Metode Kromatografi FK3111 Analisis Obat 2 PDF

2024 Metode Kromatografi FK3111 Analisis Obat 2 FKK SF ITB Dr. apt. Tursino, S.Si., M.Si  Metode Analisis Instrumental Spektroskopi Kromatografi Elektrokimia Atom : KLT...

2024 Metode Kromatografi FK3111 Analisis Obat 2 FKK SF ITB Dr. apt. Tursino, S.Si., M.Si  Metode Analisis Instrumental Spektroskopi Kromatografi Elektrokimia Atom : KLT Potensiometri AAS KK Biamperometri FES KCKT Polarografi ICP KG Coulometri Konduktometri Molekul : dll Spek. UV-Vis Metode Lain-lain Spek. IR Spektrofluoro Polarimeter Refraktometer Analisis Kualitatif dan Kuantitatif : Electrothermal Identifikasi Autotitartor Kemurnian Turbidimetri Penentuan Kadar Nephelometri Kinerja Sediaan MS dan NMR Yang sudah dipelajari ?  Analisis Zat Aktif dalam Bahan Baku/Awal dan Sediaan Bahan baku meliputi pemeriksaan Identifikasi Kemurnian Penetapan tetapan fisika FARMAKOPE Penetapan kadar atau potensi Sediaan Farmasi meliputi pemeriksaan Identifikasi Kemurnian (bila perlu) Penetapan kadar Penetapan kinerja (disolusi, pelepasan obat dll) KCKT ? Tahap Analisis: Populasi (X) 1 - Sampling 6 – Interpretasi Hasil Sampel (senyawa X) Preparasi sampel : 2 – Penyiapan larutan  Menimbang (menimbang, melarutkan dan Kadar Analit  Melarutkan dan menyaring mengencerkan) dalam Sampel  Mengencerkan  Analit dipisahkan dari mattriks : metode pemisahan ? dll Larutan Uji 3 – Pemisahan pengganggu, 5 – Perhitungan dan derivatisasi, atau lainnya (jika Pengolahan Data perlu) Aliquot Aliquot 1 Aliquot 2 dst Data Teknik Pengukuran 4 – Pengukuran Pengukuran Klasifikasi Metode Pemisahan  Kromatografi  Suatu teknik/metode pemisahan yang pertama kali diperkenalkan oleh Mikhail Tswett (1906) yang memisahkan pigmen tumbuhan (klorofil, xantofil, dll.) melalui kolom kaca yang berisi kalsium karbonat CaCO3  Terbentuk warna-warna yang terpisah akibat proses elusi menggunakan pelarut organik yang membentuk pita-pita berwarna dalam kolom kaca.  Teknik tsb diberi nama oleh M. Tswett sebagai Kromatografi (chroma = warna, graphien = tulisan/gambaran).  Walaupun sekarang hasil pemisahannya tidak berwarna lagi (dalam bentuk bercak dan grafik) teknik pemisahan ini tetap dinamakan sebagai kromatografi.  Kromatografi dalam FI VI Teknik pemisahan kromatografi adalah metode pemisahan multi tahap dimana komponen suatu sampel didistribusikan antara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa padatan atau cairan pendukung pada suatu padatan atau gel. Fase diam dapat dikemas dalam suatu kolom, menyebar sebagai suatu lapisan, didistribusikan sebagai suatu film, atau diaplikasikan oleh teknik lain. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan atau fluida superkritikal. Proses pemisahan dapat berupa suatu adsorpsi, distribusi massa (partisi), atau pertukaran ion, atau berdasarkan perbedaan antara sifat fisika kimia suatu molekul, seperti ukuran, massa dan volume.  Kromatografi dalam FI VI Jenis-jenis kromatografi yang digunakan dalam prosedur analisis kualitatif dan kuantitatif dalam Farmakope adalah:  kromatografi kolom,  kromatografi gas,  kromatografi kertas dan  kromatografi lapis tipis (termasuk kromatografi lapis tipis kinerja tinggi/ KLTKT), serta  kromatografi cairan yang diberi tekanan atau yang biasa dikenal dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).  Istilah dalam Kromatografi  Solut atau zat terlarut yang terdistribusi di antara kedua fase  Dua fase : fase diam dan fase gerak  Fase gerak membawa serta zat terlarut melalui suatu media (dalam hal ini fase diam) hingga terpisah dari komponen lainnya, yang terelusi lebih awal atau lebih akhir  Zat terlarut dibawa serta melewati fase padat oleh aliran pelarut (fase gerak dlm bentuk cair atau gas ) disebut juga eluen atau cairan pengembang  proses elusi.  Fase diam berbentuk padat bertindak sbg penjerap (adsorben) atau bentuk cairan yang terikat pada permukaan padat (support atau matriks padat) sehingga terjadi partisi (distribusi) diantara kedua fase tersebut. Klasifikasi Kromatografi Tipe Kromatografi – Mekanisme Pemisahan  Mekanisme Pemisahan : Interaksi Hidrofobik Adsorbent bersifat hidrofob  sehingga analit-analit yang hidrofob bisa ditahan dan matriks yang hidrofil/polar tidak ditahan. Memisahkan senyawa-senyawa yang hidrofob dari yang hidrofil. Interaksi intermolekuler  Gaya Dispersi London / van der Waals  Mekanisme Pemisahan : Interaksi Ionik  Adsorbent berupa resin penukar kation / anion  memisahkan ion-ion (molekul bermuatan), analit yang berupa anion/kation ditahan (sesuai dengan resinnya), yang netral dan muatan yang tidak sesuai tidak ditahan.  Interaksi intermolekuler  Interaksi ionik Mekanisme Pemisahan : Interaksi Ionik  Mekanisme Pemisahan : Interaksi Hidrofilik  Adsorbent bersifat hidrofilik/polar  sehingga analit-analit yang hidrofil bisa ditahan dan matriks yang hidrofob/nonpolar tidak ditahan.  Memisahkan senyawa-senyawa yang hidrofil dari yang hidrofob.  Interaksi intermolekuler  Ikatan hidrogen, interaksi dipol-dipol KROMATOGRAFI CAIR SUPERKRITIK : fase gerak berupa gas pada suhu dan tekanan di atas titik kritiknya: misalnya gas CO2)  kromatografi kolom, dengan pembawa gas (berbentuk cair ?)  kromatografi cair.  Kromatografi Fase Normal vs Fase Balik o Dilihat berdasarkan kepolaran antara fase diam dengan fase gerak (kromatografi cair) : o Jika fase diam lebih polar dibanding fase gerak  KFN, sebaliknya fase diam kurang polar dibanding fase gerak  KFB. Sistem Elusi/Pengembangan : o Isokratik  komposisi/kepolaran fase gerak selama proses elusi tetap. o Gradien  komposisi/kepolaran fase gerak selama proses elusi berubah. GC : o Isotermik o Gradien Temperatur Kromatogram  Chromatogram: graph showing the detector response as a function of elution time. Retention time Non-retained solute (void volume)  Retention time (tr): the time it takes a compound to pass through a column  Retention volume (Vr): volume of mobile phase needed to push solute through the column The strength or degree with which a molecule is retained on the column can be measured using retention time or retention volume.  Kromatogram Retention time Non-retained solute (void volume) ' tr  tr  tm Rs  ( t r2  t r1 ) ( wb2  wb1 ) / 2 H  L/ N t'r 2   2 tr  tm t'r 1  tr  2  t  k'  Rs  N   1 N  16    5.55  r  w1   tm 4  wb   2  Fundamental Measures of Solute Retention  Adjusted retention time (tr’): the additional time required for a solute to travel through a column beyond the time required for non-retained solute where: tm = minimum possible time for a non-retained t'r  t r  t m solute to pass through the column  Relative Retention (): ratio of adjusted retention time between two solutes t'r 2   where: tr2’ > tr1’ , so  > 1 t'r1 - Greater the relative retention the greater the separation between two components Fundamental Measures of Solute Retention  Capacity factor (k’): tr  tm k'  tm  The longer a component is retained by the column, the greater the capacity factor - Capacity factor of a standard can be used to monitor performance of a column  Capacity factor is equivalent to: time solute spends in stationary phase Vs k'  k'  K time solute spends in mobile phase Vm where: Vs = volume of the stationary phase Vm = volume of the mobile phase K = partition coefficient Capacity factor is directly proportional to partition coefficient Efficiency of Separation  The separation of two solutes in chromatography depends both on the width of the peaks and their degree of retention  The separation between the two solutes is given by their Resolution (Rs) Efficiency of Separation  Resolution (Rs) is defined as: ( t r2  t r1 ) Rs  where: tr2,tr1 = retention times of solutes 1 and 2 (tr2 > tr1) ( wb2  wb1 ) / 2 wb2,wb1 = baseline widths of solutes 1 and 2 Or Rs  N   1 where: N = number of theoretical plates  = t2/t1 (>1) 4  Want Rs ≥ 1.5 for complete separation  Rs ≥ 1.0 usually adequate for analysis Measure of Column Efficiency  Number of Theoretical Plates (N) - Similar to number of extractions performed in an extraction separation - As N increase (number of separating steps)  greater the separation between two compounds 2  tr  2  t   5.55  r  where: wb = baseline width of peak (in time units) N  16    w1  w1/2=half-height peak width  wb   2  Measure of Column Efficiency  Height Equivalent of a Theoretical Plate (H or HETP) - The distance along the column that corresponds to one “theoretical” separation step or plate (N) H  L/ N where: L = length of column N = number of theoretical plates H  As H decreases, more separation steps per column length are possible - Results in a narrower peak width and better separation between two neighboring solutes Measure of Column Efficiency  H is affected by: i. Flow-rate of mobile phase ii. Size of support: decrease size decrease H iii. Diffusion of solute: increase diffusion  decrease H iv. Strength of retention v. Others Improved resolution by increasing column length Why Bands Spread?  Remember: Efficiency is dependent on peak width  A band of solute spreads as it travels through the column - described by a standard deviation (s)  Factors include: - Sample injection - Longitudinal diffusion - Finite equilibration between phases - Multiple flow paths - others Why Bands Spread?  Sample injection – sample is injected on the column width a finite width, which contributes to the overall broadening - Similar broadening may occur in the detector  Longitudinal diffusion – band slowly broadens as molecules diffuse from high concentration in band to regions of lower concentration Why Bands Spread?  Finite Equilibration Time Between Phases – a finite time is required to equilibrate between stationary and mobile phase at each plate - Some solute is “stuck” in stationary phase as remainder moves forward in mobile phase - Results in band broadening Distribution of solute between mobile and stationary phase Solute in mobile phase moves down column  broader peaks Why Bands Spread?  Multiple Flow Paths – As solute molecules travel through the column, some arrive at the end sooner then others simply due to the different path traveled around the support particles in the column that result in different travel distances. Molecules exit the column at Molecules enter the different times due to different column at the same time path lengths Description of Band Spread  Plate height (H) is proportional to band width - The smaller the plate height, the narrower the band Van Deemter equation: B H  A  C x x Multiple paths Longitudinal equilibration diffusion time where: x = linear flow rate A,B,C = constants for a given column and stationary phase Kromatografi Lapis Tipis  Kromatografi Lapis Tipis Mekanisme pemisahan: perbedaan kecepatan gerak dari senyawa pada fase diam karena adanya perbedaan adsorpsi/partisi ( kelarutan dalam fase gerak?). Fasa diam berupa silika, alumina atau kieselguhr (tanah diatomik) yang dilapiskan tipis pada pelat kaca/alumunium/dll Cara buatnya ? Fasa gerak berupa pelarut organik, air, buffer atau campurannya. Contoh fase diam : SILICA : SILICA GEL G (G = gypsum, bonded to support media) SILICA GEL GF 254 (F 254 = Phosphorescent/Fluorescent at 254 nm) SILICA GEL 60 (Silica Gel with diameter 60 Å)  OH OH OH OH Silika O O O O Si Si Si Si O O O O O Alumina OH OH OH O O O O Al Al Al CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH Selulosa OH O OH O OH O OH O O O O O OH OH OH OH Pembuatan Plat Ukuran lempeng 20 cm x 20 cm 10 cm x 20 cm, 3 cm x 5 cm, 1,5 cm x 5 cm  Spreader De Saga atau dioleskan dengan bantuan batang pengaduk  pastikan lempeng bersih dan bebas lemak ( ? ) Silica Gel GF 254 Visible light UV 254 nm UV 366 nm For TLC  always use G type silica Substance that contribute in fluorescent /phosporescent : Uranylacetate (yellow-green), manganese zinc silicate, zinc cadmiumsulphide, zinc silicate (green), alkaline earth metal tungstates, tin strontium phosphate (blue) Chamber untuk Proses Pengembangan DON’T use beaker glass as a chamber (WHY?) You can use a jam-jar as the chamber Glass watch To keep it saturated with solvent’s vapour WHY? Filter paper MP  UNSATURATED CHAMBER  Pengembang/Fase Gerak  Fasa gerak dapat berupa pelarut organik, air, buffer atau campurannya.  Pelarut untuk sampel  dapat digunakan fase gerak atau salah satu komponen fase gerak.  Pencampuran fase gerak didasarkan pada perbandingan volume, misalnya metanol- kloroform 1:1  1 bagian volume metanol dicampur dengan 1 bagian volume kloroform.  Polaritas fase gerak dapat diubah-ubah (khususnya yang berupa campuran)  penting untuk keberhasilan proses pemisahan Polar mana A vs B ? A  campuran metanol air (1:1) B  metanol-kloroform (1:1)  o Solvent MF Bp ( C) Hazards* Dipole Elution MW Density (g/mL) Stength () Hexane C6H14 68.7 Flammable 0.08 0.01 CH3(CH2)4CH3 86.17 0.659 Toxic Toluene C7H8 110.6 Flammable 0.31 0.22 Solvent Properties C6H5CH3 92.13 0.867 Toxic and Elution Diethyl ether C4H10O 34.6 Flammable 1.15 0.29 Strengths CH3CH2OCH2CH3 74.12 0.713 Toxic, CNS Depressant Dichloromethane CH2Cl2 39.8 Toxic, Irritant 1.14 0.32 CH2Cl2 84.94 1.326 Cancer suspect Ethyl Acetate C4H8O2 77.1 Flammable 1.88 0.45 CH3CO2CH2CH3 88.10 0.901 Irritant Acetone C3H6O 56.3 Flammable 2.69 0.43 CH3COCH3 58.08 0.790 Irritant Butanone C4H8O 80.1 Flammable 2.76 0.39 CH3CH2COCH3 72.10 0.805 Irritant 1-Butanol C4H10O 117.7 Flammable 1.75 0.47 CH3CH2CH2CH2OH 74.12 0.810 Irritant Propanol C3H8O 82.3 Flammable 1.66 0.63 CH3CH2CH2OH 60.09 0.785 Irritant Ethanol C2H6O 78.5 Flammable 1.70 0.68 CH3CH2OH 46.07 0.789 Irritant Methanol CH4O 64.7 Flammable 1.7 0.73 CH3OH 32.04 0.791 Toxic Water H2O 100.0 1.87 >1 HOH 18.02 0.998 Pelarutan Sampel dan Penotolan Bercak  Pelarut  fase gerak atau salah satu komponennya atau pelarut lain yang mudah menguap  sebelum dielusi bercark dikeringkan dulu (?)  Totolkan sampel (kapiler), jarak 2-3 cm antar bercak, 1,5-2 cm dari tepi bawah, 5-10 µl. DO NOT DRAW A LINE AT THE BOTTOM OF PLATE ( ? )  Proses Elusi (Pengembangan?)  Elusi  proses “mengalirkan/melewatkan” pelarut melewati fase diam (kolom), proses merambatnya pelarut melalui plat KLT (proses kapilaritas).  Elusi dilakukan di dalam bejana yang telah dijenuhkan dan dihentikan ketika mencapai kurang lebih dua pertiga dari tinggi lempeng dan diberi tanda.  Analit yang sifatnya lebih mirip dengan fase diam maka dia akan lebih lama tertahan (geraknya lebih lambat), sebaliknya jika sifatnya lebih mirip/mendekati fase gerak, maka akan lebih cepat merambatnya.  Setelah proses elusi selesai, plat dikeringkan dengan cara diangin-angin atau dialirkan udara hangat.  Kromatogram Overloaded spot  bad separation Damaged layer  tailing Penampak Bercak  Cara fisika, dilihat dibawah lampu UV : 254 nm dan 360 nm  banyak senyawa organik yang dapat memberikan fluoresensi.  Cara kimia, bercak direaksikan dengan pereaksi kimia sehingga timbul bercak. Asam sulfat pekat  semua senyawa organik, akan terjadi pengarangan, irreversible Uap iodium  bercak akan menjadi coklat, reversible Reaksi khusus, misalnya Pereaksi Dragendorf untuk alkaloid, ninhidrin untuk asam amino, dll  Cara lainnya, misalnya mikrobiologi, enzim, DPPH, dll Dari kromatogram  dapat dihitung Rf (retardation factor) dari masing-masing bercak. jarak yang ditempuh zat dari titik awal Rf = jarak yang ditempuh eluen dari titik awal Harga Rf dipengaruhi oleh :  suhu,  komposisi pelarut,  waktu,  ukuran bejana,  penjenuhan, dan  jumlah plat dalam chamber. KLT untuk Analisis Obat?  Uji Identifikasi  Uji Kemurniaan  Penetapan Kadar Terima kasih