Genetik Analiz Yöntemleri

Genetik Analiz Yöntemleri

• Amaç:
  • Bir hastalığın genetik bozukluğa bağlı olup olmadığını belirlemek.
  • Olası genetik bozukluğu teşhis etmek ve/veya prognozu belirlemek.
  • Bir sonraki kuşakta tekrarlama riskini belirlemek ve tekrarlamasını önlemek için önlemler almak.

Genetik Bilgi

• Genetik bilgi hücrede farklı zamanlarda farklı şekillerde ve farklı yerlerde bulunur.
• Gen yapısı ekson ve intronlardan oluşur.

Genetik Bozukluk Çeşitleri

• Kromozom bozuklukları
• Tek gen bozuklukları
• Poligenik bozukluklar
• Mitokondriyal DNA bozuklukları
• Somatik hücre genetik hastalıkları

Genetik Danışma

• Aile öyküsü ve pedigree analizi
• Analiz yöntemi seçimi
• Hastanın yazılı onayı

Tanı

• Klasik ve moleküler sitojenik yöntemler
• Moleküler genetik yöntemler

Genetik Danışma Sonucu

• Sonuçların değerlendirilmesi ve öneriler

Pedigree

• Bir ailenin tüm kuşaklarını gösteren şematik bir analiz yöntemidir.
• Genetik özelliklerin hastalık oluşumuna etkisi
• Kalıtım tipinin belirlenmesi
• Aktarılma olasılığının değerlendirilmesi

Sitojenik Tanı Yöntemleri

• Fenotiplerle kromozomal anormallikleri eşleştiren bilim dalıdır.
• Kromozomlar sayı ve yapılarına göre incelenir.
• Prenatal ve postnatal endikasyonları içerir.

Postnatal Tanı Endikasyonları

• Erken dönem büyüme ve gelişme bozuklukları (gelişme geriliği, boy kısalığı, dismorfik yüz görünümü, çok sayıda malformasyon, belirsiz genitalya, mental motor retardasyon)
• Ölü doğum ve neonatal ölüm
• Fertilite problemleri (amenore, prematür menopoz, infertilite, tekrarlayan gebelik kayıpları)
• Aile öyküsü (yakın akrabalarda bilinen kromozom bozukluğu veya şüphesi)
• Neoplaziler (yeni doku oluşumu)

Prenatal Tanı Endikasyonları

• İleri anne yaşı
• Önceki çocukta kromozom bozukluğu
• Anne veya babada kromozomal translokasyon ya da diğer yapısal ve sayısal bozukluklar
• Etiyolojisi bilinmeyen mental retardasyon ve/veya konjenital malformasyon öyküsü
• Reproduktif öyküde iki veya daha fazla spontan abortus ve ölü doğum
• Ultrasonografik taramada anomali saptanması
• Yüksek maternal tarama testi
• Sosyal endikasyonlar

Kromozom Boyama Yöntemleri

• Rutin yöntemler (Giemsa, Yüksek rezolusyon, Floresan, Revers, C-bantlama)
• Özel durumlar için kullanılanlar (Nükleolar Oluşum Bölgesi, Kardeş Kromatin, Frajil bölge)

Giemsa Tripspin Bantlama Yöntemi (GTG)

• Sitogenetik laboratuvarlarında en sık kullanılan yöntemdir.
• Kromozomların elde edilen bant özellikleri hem fonksiyonel hem de yapısal kompozisyonu yansıtmaktadır.
• Koyu bantlar A+T bazlarınca zengindir.
• Açık renkli bantlar G+T zengin, korunmuş genler içerir.

Floresan Bantlama Yöntemi (Q-bantlama)

• Floresan boyarlar kullanılarak yapılan bantlama yöntemidir.
• Parlak ve soluk bantlar elde edilir.
• Parlak bantlar G bantlamadaki koyu renkli bandlara, soluk bantlar açık renkli bantlara karşılık gelir.
• Kromozomların sentromer bölgelerinde ve Y kromozomunda farklılıklar gözlenebilir
• Trizomilerde fazladan bulunan kromozomun parental orijininin belirlenmesinde kullanılır.

Revers Bantlama Yöntemi (R-bantlama)

• G bantlamanın negatifidir.
• G bantlamadaki koyu renkli bandlar açık renkte boyanır, açık renkli bandlar koyu renkte boyanır.
• Kromozomların uç kısımlarını kapsayan anomalilerin değerlendirilmesinde kullanılır.

C-bantlama

• Tüm kromozomlardaki heterokromatin bölgeleri koyu renkte boyanır.
• Ökromatin bölgeleri açık renkli olarak kalır.
• Bu yöntemle heterokromatin bölgelerindeki miktar ve yer değişiklikleri ile kromozom polimorfizmleri belirlenmiş olur.

NOR Boyama

• Gümüş nitrat ile akrosentrik kromozomların (13, 14, 15, 21, 22) kısa kolları, satellitlerinde yer alan nükleer organizer bölgeleri siyah noktalar şeklinde boyanır.
• 18S ve 28S ribozomal RNA genleri yer almaktadır.

Kardeş Kromatin Bantlama Yöntemi (SCE)

• Mutajen veya karsinojenlerin neden olduğu genetik harabiyetin gösterilmesinde ve kromozom kırığı sendromlarını değerlendirmek amacıyla kullanılır.
• Genotoksik etmenler (ör. Sigara, kimyasal ve fiziksel ajanlar, ilaçlar)

Frajil Bölge Tespit:

• Özel kültür koşulları altında bazı faktörler tarafından indüklenince gözlenen kromozomlar üzerindeki boyanmayan aralıklar, kırıklar, yeniden düzenlenmeler olarak görülür.
• Klinik olarak anlamlı olan Frajil X sendromundan sorumlu fra Xq27.1 bölgesidir.
• Bu bölgelerde kansere yol açan genlerin yerleştiği görülmüştür.

Karyotipleme

• Kromozomların yapısal olarak incelenmesi, anomalilerinin belirlenebilmesi için yapılan işlemdir.
• Günümüzde özel bilgisayar programları yardımıyla daha kolay ve kısa sürede yapılabilir hale gelmiştir.
• Kromozomlar, X kromozomu hariç, büyükten küçüğe doğru homolog çiftler halinde sıralanır.
• Homolog kromozomların yanyana olması, aralarındaki bant farklılıklarının daha kolay belirlenebilmesi için gereklidir.

Kromozom Morfolojisi ve Sayısı

• Karyotip; bir bireyin veya türün kromozom morfolojisi, sayısı ve büyüklüğünü ifade eder.
• İdiogram, kromozomların grafik olarak gösterimidir ve bir hücre içindeki ölçüm ve gözlemlere dayanır.

Sayısal Anomaliler

• Poliploidiler: Normal diploid sayının dışında, haploid sayı olan 23'ün katları şeklinde kromozom artışlarıdır (tripoloidi (69), tetraploidi (92) gibi).
• Anöploidi: Diploid sayıdaki artış veya eksilmelerdir (hücre bölünmesi sırasında ayrılamama veya kromozom kayıpları nedeniyle ortaya çıkar).

Yapısal Anomaliler

• Translokasyonlar, delesyonlar, inversiyonlar, izokromozomlar, ring kromozomlar.

Moleküler Sitojenik Yöntemler

• İn Situ Hibridizasyon (FISH)
• Flow Sitometri
• Karşılaştırımalı Genomik Hibridizasyon (CGH)
• Array CGH

Moleküler Genetik Yöntemler

• Tek gen hastalıkları
• Mitokondriyal hastalıklar
• Üçlü baz tekrar hastalıkları
• Genomik yapıya ait polimorfizmler (SNP, VNTR, CNV)
• Metilasyon profilleri
• İfadelenme analizleri
• DNA dizileme (Sanger dizileme)
• Yeni nesil dizileme sistemleri (İyon semikonduktör dizileme, Köprü PCR dizileme, Nano dizileme)
• Mikroarray

Southern Blot

• Genomik DNA'nın bir veya daha fazla restriksiyon enzimle kesilmesi
• Agaroz jel elektroforezi ile büyüklüklerine göre ayrımı
• DNA'nın nitrosellüloz membranda aktarılması
• İşaretli probla hibridizasyon
• Membranın yüksek ısıda kurutulması ve DNA bantlarının immobilizasyonu
• Otoradyografi ile görüntüleme

PCR ve Kullanım Alanları

• Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
• Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcı ve hastanın tanısı
• Restriksiyon parçalarının uzunluk polimorfizmi

Northern Blotlama

• İlgili dokudan elde edilen mRNA'lar kalıp olarak kullanılır.
• mRNA agaroz jelde yürütülür.
• Filtreye aktarılır.
• İşaretli prob ile hibridize edilir.
• İlgili dokuda hedef genin ifadelenip ifadelenmediği, ifadendirme düzeyleri ve olası mutasyon sonucu mRNA'daki büyüklük farklılıkları belirlenir.

Reverse Transkriptaz-PCR ve qPCR (Gerçek Zamanlı PCR)

Western Blotlama

• Proteinlerin membranda emdirilmesi
• İlgilenilen proteinin radyoaktif izotop veya özel antikorlarla işaretlenmesi
• Membran üzerinde belirlenme