiptir. Bu aktiviteyi A- RNA nükleotidlerini çıkarmada kullanır ve sonra çıkarılanların yerini DNA nükleotidleri ile doldurur. B- Sentez tamamlandığında hala yanlış eklenmiş nükleotid kalmış ise bunları da çıkarıp zinciri onarır (5'  3' SONRADAN ONARMA aktivitesi) Replikasyonun özeti Replikasyonun ilerleyişi  Ökaryotik DNA polimerazlar Ökaryotlarda RNA primerinin çıkartılması Rnaz H ve flap-endonükleaz-1 (FEN1) enzimleri tarafından gerçekleştirilir.  Ökaryot ve Prokaryot replikasyonundaki farklılıklar - Ökaryotlarda okazaki fragmanlarının uzunluğu 100-200 nt, prokaryotlarda ise 1000-2000 nt’dir. - Ökaryotlarda DNA polimeraz enzimi çeşidi ve sayısı prokaryotlardan çok daha fazladır. Prokaryot hücrede DNA polimeraz III ~15 kopya, ökaryotik hücrelerde DNA polimeraz α (alfa) ~50.000 kopya. - Ökaryotlarda replikasyon binlerce orijin noktasından başlarken, prokaryotlarda tek bir orijin noktasından başlar. - Replikasyon süresi: İnsan embriyonik hücrelerde 30 dk ve somatik hücrelerde 8 saatte, prokaryotlarda yaklaşık 20 dk. - Ökaryotların doğrusal/lineer kromozomlarında uç-replikasyon sorunu, prokaryot kromozomları dairesel olduğu için yaşanmaz.  Ökaryotlarda uç replikasyonu sorunu Her replikasyonda lineer DNA’nın uç kısmında 10-15 nt’lik kayıp/kısalma olur. Çünkü; kesintili ipliğin sonundaki primer çıkartıldığında uçtaki boşluğu herhangi bir DNA polimeraz dolduramaz. Telomer (telos=son, meros=kısım) Embriyonik dönemde, Telomeraz enzimi tarafından DNA uçlarına eklenen Telomer dizileri bölünmeler esnasında kromozomların uçlarını: -Fiziksel kırılmalardan korur, -Kromozom füzyonu engeller -DNA’nın gen kodlayan dizilerinden kısalmayı geciktirir. * İnsan somatik hücrelerinde baskılanmış * Bir çok kanser hücresinde yeniden aktif Elizabeth Blackburn Telomer ve Telomeraz enzimi keşfi 2009 Nobel Fizyoloji/Tıp Ödülü Telomeraz aktivitesi Somatik hücre kromozomları başlangıçta binlerce telomer tekrarları taşır. Her bölünmede telomerden bir kısmı kısalır (25-200 nt). Belli bir noktaya gelindiğinde ise bölünme durur. Bu mekanizma somatik hücrelerde –bölünme kontrolü- gibi çalışır ve anormal bölünmelere –Kansere- karşı korunmayı sağlar. Telomer kaybı: -Hücre yaşlanması -doku yenilenmesinde azalma -dokularda yapı ve fonksiyon kaybı ile doğrudan ilişkilidir. Telomeraz hayati öneme sahip, tüm fonksiyonları henüz bilinmeyen bir enzimdir ve bir çok hastalık için yeni terapötik hedeftir DNA replikasyon hatalarını onaran enzimlerin eksikliği/mutasyonundan kaynaklanan hastalıklar Herediter Non-Polipozis Kolorektal Kanser (HNPCC) ( Lynch syndrome) Kalıtsal özellikteki HNPCC hastalarında DNA replikasyonu onarımında rol alan enzimler mutasyona uğradığı için yanlış eşleşen bazlar sonradan onarılamaz ve hastalık ortaya çıkar. Kseroderma pigmentozum DNA’da mutasyon birikmesi ile gelişen Otozomal Resesif genetik hastalıktır. Moleküler mekanizmasında, bozuk eksizyon (kesip-çıkarma) enzimi veya bozuk helikaz enzimi olduğu tespit edilmiştir. Kişilerde güneşe aşırı hassasiyet, UV den etkilenen bölgelerde çeşitli deri kanserlerinin oluşumu gözlenir. Doktor Aziz Sancar Bakteri ve insanlarda hasarlı DNA'ların onarım mekanizmalarının keşfi 2015 Nobel Kimya Ödülü alan ilk Türk bilim insanı  REPLİKASYON HATALARININ ONARIMI- 1 3'  5' NÜKLEOTİD ÇIKARMA ile ANINDA DÜZELTME (proof-reading activity)  REPLİKASYON HATALARININ ONARIMI- 2 5'  3' NÜKLEOTİD ÇIKARMA ile SONRADAN ONARMA (Mismatch repair activity) Replikasyon için internet siteleri https://www.youtube.com/watch?v=xvPELLjt1SI https://www.youtube.com/watch?v=4bjerYxOTbU https//www.youtube.com/watch?v=dKubylRiN84 https://evrimagaci.org/dna-nasil-kopyalanir-dna-replikasyonu-asamalari- nelerdir-13694