Toksykometria. Badania i ocena toksyczności ostrej, podostrej, podprzewlekłej i przewlekłej. PDF

Przedmiot: TOKSYKOLOGIA Temat: Toksykometria. Badania i ocena toksyczności ostrej, podostrej, podprzewlekłej i przewlekłej. Planowanie i metodyka badań toksykologicznych w procesie rejestracji nowych leków. Rok akademicki 2024/...

Przedmiot: TOKSYKOLOGIA Temat: Toksykometria. Badania i ocena toksyczności ostrej, podostrej, podprzewlekłej i przewlekłej. Planowanie i metodyka badań toksykologicznych w procesie rejestracji nowych leków. Rok akademicki 2024/2025 Niniejsze materiały edukacyjne są chronione zgodnie z ustawą z dnia 4 lutego 1994 r. o prawie autorskim i prawach pokrewnych. Ich rozpowszechnianie i użytek inny niż do celów edukacyjnych studentów Wrocławskiego Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu jest zabroniony. Wydział: Farmaceutyczny Tytuł naukowy/zawodowy: prof. dr hab. n. farm. Kierunek: farmacja Imię, nazwisko osoby prowadzącej zajęcia: Agnieszka Piwowar Poziom studiów: jedn. mgr. Stanowisko osoby prowadzącej zajęcia: profesor Forma studiów: stacjonarne, niestacjonarne Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu Rok studiów: IV Copyright ©  TOKSYKOMETRIA badanie ilościowych zależności między stężeniem ksenobiotyku, a efektem jego toksycznego działania na organizm badanie stopnia szkodliwości poszczególnych n substancji chemicznych na organizm STAŁY  LICZBY SUBSTANCJI CHEMICZNYCH  CEL BADAŃ TOKSYKOMETRYCZNYCH ❑ CELE PODSTAWOWE: ▪ wykrycie szkodliwego/toksycznego działania danego związku ▪ jakościowa i ilościowa charakterystyka działania toksycznego związku ▪ ustalenie przyczyny zgonu  CEL BADAŃ TOKSYKOMETRYCZNYCH cd. ❑ CELE DODATKOWE: ▪ wyjaśnienie mechanizmów działania toksycznego ▪ opracowanie zasad zapobiegania zatruciom daną substancją (zabezpieczenie przy produkcji, transporcie, przechowywaniu, dystrybucji, użyciu) ▪ określenie dopuszczalnych parametrów ekspozycji człowieka i środowiska naturalnego: określenie dopuszczalnych stężeń w powietrzu w zakładach produkcyjnych, powietrzu, wodzie pitnej, żywności jeśli celowe – określenie dopuszczalnej dawki dziennej, jaką człowiek może wchłaniać bez szkody dla zdrowia ZAKRES BADAŃ TOKSYKOMETRYCZNYCH cd. ❑ badania toksykometryczne należy w szczególności wykonywać dla: ▪ leki i artykuły stosowane w medycynie (np. strzykawki, protezy) ▪ artykuły żywnościowe (dodatki) ▪ artykuły chemiczne stosowane w gospodarstwie domowym ▪ artykuły stosowane w budownictwie (np. farby, kleje, tworzywa)  ZAKRES BADAŃ TOKSYKOMETRYCZNYCH OKREŚLENIE TOKSYCZNOŚCI OCENA DZIAŁANIA UCZULAJĄCEGO OCENA DZIAŁANIA DRAŻNIĄCEGO BADANIE EFEKTÓW ODLEGŁYCH BADANIE UKIERUNKOWANYCH NARZĄDOWO DZIAŁAŃ TOKSYCZNYCH  toksyczności ostrej toksyczności podostrej toksyczności podprzewlekłej BADANIE I OCENA toksyczności przewlekłej DLA OKREŚLENIA działania mutagennego i rakotwórczego TOKSYCZNOŚCI działania teratogennego i embriotoksycznego działania drażniącego i uczulającego badanie wpływu na płodność, rozrodczość i potomstwo działania neurotoksycznego i innego narządowo swoistego  DEFINICJE ❑TOKSYCZNOŚĆ OSTRA zdolność substancji do wywołania efektu toksycznego, w tym również śmierci, po jej podaniu do organizmu w dawce jednorazowej lub w jednorazowym narażeniu w ciągu 24 godz.  szybki rozwój objawów ❑TOKSYCZNOŚĆ PODOSTRA (krótkoterminowa) zdolność substancji chemicznej do wywołania zmian w organizmie w warunkach narażenia powtarzanego codziennie w sposób przerywany lub ciągły przez okres 14, 21 lub 28 dni  objawy zatrucia są wyraźne ale nie tak gwałtowne jak w zatruciu ostrym  DEFINICJE cd. ❑TOKSYCZNOŚĆ PODPRZEWLEKŁA zdolność substancji chemicznej do wywołania efektu toksycznego u zwierząt laboratoryjnych otrzymujących badaną substancję różnymi drogami w sposób przerywany lub ciągły codziennie przez okres nie przekraczający 10% ich życia (myszy 90-dni) ❑TOKSYCZNOŚĆ PRZEWLEKŁA zdolność substancji chemicznej do wywołania efektu toksycznego u zwierząt laboratoryjnych otrzymujących badaną substancję różnymi drogami w sposób przerywany lub ciągły codziennie przez większą część ich życia (mysz -18 miesięcy, szczur - 24)  objawy po dłuższym czasie  OCENA TOKSYCZNOŚCI Reakcje Substancja w organizmie chemiczna (skutek biologiczny lub szkodliwy) Mierzalna w skali Zależna od dawki stopniowej lub stężenia (ilościowa) Metody Zależność: obliczeniowe dawka-efekt i oceny toksyczności dawka-odpowiedź  OCENA TOKSYCZNOŚCI cd. Dawka – efekt Dawka – odpowiedź ilościowa zależność zależność miedzy dawką miedzy dawką subst., subst., a liczbą lub a wielkością skutku odsetkiem osobników, biologicznego u których wystąpił obserwowanego u pojedynczego osobnika określony skutek lub u części populacji biologiczny  OCENA TOKSYCZNOŚCI cd. Ocena właściwości Ocena toksyczności ostrej fiz-chem subst. działania drażniącego, (porównanie z innymi uczulającego i inne badania związkami i danymi) Ocena toksyczności Ocena toksyczności podprzewlekłej podostrej 90 dni, powtarzane 14, 21, 28 dni dawkowanie Działania kumulacyjnego Ocena efektów odległych genotoksyczność, rakotwórczość, Ocena toksyczności embriotoksyczność, teratogenność przewlekłej w teście Wpływ na płodność, 2-letnim (lub rocznym) rozrodczość i potomstwo Ocena neurotoksyczności i innych działań ZASADY PROWADZENIA BADANIA TOKSYCZNOŚCI ❑ badania toksykometryczne przeprowadzane są: ▪ na zwierzętach ▪ w testach in vitro (względy etyczne) ▪ u ludzi – badania epidemiologiczne ❑ konieczność posiadania wyspecjalizowanych laboratoriów, personelu, zwierzętarni i aparatury badawczej ❑ metody i zakres badań ujednolicone → wytyczne do badań substancji chemicznych → OECD Organizacja Współpracy Ekonomicznej i Rozwoju (Organization for Economic Cooperation and Development) ❑ w Polsce – ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ZDROWIA (z dnia 28 lipca 2003 r.) w sprawie metod przeprowadzania badań właściwości fizykochemicznych, toksyczności i ekotoksyczności substancji i preparatów chemicznych  ZWIERZĘTA DOŚWIADCZALNE ▪ zalecane jest stosowanie dwóch różnych gatunków zwierząt, obu płci ▪ mogą być wymagane organizmy szczególnie wrażliwe na badane związki (np. jednodniowe kurczęta, kury, pstrągi, świnki morskie, chomiki); w szczególnych eksperymentach w laboratoriach wyspecjalizowanych - psy, koty, naczelne ▪ muszą to być zwierzęta zdrowe, młode, dojrzałe płciowo, o zbliżonej masie ciała (różnice ± 10%), w podobnym wieku ▪ Badania muszą być prowadzone w warunkach standaryzowanych, wymagana jest aklimatyzacja do warunków doświadczalnych (min. 5 dni)  ZWIERZĘTA DOŚWIADCZALNE cd. ▪ wymagane są stabilne warunki klimatyczne: temp. ok. 23°C, wilgotność wzgl. 30-70%, dobowy cykl sztucznego oświetlenia 12/12 godzin(światło/ciemność) ▪ droga podania/wchłaniania ma istotny wpływ na toksyczność związku  różny przebieg biotransformacji ▪ droga podania - najczęściej: - doustnie - wgłębnik (sonda, najdokładniejsza ocena dawki)  dawka jednorazowa - wymieszane z karmą lub rozpuszczone w wodzie pitnej  dawka dzienna (24 godz.). ▪ bada się również narażenie inhalacyjne oraz podanie na skórę zwierząt (metody wymagające użycia specjalnych komór toksykologicznych) TOKSYCZNOŚĆ OSTRA  OCENA TOKSYCZNOŚCI OSTREJ ▪ CEL badania: 1. określić jaka dawka substancji jest potrzebna, aby zwierzę padło 2. wyznaczyć wielkość LD50 3. określenie maksymalnej dawki tolerowanej (MDT) 4. określić jakie narządy ulegają uszkodzeniu w zatruciu ostrym 5. stwierdzić czy substancja ma działanie drażniące czy uczulające ▪ bada się zwykle na myszach i szczurach, obie płcie  OCENA TOKSYCZNOŚCI OSTREJ - OKREŚLENIE LD50 ▪ podaje się kilku grupom zwierząt (po kilka osobników - 5-10 osobników obydwu płci), różne gatunki ▪ najczęściej dożołądkowo (sonda) lub p.o., i.v., s.c. ▪ zróżnicowane dawki związku (przynajmniej 3 do 6) ▪ obserwacje prowadzi się przez co najmniej 14 dni po podaniu związku ▪ należy dokładnie rejestrować czas wystąpienia i trwania objawów działania toksycznego oraz czas padnięć (począwszy od 24 lub 48 godz.) ▪ parametrem głównym jest liczba padnięć zwierząt lub max. dawka 2 g/kg mc. ▪ przeprowadza się pomiar masy ciała (po 7 i 14 dniach), zmiany w zachowaniu, ogólne objawy kliniczne  OCENA TOKSYCZNOŚCI OSTREJ - OKREŚLENIE LD50 cd. ▪ Obserwacje kliniczne: zmiany wyglądu sierści, skóry, błon śluzowych, oczu zmiany w funkcjonowaniu układów: oddechowego, krążenia, nerwowego obserwacje aktywności somatycznej i zachowania zwierząt (np. drgawki, ślinotok, biegunka, śpiączka) ▪ po zakończeniu badań przeprowadza się sekcje wszystkich zwierząt i wykonuje badania makro- i mikroskopowe narządów ▪ dane z eksperymentu powinny być wystarczające do uzyskania krzywej dawka-odpowiedź i obliczenia wartości LD50 ▪ wartością graniczną poziomu dawkowania jest 2 g/kg mc. - należy zakończyć oświadczenia  MODYFIKACJE PROCEDUR USTALANIA TOKSYCZNOŚCI CEL: zmniejszenie liczby zwierząt, ograniczenie ich cierpień i stosowania mniejszych dawek ZASADA 3R replacement – zastępowanie badań na zwierzętach testami in vitro reduction – ograniczenie liczby zwierząt 3R refinement – udoskonalanie metod badań dla zminimalizowania cierpienia zwierząt METODY 1. metoda ustalonej dawki (FDP - Fixed Dose Procedure) 2. metoda klas toksyczności ostrej (ACT - Acute Toxic Class Method) 3. metoda skokowa (Up-down-Up) https://www.scpc.pl/files/pub1_03_2011.pdf  1. metoda ustalonej dawki (FDP) parametrem końcowym są wyraźne objawy toksyczne a nie śmierci zwierząt ! nie wyznacza się zależności dawka-efekt i nie określa LD50 ale możliwe jest ustalenie klasy toksyczności związku 2 etapy: wstępny i właściwy ▪ etap wstępny - bada się skutki 4 różnych dawek (5, 50, 500, 2000 mg/kg mc., dożoładkowo) podawane kolejno pojedynczym zwierzętom, co 24 godz. (gł. szczur, max. 5 zwierząt) pozwala na oszacowanie minimalnej dawki letalnej, obserwacja 14 dni; jeśli nastąpi zgon zwierzęcia to podaje się mniejszą dawkę ▪ etap właściwy – podaje się jedną spośród powyższych 4 dawek → powodująca objawy toksyczne ale nie zgon zwierząt (5 zwierząt jednej płci) zgon zwierząt lub wyraźne objawy toksyczne → badanie niższej dawki; brak ww. zmian→ wyższa dawka obserwacja objawów klinicznych (występowanie drgawek, ślinotoku, biegunki, letargu, senności, śpiączki)  2. metoda klas toksyczności ostrej (ATC) nie wylicza się dokładnie LD50, a jedynie zakres narażenia, w którym spodziewane są zejścia śmiertelne; daje możliwość ustalenie klasy toksyczności związku postępowanie etapowe – substancję podaje się etapowo w jednej z ustalonych 3 dawek (25, 200 lub 2000 mg/kg mc.) podanie dożołądkowe 3 zwierzętom jednej płci, obserwacja 14 dni obserwacja wyglądu zewnętrznego, objawów klinicznych zgon (przynajmniej 1 zwierzęcia) lub brak → determinuje dalsze etapy badań lub zakończenie badanie z tą samą dawką, ale na zwierzętach innej płci badanie na kolejnym wyższym lub niższym poziomie dawkowania  3. metoda skokowa umożliwia wyznaczenie krzywej zależności dawka-odpowiedź i dawka-efekt – czyli oszacowanie LD50 badanie wstępne – 1 zwierzę – 1 dawka (< niż oczekiwana dla LD50) kolejna dawka (wzrastająca lub malejąca) zależna od reakcji po podaniu poprzedniej (współczynnik 3,2 przeliczeniowy) zakończenie badań → jeśli zwiększenie dawki powoduje zgon zwierzęcia, a obniżenie przeżycie 2 etapy wstępny i właściwy: ▪ etap wstępny – test graniczny – dawka 2000 mg/kg mc. dla 1 zwierzęcia jeśli zwierzę przeżyje → podanie 4 kolejnym → zgon 2 z 5 zwierząt → LD50 > od 2000 mg/kg mc. zgon 3 z 5 zwierząt → LD50 < od 2000 mg/kg mc. → badanie główne ▪ etap właściwy – podawanie związków sekwencyjnie w ścisłe określonych dawkach, co 48 godz. – dawka początkowa na podstawie danych z baz (1,75 mg/kg mc.) dalej wzrost o współczynnik 3,2  DZIAŁANIE KUMULATYWNE  DZIAŁANIE KUMULATYWNE OCENA TOKSYCZNOŚCI Z ZASTOSOWANIEM POWTARZANYCH WYSOKICH DAWEK CEL badania: ustalenie reżimu ekspozycji w badaniach 28-dniowych ustalenie orientacyjne efektów subletalnych ocena efektów kumulatywnych, szczególnie ważnych w ocenie skutków ekspozycji przewlekłej  OKREŚLENIE WSPÓŁCZYNNIKA KUMULACJI METODA LIMA ▪ 2 grupy zwierząt (po 5 sztuk) ▪ 4 dni podaje się dawkę wynoszącą 9% LD50, następnie co 4 dni zwiększa się ją 1,5x ▪ skutkiem jest śmierć zwierząt - dawka przy której padła połowa zwierząt – toksyczność kumulatywna D Kk= LD50 DD – suma dawek – suma (d. skumulowana) dawek (d. skumulowana)po których zwierzęzwierzę po których padło padło LDLD medialna 50 - 50 dawka - medialna letalna dawka dla toksyczności letalna ostrej ostrej dla toksyczności Klasyfikacja Współczynnik kumulacji, Stopień kumulacji, Kk % Nadkumulacja 100 Silna kumulacja 1-3 100-34 Średnia kumulacja 3-5 33-20 Słaba kumulacja >5 LD50 powstaje tolerancja na preparat K-LD < LD50 preparat kumuluje się w organizmie TOKSYCZNOŚĆ PODOSTRA  BADANIE TOKSYCZNOŚCI PODOSTREJ ▪ stosowane dla substancji o spodziewanej niewielkiej toksyczności, produkowanych w małych ilościach, mających ograniczone zastosowanie → wyniki badań pomocne przy ustalaniu planu badań toksyczności podprzewlekłej ▪ badanie toksyczności dawki powtarzanej (28 dni, droga pokarmowa, dożołądkowo) ▪ częściej jako specyficzny parametr końcowy określa się zmiany neurologiczne - metoda powinna identyfikować substancje chemiczne o potencjalnym działaniu neurotoksycznym (później pogłębione badania) ▪ może być też wykorzystana do oceny zmian immunologicznych i toksyczności w stosunku do narządów rozrodczych  BADANIE TOKSYCZNOŚCI PODOSTREJ cd. ▪ podawanie dożołądkowe, w min. 3 różnych dawkach, zwykle 2 gatunki zwierząt ▪ przynajmniej 10 zwierząt (5 samców i 5 samic) – zalecanym gatunkiem jest szczur ▪ dawki powinny być tak dobrane aby jedna stanowiła poziom NOAEL, a druga LOAEL ▪ badaną substancję podaje się codziennie w zróżnicowanych dawkach kilku grupom zwierząt (jeden poziom dawkowania na grupę przez 28 dni) ▪ przez okres podawania substancji prowadzi się dokładne obserwacje ogólne zwierząt w celu uchwycenia objawów toksycznych ▪ badania kontrolne po upływie ½ czasu  BADANIE TOKSYCZNOŚCI PODOSTREJ cd. 1.Badania ogólne: ogólny stan zdrowia i zachowania zwierząt, spożycie wody i karmy (oceniane codziennie), przyrost masy ciała (raz w tygodniu), w przypadku zgonów - ustalenie ich przyczyny 2.Badania hematologiczne: hematokryt, stężenie hemoglobiny, liczba erytrocytów, leukocytów, retikulocytów i płytek krwi, czas protrombinowy 3.Badania biochemiczne krwi i tkanek: białko, glukoza, azot mocznikowy, triglicerydy, cholesterol, elektrolity, enzymy wskaźnikowe (AspAT, AlAT, alkaliczna fosfataza (też - glukuronidaza, cholinoesteraza) w surowicy krwi 4.Badania moczu: komórki nabłonka, kanalików nerkowych, krew utajona, glukoza, bilirubina 5.Badania histopatologiczne: narządy zwierząt padłych i wszystkich zwierząt uśmierconych po zakończeniu doświadczenia  TOKSYCZNOŚĆ PODPRZEWLEKŁA  OCENA TOKSYCZNOŚCI PODPRZEWLEKŁEJ ▪ CEL badania: określenie działania substancji na poszczególne narządy i układy (zwłaszcza dz. neurotoksyczne, immunologiczne i reprodukcyjne) ▪ uzyskanie informacji o narządach krytycznych ▪ uzyskanie danych na temat możliwości kumulacji substancji (powtarzana, przedłużona ekspozycja) ▪ oszacowanie dawki nieskutecznej (NOAEL) przydatnej przy doborze dawek w badaniu przewlekłym i ustalaniu kryteriów bezpieczeństwa przy narażeniu ludzi  OCENA TOKSYCZNOŚCI PODPRZEWLEKŁEJ cd. ▪ badanie zwykle na szczurach, codziennie przez 90 dni (okres dojrzewania, wzrostu, aż do dojrzałości) ▪ najczęściej podaje się w karmie lub wodzie, min. 3 grupy zwierząt, w każdej przynajmniej 20 osobników (10 samów i 10 samic) – 1 dawka dla 1 grupy ▪ dobrane dawki – najniższa nie wywołuje efektów, a najwyższa – niekorzystne zmiany stanu zdrowia i zachowań zwierząt ▪ ciągła obserwacja zwierząt podczas trwania badania ▪ ocena ogólna: spożycie karmy i wody, masa ciała, zmiany w wyglądzie i zachowaniu szczurów (wygląd sierści, ruchliwość, stan oczu, pyska, zębów, uszu, nosa) OCENA TOKSYCZNOŚCI PODPRZEWLEKŁEJ cd. ▪ wskazana jest zwłaszcza obserwacja funkcji układów oddechowego, krążenia, nerwowego ▪ badania: elektrokardiograficzne, elektroencefalograficzne, elektromiograficzne, badania przewodnictwa nerwowego ▪ po 24 godzinach po podaniu ostatniej dawki zwierzęta uśmierca się i pobiera się narządy i tkanki do badań histopatologicznych i biochemicznych ▪ wykonuje się badania hematologiczne i biochemiczne krwi, badanie moczu TOKSYCZNOŚĆ PRZEWLEKŁA  BADANIE TOKSYCZNOŚCI PRZEWLEKŁEJ CEL badania: ▪ ocena skutków długotrwałego działania substancji, na jakie człowiek jest narażany w środowisku pracy oraz środowisku naturalnym - poznanie działania toksycznego w wyniku długotrwałej ekspozycji ▪ ustalenia stężeń, przy których wielokrotne narażenie nie wywoływałoby efektów toksycznych ▪ określenie narządów krytycznych, w których substancja jest kumulowana ▪ wstępne określenie ewentualnego działania rakotwórczego badanej substancji  BADANIE TOKSYCZNOŚCI PRZEWLEKŁEJ ▪ obserwacje i badania prowadzi się jak przy ocenie toksyczności podprzewlekłej ▪ zwykle przez 2 lata (lub 12 miesięcy) – 3 grupy zwierząt, dla każdej inna dawka substancji badanej ▪ badania kontrolne laboratoryjne po 6, 12, 18 i 24 miesiącach ▪ badania anatomopatologiczne i histochemiczne – po 12 miesiącach i po zakończeniu badań ▪ wyniki pozwalają wyliczyć wszystkie parametry oceny toksyczności  BADANIE TOKSYCZNOŚCI PRZEWLEKŁEJ cd. ▪ powinno się wyznaczyć: NOAEL - najwyższy poziom niewywołujący efektów LOAEL - najniższy poziom wywołujący efekty ▪ dzięki wyznaczeniu NOAEL i LOAEL można ustalić normy ważne dla profilaktyki zdrowotnej w miejscu pracy lub środowisku naturalnym: NDS (Najwyższe Dopuszczalne Stężenie) NDSCh (Najwyższe Dopuszczalne Stężenie Chwilowe) NDD (Najwyższa Dopuszczalna Dawka) ADI (Allowable Daily Intake) – dopuszczalne dzienne pobranie z żywnością  BADANIA TOKSYCZNOŚCI PRZEWLEKŁEJ dla LEKÓW ▪ przeprowadza się zwykle bardzo późno - niekiedy nawet dopiero równolegle z pierwszymi wstępnymi badaniami klinicznymi ▪ droga i częstość podawania - zależy od postulowanych przy stosowaniu klinicznym ▪ czas trwania badania - zależy od przewidywanego okresu przyjmowania leku: dla leków przyjmowanych systematycznie czas badania: 1 - 2 lat i długotrwale (np. leki przeciwcukrzycowe) dla leków stosowanych w terapiach 3dłużej niż przewidywany czas kuracji, krótkotrwałych nie krócej jednak niż 6 tygodni dla leków stosowanych sporadycznie 4 tygodnie https://chem.pg.edu.pl/documents/175361/84965897/004b.pdf INNE BADANIA TOKSYCZNOŚCI  OCENA TOKSYCZNOŚCI SUBSTANCJI PODAWANEJ DROGĄ INHALACYJNĄ ▪ bada się toksyczność ostrą – wyznaczenie medialnego stężenia letalnego LC50 w powietrzu (w mg/m3) i toksyczność wywołaną powtarzanym dawkowaniem ▪ badanie na 3-4 grupach zwierząt (po 5 osobników obu płci) ▪ przez 4 godziny poszczególne grupy narażane są na coraz większe stężenia ksenob. tak dobrane, aby rozpiętość objawów toksycznych i padnięć umożliwiała wyliczenie LC50 ▪ badanie przerywa się, gdy zwierzęta nie padają po narażeniu na stężenie 5000 mg/m3 ▪ obserwacje prowadzi się przez 14 dni od zakończenia badania LC50 DLA SUBSTANCJI W POSTACI GAZOWEJ cd. Prawo Habera E0=Ct dla wywołania efektu letalnego E0 potrzebne jest osiągnięcie odpowiedniego iloczynu stężenia (C) i czasu ekspozycji (t) w pewnym zakresie stężeń zgon zwierzęcia można spowodować niższym stężeniem substancji w powietrzu, przedłużając czas ekspozycji  prawo Habera zgon nastąpi w momencie, gdy iloczyn (pole prostokąta C1t1 lub C2t2) osiągnie pewną stałą wartość prawo Habera spełnione jest tylko dla krótkich odstępów czasu (rzędu godzin) - później wpływ procesów biotransformacji i wydalania  OCENA TOKSYCZNOŚCI DERMALNEJ ZWIĄZKÓW ▪ LD50 związków mających zdolność przenikania przez skórę określa się po jednorazowym naskórnym ich podaniu ▪ substancje dobrze wchłaniane wykazują zbliżone wartości LD50 przy podaniu dożylnym, dootrzewnowym, podskórnym i dożołądkowym ▪ substancję nanosi się na gazę (kilka warstw) na zdepilowaną (10% powierzchni ciała), nieuszkodzoną skórę ▪ różne ilości badanej substancji aplikuje się poszczególnym grupom zwierząt (5 zwierząt tej samej płci) – ale zawsze w jednakowej objętości rozcieńczalnika  OCENA TOKSYCZNOŚCI DERMALNEJ ZWIĄZKÓW cd. ▪ ocenia się: toksyczność skórną ostrą i wywołaną powtarzanym dawkowaniem działanie drażniące lub żrące na skórę (wyniki podaje się w 3 stopniowej skali: 1 – żrące, 2 – drażniące, 3 – łagodnie drażniące) działanie uczulające działanie drażniące lub uszkadzające oko  OCENA DZIAŁANIA UCZULAJĄCEGO ▪ właściwości uczulające wynikają z określonych mechanizmów immunologicznych ▪ badanie w 2 etapach: 1. immunizacja – podanie antygenu powoduje wytworzenie przeciwciał 2. reakcja na antygen – ponowny kontakt z substancją (np. po 1-2 tyg.) uruchamia reakcję obronną → zmiany skórne (pokrzywka, rumień) ▪ badanie wykonywane jest na świnkach morskich  OCENA DZIAŁANIA UCZULAJĄCEGO cd. ▪ dwa rodzaje testów: 1. test z adjuwantem (środek pomocniczy) - działanie uczulające jest wzmagane przez wstrzyknięcie kompletnego adjuwantu Freunda (emulsja oleju parafinowego lub mineralnego z zawieszonymi w niej prątkami gruźlicy) 2. test bez adjuwantu (np. test Buchlera) ▪ w obu testach badany związek wstrzykuje się świnkom morskim podskórnie lub nanosi na skórę ▪ wyniki podaje się w 3-stopniowej skali Magnussona i Klingmana  OCENA DZIAŁANIA UCZULAJĄCEGO cd. ▪ 3-stopniowa skala Magnussona i Klingmana Reakcja Skala klasyfikacji Brak zmian 0 Rumień niejednolity lub nieciągły 1 Rumień umiarkowany i zlewny 2 Rumień intensywny i obrzęk 3  BADANIE NEUROTOKSYCZNOŚCI I INNYCHTOKSYCZNOŚCI NARZĄDOWYCH  OCENA DZIAŁANIA NEUROTOKSYCZNEGO ▪ u człowieka silnie rozwinięty układ nerwowy → szczególna wrażliwość na związki o działaniu neurotoksycznym ▪ jeśli jakaś substancja wywołuje efekty neurotoksyczne u małych zwierząt laboratoryjnych → u człowieka ich nasilenie może być znacznie większe przy tych samych poziomach ekspozycji ▪ jako miarę zaawansowania w rozwoju przyjmowano dawniej wskaźnik (w %) stosunku masy mózgu do masy ciała ▪ u lwa 0,11-0,1 ▪ u psa ok. 0,2 ▪ u goryla ok. 0,8 ▪ u człowieka ok. 2,2-2,5 ▪ u myszy jest jeszcze wyższy i wynosi 3,2 OCENA DZIAŁANIA NEUROTOKSYCZNEGO cd. ▪ obecnie stosuje się tzw. współczynnik cefalizacji (Kc), który jest potęgową funkcją masy ciała: E Kc= a m E – masa mózgu, m – masa ciała, a – wykładnik potęgowy ustalony na około 0.56 Gatunek Współczynnik cefalizacji, Kc szczur 0,07 świnia 0,14 kot 0,29 pies 0,29-0,44 nietoperz 0,67 szympans 0,74 delfin 2,25 człowiek 2,8 OCENA DZIAŁANIA NEUROTOKSYCZNEGO cd. ▪ problem etyczny z doborem zwierząt doświadczalnych do badań ▪ powinno się wykonywać badania na zwierzętach o najwyższym współczynniku cefalizacji - im wyższy współczynnik tym większe zastrzeżenia natury etycznej ▪ przenoszenie wyników na człowieka jest tym łatwiejsze, im wyższy współczynnik cefalizacji gatunku, na którym wykonano doświadczenia ▪ za najbardziej wiarygodne uznaje się wyniki uzyskane na małpach OCENA DZIAŁANIA NEUROTOKSYCZNEGO cd. ❑ Metody stosowane u zwierząt laboratoryjnych: ▪ testy behawioralne ▪ metody elektrofizjologiczne ▪ badania morfologiczne ▪ badania biochemiczne  OCENA NEUROTOKSYCZNOŚCI cd. TESTY BEHAWIORALNE 1) pomiar spontanicznej aktywności ruchowej (dostarcza informacji o ogólnym stanie zdrowia zwierzęcia) 2) badanie prostych reakcji bezwarunkowych (pozwalają ocenić reaktywność układu nerwowego, ustalić, czy zaburzenia dotyczą sfery ruchowej, czuciowej i określają, jaki rodzaj czucia jest upośledzony) 3) badanie warunkowych reakcji instrumentalnych  OCENA NEUROTOKSYCZNOŚCI cd. METODY ELEKTROFIZJOLOGICZNE ▪ rejestrują i analizują zjawiska elektryczne zachodzące w tkankach i narządach ▪ pomiar szybkości przewodzenia bodźców - służy do oceny stanu czynnościowego nerwów obwodowych ▪ technika potencjałów wywołanych - wykorzystywana do wykrywania zaburzeń czucia i lokalizowania miejsc uszkodzenia w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym ▪ badania elektroencefalograficzne (najbardziej popularne) - służą do całościowej oceny stanu czynnościowego OUN  OCENA NEUROTOKSYCZNOŚCI METODY MORFOLOGICZNE I BIOCHEMICZNE ▪ Metody morfologiczne − ocena odpowiednio przygotowanych preparataów histopatologicznych − pozwalają odpowiednio wcześnie wykryć zmiany morfologiczne tkanki nerwowej, które mogą być przyczyną zaburzeń funkcji układu nerwowego ▪ Metody biochemiczne − służą głównie do wyjaśnienia mechanizmów działania toksycznego związku na układ nerwowy, w znacznie mniejszym stopniu do wykrywania neurotoksyczności − pozwalają na wykorzystanie oznaczeń biochemicznych, histochemicznych i immunochemicznych do dokładnego umiejscowienia skutków działania ksenobiotyku  BADANIA TOKSYKOLOGICZNE NOWYCH LEKOW  badania przedkliniczne już wyselekcjonowanych kandydatów na leki ocena „gotowości” cząsteczek do badań klinicznych I fazy wsparcie dla projektów produktów gotowych pozwalające na rejestry nowych leków na rynku rodzimym i zagranicznym ocena profilu bezpieczeństwa związku – „kandydata” na lek (badania toksykologiczne; parametry ADME) wyznaczenie dawki równoważnej dla ludzi (HED) wyznaczenie maksymalnej zalecanej dawki początkowej (MRSD) u ludzi  Rodzaj badania Cel badania Podstawowe badania Ocena oddziaływania na układ sercowo-naczyniowy, oddechowy w zakresie bezpieczeństwa i ośrodkowy układ nerwowy (OUN). farmakologicznego Podstawowe badania Badania in vivo i/lub in vitro oceniające mechanizm działania/wypływ farmakodynamiki cząsteczki „kandydującej” na lek w miejscu docelowym. Dane zgromadzone podczas badań in vitro dotyczące metabolizmu Badania farmako- i wiązania białek krwi u zwierząt i ludzi. i toksykokinetyki Badania toksyczności układowej uzyskane z badań toksykologicznych. Badania toksyczności po podaniu pojedynczej dawki u dwóch gatunków Badania ostrej ssaków - mogą być przeprowadzone podczas badań określających toksyczności najwyższą tolerowaną dawkę u gatunków wykorzystanych do badań toksyczności. Różnice czasu trwania badania, wskazań terapeutycznych i zakresu Badania toksyczności po proponowanego programu klinicznego. Minimalny czas trwania to dwa podaniu wielokrotnym tygodnie dla dwóch gatunków (jeden z gatunków inny niż gryzonie). Na przykład badanie w kierunku fototoksyczności (reakcja skórna po Inne możliwe badania ekspozycji na światło) https://toolbox.eupati.eu/resources/ogolne-badania-toksycznosci/?lang=pl ▪ Działanie zgodnie z przepisami prawnymi obowiązującymi podczas wprowadzania do obrotu nowych substancji i preparatów chemicznych (np. leki, składniki kosmetyków, chemikalia stosowane w przemyśle i rolnictwie) oraz wyrobów medycznych (np. implanty i protezy) ▪ Wymagana ocena bezpieczeństwa stosowania - obejmuje m.in. ocenę toksykologiczną w modelach doświadczalnych in vivo na gryzoniach (mysz i szczur) ▪ Prowadzona zgodnie z wymogami OECD lub ISO i z zachowaniem standardów GLP  ocena wieloetapowa testy in vitro z wykorzystanie panelu linii komórkowych badania in vivo na modelach zwierzęcych → cel główny: wyznaczenie maksymalnej tolerowanej dawki właściwe badania toksykologiczne wykonane w obowiązkowym standardzie Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (GLP)  GŁÓWNY CEL: ▪ określenie profilu bezpieczeństwa u zwierząt ▪ dostarczenie niezbędnych informacji na temat: Absorpcji - sposobu dostawania się substancji do organizmu Dystrybucji substancji w organizmie Metabolizmu – przemiany substancji w organizmie Eliminacji - usuwania substancji z organizmu  JAKIE BADANIA + JAKIE GATUNKI ZWIERZĄT NIEZBĘDNE INFORMACJE ❑ Należy ocenić efekty działania: ogólnego na zwierzę na wszystkie tkanki i narządy zwierzęcia (toksyczność układowa) na zdolność zwierząt do rozrodu i normalnego rozwoju (toksyczność reprodukcyjna) na skórę lub oczy (toksyczność miejscowa) alergizującego (badania nadwrażliwości) na chromosomy i geny (badania genotoksyczności) na powstawanie nowotworów (badania kancerogenności)  JAKIE BADANIA + JAKIE GATUNKI ZWIERZĄT NIEZBĘDNE INFORMACJE ❑ Wybór gatunków zwierząt: opiera się na podobieństwach między zwierzętami a ludźmi w takich aspektach jak: farmakodynamika (bezpieczeństwo farmakologiczne) farmakokinetyka fizjologia i patofizjologia porównywanych gatunków ❑ można wykorzystać: zdrowe zwierzęta specjalne modele chorób zwierzęcych Należy wykonać wszystkie rodzaje badań toksyczności: ▪ badania toksyczności ogólnej ▪ badania toksyczności układowej - po podaniu dawki pojedynczej - po podaniu dawek wielokrotnych ▪ badania toksyczności rozrodczej i reprodukcyjnej - badania płodności samców - badania wpływu na rozrodczość i rozwój samic ▪ badania toksyczności miejscowej ▪ badania nadwrażliwości ▪ badania genotoksyczności ▪ badania kancerogenności ▪ badania w zakresie ekotoksykologii  Dziękuję za uwagę W celu uzyskania szczegółowych informacji na temat prezentowanych treści proszę o przesłanie wiadomości na adres mailowy: [email protected]