Metode Kromatografi dalam Analisis Kimia

Metode Kromatografi

• Metode kromatografi adalah metode pemisahan multi-tahap yang mendistribusikan komponen sampel di antara dua fase: fase diam dan fase gerak.
• Fase diam dapat berupa padatan atau cairan yang terikat pada padatan atau gel.
• Fase diam dapat dikemas dalam kolom, dibentuk sebagai lapisan, didistribusikan sebagai film, atau diaplikasikan melalui teknik lain.
• Fase gerak dapat berupa gas, cairan, atau fluida superkritis.
• Proses pemisahan dapat dilakukan berdasarkan adsorpsi, distribusi massa (partisi), pertukaran ion, atau perbedaan sifat fisika kimia molekul seperti ukuran, massa, dan volume.

Metode Analisis Instrumental

• Spektroskopi:
  • Metode analisis yang menggunakan interaksi radiasi elektromagnetik dengan materi untuk mengidentifikasi dan menentukan komposisi suatu sampel.
  • Berdasarkan jenis interaksi: Atom (AAS, FES, ICP), Molekul (Spek. UV-Vis, Spek. IR, Spektrofluorometri).
• Kromatografi:
  • Meliputi berbagai teknik pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen dalam campuran pada fase diam.
  • Termasuk Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Kolom, Kromatografi Gas (KG), dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
• Elektrokimia:
  • Metode analisis yang mengukur sifat listrik suatu sampel.
  • Berbagai teknik seperti Potensiometri, Biamperometri, Polarografi, Coulometri, dan Konduktometri.

Metode Lain-lain

• Polarimeter: Mengukur putaran polarisasi cahaya terpolarisasi linear ketika melewati suatu larutan optis aktif.
• Refraktometer: Mengukur indeks refraksi suatu sampel.
• Elektrothermal: Merujuk pada metode analisa instrumen tertentu yang mengukur zat-zat dengan teknik pemanasan elektronik.
• Autotitrator: Alat khusus untuk penetapan kadar suatu titrasi yang dikontrol secara automatis.
• Turbidimetri/Nephelometri: Teknik analisa kuantitatif berdasarkan tingkat kekeruhan larutan.
• MS (Mass Spectrometry) dan NMR (Nuclear Magnetic Resonance): Metode spektroskopi yang menyediakan informasi spektrum dalam mendeteksi senyawa zat tertentu.

Analisis Zat Aktif

• Bahan Baku: Identifikasi, kemurnian, penetapan tetapan fisika, dan kadar atau potensi.
• Sediaan Farmasi: Identifikasi, kemurnian (kalau perlu), penetapan kadar, dan penetapan kinerja (misalnya disolusi atau pelepasan obat).

Tahap Analisis

• 1. Sampling: Memilih sampel mewakili populasi.
• 2. Persiapan Larutan Uji: Memilih aliquot sampel, melarutkan dan menyaring, mengencerkan, memisahkan analit dari matriks.
• 3. Pemisahan/Derivatisasi: Mengisolasi komponen tertentu dalam sampel.
• 4. Pengukuran: Mengukur jumlah komponen.
• 5. Perhitungan dan Pengolahan Data: Menghitung kadar analit dalam sampel.
• 6. Interpretasi: Menganalisis hasil sesuai dengan metode dan parameter yang berlaku.

Klasifikasi Metode Pemisahan

• Berdasarkan ukuran, massa dan densitas, pembentukan kompleks, perubahan fasa fisik, perubahan fasa kimia, atau pembagian di antara fase-fase.
• Jenis teknik pemisahan meliputi filtrasi, dialisis, kromatografi eksklusi ukuran, sentrifugasi, masking, distilasi, sublimasi, rekristalisasi, presipitasi, pertukaran ion, elektrodeposisi, volatilisasi, ekstraksi, dan kromatografi.

Kromatografi

• Metode pemisahan yang diperkenalkan oleh Mikhail Tswett (1906).
• Memisahkan pigmen-pigmen tumbuhan dalam kolom berisi CaCO3.
• Membentuk pita-pita berwarna akibat elusi dengan pelarut organik.

Kromatografi dalam FI VI

• Jenis kromatografi yang digunakan dalam analisis kualitatif dan kuantitatif dalam Farmakope.
• Meliputi kromatografi kolom, kromatografi gas, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis (termasuk KLTKT), dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).

Istilah dalam Kromatografi

• Solut: zat terlarut yang terdistribusi di antara dua fase.
• Fase diam: fase stasioner, padatan atau cairan yang terikat pada padatan atau gel).
• Fase gerak: fase mobil yang membawa solut melewati fase diam.
• Elusi/Pengembangan: proses pemindahan solut melalui kolom kromatografi menggunakan fase gerak.

Tipe Kromatografi dan Mekanisme Pemisahan

• Diurutkan berdasarkan fase diam, dan fase gerak.
• Jenis-jenis tipe kromatografi seperti adsorpsi, partisi, pertukaran ion, eksklusi molekular, dan afinitas.
• Mekanisme pemisahan didasarkan pada interaksi antara solut dan fase diam, seperti adsorpsi, partisi, dan gaya antarmolekul (gaya dispersi London, ikatan hidrogen, dll).

Kromatogram

• Grafik yang menunjukkan respons detektor sebagai fungsi waktu elusi.
• Menunjukkan puncak untuk setiap komponen dalam campuran yang dipisahkan.

Fundamental Measures of Solute Retention

• Adjusted Retention Time (t'): Waktu tambahan yang dibutuhkan solut untuk melewati kolom kromatografi melebihi waktu yang dibutuhkan solut tidak tertahan.
• Relative Retention (α): Rasio antara adjusted retention time untuk dua solut. Nilai α > 1 mengindikasikan pemisahan yang lebih baik.
• Capacity Factor (k'): Mengukur derajat pertahan (retained) komponen/solut pada fase diam relatif terhadap fase gerak. Semakin besar k' berarti semakin lama komponen tertahan di fase diam.

Efficiency of Separation

• Resolution (Rs): Ukuran pemisahan antara dua solut dalam kromatografi. Umumnya, Rs ≥ 1,5 mengindikasikan pemisahan yang baik.
• Number of Theoretical Plates (N): Menggambarkan efisiensi kolom kromatografi. Semakin tinggi N, semakin efisien kolom dalam memisahkan dua solut.
• Height Equivalent of a Theoretical Plate (H): Jarak sepanjang kolom yang sesuai dengan satu "langkah pemisahan teoritis" atau satu plat (N). Semakin kecil H, semakin efisien kolom.

Why Bands Spread?

• Penyebab pelebaran pita/band dalam kromatografi, antara lain: injeksi sampel, difusi longitudinal, kesetimbangan waktu terbatas antara dua fase, dan jalur aliran yang beraneka.

Description of Band Spread

• Ketinggian plat (H) sebanding dengan lebar pita.
• Persamaan Van Deemter menjelaskan hubungan faktor-faktor yang berkontribusi pada lebar pita.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

• Metode pemisahan yang memisahkan senyawa pada fase diam tipis yang dilapiskan pada pelat.
• Fase diam biasanya silika atau alumina.
• Fase gerak adalah campuran pelarut organik.

Pembuatan Plat KLT

• Berbagai ukuran lempeng KLT tersedia.
• Lempeng KLT harus bersih dan bebas lemak.

Silica Gel GF 254

• Digunakan sebagai fase diam dalam KLT karena sifat fluoresensnya.
• Ditandai dengan fluoresensi yang berbeda antara 254 dan 366 nm.
• Substansi yang berkontribusi terhadap fluoresen/fosforesen ini antara lain Uranylacetat, Mangan, dan Seng silikat.

Chamber Pengembangan

• Chamber pengembangan harus jenuh untuk menjaga konsentrasi pelarut yang konstan.

Pengembang/Fase Gerak (Eluent)

• Fase gerak dapat berupa pelarut organik, air, buffer, atau campurannya.
• Pencampuran fase gerak dilakukan berdasarkan rasio volume.

Pelarutan Sampel dan Penotolan Bercak

• Prosedur untuk melarutkan sampel dan menotolkan sampel pada plat KLT.

Proses Elusi (Pengembangan)

• Proses penyangkutan pelarut melalui plat KLT sampai mencapai batas atas.

Kromatogram

• Visualisasi hasil pemisahan dalam KLT atau kromatografi lainnya.
• Berdasarkan gambaran ideal bermacam-macam pita/band.

Penampak Bercak

• Teknik untuk mendeteksi dan memvisualisasikan senyawa yang dipisahkan dalam KLT atau metode kromatografi lainnya.
• Terdiri dari metode fisika (menggunakan lampu UV) dan metode kimia (menggunakan pereaksi kimia).

Dari Kromatogram → Penentuan Rf

• Nilai Rf (Retardation Factor) dihitung dari kromatogram untuk mengkarakterisasi senyawa dalam suatu campuran.
• Rf dipengaruhi suhu, komposisi pelarut, ukuran bejana, dll.

KLT untuk Analisis Obat

• KLT dapat digunakan untuk uji identifikasi, kemurnian, dan penetapan kadar obat.

Uji ini menjelajahi berbagai metode kromatografi dan analisis instrumental di bidang kimia. Anda akan mempelajari prinsip dasar, jenis interaksi, dan aplikasi metode tersebut dalam analisis sediaan farmasi. Ideal untuk mahasiswa dan profesional di bidang analisis kimia.