Sıvı Kromatografisi PDF

Sıvı Kromatografisi Dr. Öğr. Üyesi Sevda AKAY SAZAKLIOĞLU Ayırma Teknikleri ▪ Numunelerin çoğu farklı karışımlarından oluşmaktadır. maddelerin ▪ Bir karışımda bir maddenin analitik sinyali genellikle başka bir maddenin sinyalini etkiler. ▪ Bir numunenin kalitatif veya kantitatif analizini ya...

Sıvı Kromatografisi Dr. Öğr. Üyesi Sevda AKAY SAZAKLIOĞLU Ayırma Teknikleri ▪ Numunelerin çoğu farklı karışımlarından oluşmaktadır. maddelerin ▪ Bir karışımda bir maddenin analitik sinyali genellikle başka bir maddenin sinyalini etkiler. ▪ Bir numunenin kalitatif veya kantitatif analizini yapmadan önce maddelerin birbirinden ayrılması gerekir. • Maddelerin ayrılması hareketli faz ve sabit faz kullanılarak yapılıyorsa bu ayırma tekniğine kromatografi denir. 2 Kromatografi Nedir? Yunanca renk anlamına gelen Chroma sözcüğünden türetilen kromatografi, bilinmeyen bileşikleri tanımlamanın ve karışımları ayırmanın bir yolunu sağlar. Kromatografi Nedir? Karışımın ayrı bileşenlere ayrılması. Ayırma işleminde bir Kolon (sabit faz) ve Çözücü (hareketli faz) kullanılır. Bileşenler, hareketli veya sabit faza olan ilgi farklılıklarına göre birbirlerinden ayrılır. Kromatografi Mobil faz sample • Sabit faz ve hareketli faz birbiriyle karışmayan iki ortamdır. (Katı/sıvı, sıvı/gaz, sıvı/sıvı vb.) • Kromatografinin çalışma prensibi maddelerin sabit faz ve hareketli faz ile etkileşimine dayanmaktadır. Sabit Faz • Sabit fazın görevi maddeleri tutmak ve muhafaza etmektir. Mobil fazın görevi maddeleri itmek ve hareket ettirmektir. Sabit fazla daha fazla etkileşim Mobil fazla daha fazla etkileşim Mobil faz 5 ▪ Bir maddenin hareketli fazla etkileşimi daha fazlaysa hızlı hareket eder. ▪ Sabit faz ile zayıf bir etkileşime sahiptir.Bir maddenin sabit fazla etkileşimi daha fazlaysa yavaş hareket eder. Mobil faz ile zayıf bir etkileşime sahiptir. ▪ Bir maddenin hareketli fazla herhangi bir etkileşimi yoksa hiç hareket etmez. ▪ Numunedeki her maddenin hareketli ve sabit fazlarla farklı etkileşim oranları vardır. ▪ Bu nedenle her maddenin ilerleme hızı farklıdır. ▪ Sonuçta kolonun farklı birbirlerinden ayrılırlar. Stationary phase Mobile phase bölgelerinde bulunurlar Mobile phase 6 ve Kromatografi Uygulamaları Kromatografi: ➢ Karışımların ayrılması ➢ Bilinmeyen bileşiklerin tanımlanması ➢ Bileşiklerin saflığını veya konsantrasyonunu belirlemek ➢ İlaç ve biyoteknoloji endüstrilerinde ürün oluşumunun izlenmesi Araştırma Adli Durumlar İlaç Endüstrisi Kromatografi Türleri İnce Tabaka Kağıt HPLC Gaz Kolon Your mission should you choose to accept is to… ❖ Renkli işaretçileri analiz edin ❖E133 (mavi), E122 (pembe), E124 (kırmızı) veya E110 (sarı) içerip içermediğini test edin İnce Tabaka Kromatografisi ❖ Örnek –işaretleyici ❖ Standart – gıda boyaları ❖ Sabit faz – kromatografi kağıdı ❖ Mobil faz - su E numaralarının yapıları: E110 sarı E124 kırmızı E122 pembe E133 mavi Peki ne olacak? ❖ Her boya kağıt üzerinde farklı hızlarda ilerleyecektir. ❖ Hız, boyanın sudaki çözünürlüğüne ve kağıtla etkileşimine bağlıdır. ❖ Boyaların hepsi farklı özelliklere sahip farklı moleküllerdir. Sonuçların hesaplanması Sonuçların Hesaplanması Analiz Artık her nokta için bir Rf değeri hesaplamanız gerekir. Rf = Bir noktanın başlangıcından ortasına kadar olan mesafe Suyun başlangıç noktasından bitiş noktasına kadar olan mesafe İnce tabaka kromatografisinde tutma faktörü (Rf), bileşikleri karşılaştırmak ve tanımlamak için kullanılır. Sıvı Kromatografisi Bu şimdiye kadar açıklanan ilk kromatografik yöntemdir (1903'te Tswett tarafından) Gaz kromatografisinden farklı olarak sıvı kromatografide numunenin buharlaştırılmaması gerekir, dolayısıyla hemen hemen her türlü bileşik sıvı kromatografiyle analiz edilebilir. HPLC ana kromatografik yöntem olarak kabul edilir. Uçucu olmayan veya ısıya duyarlı malzemeler için kullanılır. Temel tanımlar (IUPAC isimlendirmesine göre) Kromatografi: Ayrıştırılacak bileşenlerin, biri sabit (sabit faz), diğeri (hareketli faz) belirli bir yönde hareket eden iki faz arasında dağıtıldığı fiziksel bir ayırma yöntemi Kromatogram: Kromatografi işlemi sonunda renkli veya renksiz maddelerin ayrıldığı bölgelerin oluştuğu şekil, grafik. Temel tanımlar (IUPAC isimlendirmesine göre) Sabit Faz: Kromatografik sistemi oluşturan iki fazdan biri. Katı, jel veya sıvı olabilir. Sıvı ise katı bir yüzey üzerinde dağıtılabilir. Bu katı, ayırma işlemine katkıda bulunabilir veya bulunmayabilir. Sıvı ayrıca katıya kimyasal olarak da bağlanabilir (bağlı faz: destek parçacıklarına veya kolon borusunun iç duvarına kovalent olarak bağlanabilir) veya onun üzerinde hareketsiz hale getirilebilir (hareketsizleştirilmiş faz) Hareketli Faz: Sabit yatağın içinden veya boyunca belirli bir yönde süzülen bir sıvı. Bir sıvı (sıvı kromatografisi) veya bir gaz (gaz kromatografisi) veya bir süperkritik akışkan (süperkritik-akışkan kromatografisi) olabilir. Sıvı kromatografi prensibi Mobil faz olarak kullanılan bir sıvı, kolon olarak kullanılan bir tüp boyunca hareket eder. Bu sütun, sabit faz rolünü oynayan sağlam bir destekle doludur. Sabit faz ve hareketli faz doğru seçilmişse, karışımın bileşenleri kolon boyunca eşit olmayan şekilde tutulur. Tutma adı verilen bu olay, enjekte edilen çözünen maddelerin farklı hızlarla mobil fazdan daha yavaş hareket ettiği anlamına gelir. Böylece kolondan art arda elute edilirler ve ayrılırlar. Kolon çıkışına bağlanan detektör, kromatogram olarak kaydedilen her bir çözünen maddeye karşılık gelen bir sinyal verir. Çalışma koşullarında, her bir çözünenin kolonda harcadığı alıkonma süresi karakteristiktir ve niteliksel amaçlar için kullanılabilir. Alanına karşılık gelen tepe genliği, enjekte edilen karışımdaki çözünen maddenin konsantrasyonunu ölçmek için kullanılabilir. Kromatografik ayırma işleminin basitleştirilmiş şeması Mobil faz akışı enjektör detektör colon t=0 t = 5mn t = 10mn çok sabit faz ile etkileşimler az Adsorpsiyon kromatografisi • Sabit faz katı bir adsorbandır • Tutma bir dizi adsorpsiyon/desorpsiyon adımından kaynaklanır • Ayırma temel olarak numune bileşenlerinin aktif katının yüzeyine olan adsorpsiyon afiniteleri arasındaki farklara dayanır (sıvı katı kromatografisi) Adsorpsiyon Kromatografisi Silika ve alümina en çok kullanılan sabit fazlardır Hem çözünen hem de çözücü, sabit fazın yüzeyindeki aktif bölgeler tarafından çekilebilir. Moleküller, polar fonksiyonel gruplarının silika silanolleri gibi yüzey fonksiyonel grupları ile etkileşimi yoluyla tutulur. Çözünen maddeler adsorbe eden bölgelerle farklı etkileşimlere sahipse ayrılma meydana gelebilir O H Si O Si O O Si O H H Silika yüzeyinde Silanol grupları Si-OH Partitisyon (dağılma) kromatografisi sabit faz, sıvıyla kaplanmış veya katı bir desteğe bağlıdır tutma, çözünen maddenin iki sıvı faz arasında bölünmesinden kaynaklanmaktadır (göreceli çözünürlük) ayırma esas olarak bileşenlerin hareketli ve sabit fazlardaki çözünürlükleri arasındaki farklara dayanır (sıvı kromatografisi) İyon değiştirme kromatografisi (IEC) o Sabit fazın yüzeyinde iyonik yüklü gruplar bulunur o Tutulma, iyonik çözünen maddeler ile zıt yüklü sabit faz arasındaki çekici etkileşimlerden kaynaklanmaktadır. o Ayırma temel olarak numune bileşenlerinin iyon değişim afinitelerindeki farklılıklara dayanmaktadır. o Bu tekniğe artık sıklıkla İyon Kromatografisi (IC) adı verilmektedir. Boyut dışlama kromatografisi (SEC) • Sabit faz, kontrollü gözenek boyutuna sahip gözenekli bir malzemedir • Ayırma temel olarak moleküler boyut ve/veya şekil farklılıkları gibi dışlama etkilerine dayanır. • Jel Filtrasyonu ve Jel Geçirgenlik Kromatografisi (GPC) terimleri daha önce bu süreci tanımlamak için kullanılmıştı. Boyut dışlama kromatografisi (SEC) Bu modda, her sütun belirli bir boyut aralığına sahip çözünen maddeleri ayırabilir Ayırma mekanizması elemedir Daha büyük türler tüm gözeneklere giremez ve kolonda daha kısa bir yola sahip oldukları için ilk önce elüsyona uğrarlar. Bu mod, makromoleküllerin (polimerler, proteinler,…) moleküler boyutunun belirlenmesinde çok faydalıdır. Gözeneklerin dışında kalan büyük moleküller - tutulmaz, önce elüte edilir Ara moleküller: tutulan, ara elüsyon süreleri küçük moleküller gözeneklere nüfuz eder: güçlü bir şekilde tutulur, en son elüte edilir Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ▪ Sıvı bir solventte çözünmüş bileşenleri yüksek analitik çözünürlükle ayırma tanımlama ve miktarı belirleme işlemleri gerçekleştirilir. ▪ Numune Helyum veya Azottan oluşan hareketli bir gaz akışıyla taşınır. HPLC Başlangıçta şu şekilde anılır: ▪ Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi ▪ Artık daha yaygın olarak adlandırılıyor ▪ Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi ▪ HPLC, çok küçük parçacıklar, küçük kolon çapları ve çok yüksek sıvı basınçları kullanılarak, daha kısa süreler boyunca gelişmiş ayırmalar sağlayan koşullar altında geleneksel sıvı kromatografisinin otomasyonudur. ▪ ▪ Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC), bir numune karışımını veya analiti bir solvent (mobil faz) içinde, kromatografik paketleme malzemesi (sabit faz) içeren bir kolon aracılığıyla yüksek basınçta pompalayan bir kolon kromatografisi şeklidir. ▪ Numune, helyum veya nitrojenden oluşan hareketli bir taşıyıcı gaz akışı tarafından taşınır. ▪ HPLC, herhangi bir numunede bulunan ve bir sıvı içinde çözünebilen ve eser konsantrasyonlarda trilyon başına parça kadar düşük olan bileşikleri ayırabilir ve tanımlayabilir. ▪ Bu çok yönlülüğü nedeniyle HPLC, farmasötik, çevre, adli tıp ve kimyasallar gibi çeşitli endüstriyel ve bilimsel uygulamalarda kullanılmaktadır. HPLC ne amaçla kullanılır? Çok yaygın kullanım alanı bulunan bu teknik ile yapılan analizleri yedi başlık altında incelenebilir: Bunlar; (a) İlaç analizleri (antibiyotikler, sedatifler, steroitler, analjezikler), (b) Biyokimyasal analizler (aminoasitler, proteinler, karbonhidratlar, lipitler, hormonlar, vitaminler, metanefrin, katakolaminler, ketosteroidler, Porfirin, Homosistein, HbA1C), (c) Gıda analizleri (antioksidanlar, alfatoksinler, suni tatlandırıcılar, gıda katkı maddeleri, hormon ve pestisit kalıntı analizleri, su analizleri), (d) Adli tıp, toksikoloji (uyuşturucu ilaçlar, narkotikler, zehirler), (e) Klinik biyokimya (Safra asitleri, üre ekstraktları, ilaç metabolitleri), (f) Gıda ve çevre kirleticileri (Pestisitler, herbisitler, fenoller), (g) Endüstriyel analizler (Polimerler, boyalar, yüzey aktif maddeler, çok halkalı aromatikler, petro kimya uygulamaları) Avantajlar: Yüksek doğruluk ve kesinliğe sahip küçük bir numuneye ihtiyaç vardır GC'ye kıyasla çalışma sırasında numune hasar görmez. Dezavantajlar: Yöntemin kullanılması özel beceri gerektirir. Çok fazla çözücü kullanılır. Alıkonma Zamanı: ▪ Numune kolondan geçerken, esas olarak analitlerdeki farklı polaritelerden dolayı iki faz arasında farklı oranlarda etkileşime girer. ▪ Sabit fazla en az etkileşime giren veya hareketli fazla en fazla etkileşime giren analitler kolondan daha hızlı çıkacaktır. ▪ Mobil faz içerisinde gelen, analizi yapılacak numuneye ait bileşenlerin sabit faz ile etkileşime girerek, belirli oranda tutulması, yavaşlatılması ve böylece daha geç olarak sabit fazı terk etmesi olayıdır. Res ponse D B A C 5 10 15 Retentio n Time 20 25 HPLC Cihazı: HPLC sistemindeki ana bileşenler arasında solvent haznesi veya birden fazla hazne, yüksek basınç pompası, kolon, enjektör sistemi dedektör ve atık bulunur. ▪ Bir hareket ettiği için hareketli faz olarak adlandırılan çözücüyü tutar. Bir sistemde genellikle her biri 1000 cc'ye kadar solvent tutan ve genellikle içinden helyumun kabarcıklanabileceği bir gaz difüzörüyle donatılmış en az iki rezervuar bulunur. ▪ Hazne, fazın belirli bir akışını oluşturmak için bir pompa kullanılır. ▪ Mobil manuel enjeksiyonu hala mümkün olmasına rağmen, çoğu HPLC artık tamamen otomatiktir ve bilgisayar tarafından kontrol edilmektedir. ▪ Numunelerin ▪ Enjektör veya otomatik numune alıcı, solventi, numuneyi, ayırmayı gerçekleştirmek için gereken özel ambalaj malzemesini içeren yüksek basınçlı (400 bar'a kadar) kolona taşıyan bir faz akışına verir. ▪ Paketleme malzemesi, sütun donanımı tarafından yerinde tutulduğu için sabit faz olarak anılır. ▪ Ayrılmış bileşik bantlarını yüksek basınçlı kolondan çıkarken görmek için bir detektöre ihtiyaç vardır. ▪ Bilgi, dedektörden kromatogramı oluşturan bir bilgisayara gönderilir. ▪ Mobil faz dedektörden çıkar ve istenildiği gibi atık olarak gönderilir veya toplanır. Ayırma: Enjeksiyon Karıştırıcı Kromatogram mAU Pompa Zaman Kolon Enjeksiyon başlangıcı Detektör Çözücüler Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Ayırma: Injector Mixer Chromatogram mAU Pumps Start Injection Column Detector Solvents time Kromatogram HPLC Türleri: NORMAL FAZ KROMATOGRAFİSİ TERS FAZLI KROMATOGRAFİ Normal faz kromatografisi ▪ Bu yöntem, analitleri silika gibi sabit bir polar yüzeye olan ilgilerine göre ayırır. polar olmayan, sulu olmayan bir mobil faz kullanır ve polar olmayan solventlerde kolayca çözünebilen analitleri ayırmak için etkili bir şekilde çalışır. ▪ NP-HPLC, ▪ Analit, kutupsal sabit faz ile birleşir ve onun tarafından tutulur. Ters fazlı kromatografi: ▪ Ters fazlı HPLC (RP-HPLC), polar olmayan bir sabit faza, orta derecede polar bir mobil faza sahiptir. ▪ Yaygın bir sabit faz, RMe2SiCl ile yüzeyi modifiye edilmiş bir silikadır; burada R, C18H37 veya C8H17 gibi düz zincirli bir alkil grubudur. ▪ Bu tür sabit fazlarla, daha az polar moleküller için alıkonma süresi daha uzundur, polar moleküller ise daha kolay elüsyona uğrar (analizin başlarında). ▪ Bir araştırmacı, mobil faza daha fazla su ekleyerek alıkonma sürelerini artırabilir Sabit Faz için: ▪ Polar (“Normal” Faz): ▪ ▪ Silika, alumina Apolar (“Ters Faz”) ▪ ODS Silika jel ▪ C18, C8 Mobil Faz için: ▪ Normal kromatografi Hexane ; dichloromethane; isopropanol; methanol Artan güç ▪ Ters-Faz Kromatografi water ; methanol; acetonitrile; tetrahydrofuran (THF) Artan güç HPLC Performansını Etkileyen Faktörler: ▪ Kolonun iç çapı Çap ne kadar küçük olursa hassasiyet de o kadar yüksek olur. ▪ Pompa basıncı Basınç ne kadar yüksek olursa, ayrılma da o kadar yüksek olur. ▪ Örnek boyut ▪ Solvent ve kolon sıcaklığı Sıcaklık ne kadar yüksek olursa ayırma da o kadar yüksek olur. Sorun Giderme Gürültü Problemi ▪ ▪ ▪ ▪ Enjeksiyon sırasında mobil faz akışında hafif bir kesinti olur. (A) Sistemdeki hava kabarcıkları düzensiz akışa neden olabilir, bu durumda gürültünün boyutu akış hızıyla orantılı olacaktır. (B) Sebep dedektördeki elektronik gürültü ise, gürültü seviyesi akış hızından bağımsız olacaktır. (B) Sürekli yükselen (ya da alçalan) bir taban çizgisi genellikle sönmekte olan bir dedektör lambasından kaynaklanır. Hava Kabarcık Problemi Örneği ▪ Sızıntı yapan bir bağlantı parçası arızalanması, basıncın düşmesine ve sisteme hava girmesine neden olabilir. Hava Kabarcık Problemi Örneği İyi bir temel çizgi -baseline Sistemde hava kabarcıkları var Periyodik taban çizgisi dalgalanmalarına, özellikle de basınç dalgalanmalarının eşlik etmesi durumunda, pompadaki hava kabarcığı veya başka bir pompa arızası neden olabilir. ▪ Pompa hızı değiştirilirse dalgalanma frekansı değişir mi? ▪ Pompayı tekrar çalıştırılması ▪ Mobil fazın gazının giderilmesi ▪ Rutin pompa bakımının gerçekleştirilmesi Akış olmasa da sorun devam ediyor mu? ▪ Dedektörü kontrol edin ▪ Güç kaynakları, radyolar vb. gibi çevresel etkileri kontrol edin. ▪ Kolon sıcaklığı eşit mi? Peak Fronting ▪ Aşırı yüklenmiş kolon. ▪ Katı fazda kanal oluşumunun belirtisi olabilir. Tepe noktasının kuyruklanması ▪ ▪ ▪ ▪ Silanol etkileşimleri Sabit fazın bozulması, Süpürülmemiş boşluk hacmi veya kolonun başında boşluk oluşumu, ANALİT, MOBİL FAZ VE KOLON POLARİTELERİ ARASINDA KÖTÜ UYUMLULUK Kolonun aşırı yüklenmesi Çözünürlük kaybı Kuyruklama Genişletme Saklama süresi azalır Matris Aşırı Yükü Bu durumda numune matrisindeki safsızlıklar kolon dolgusunu kaplar ve çözünürlüğü ve alıkonma sürelerini azaltır. ▪ Bu, numuneler biyolojik sıvılardan çıkarıldığında meydana gelebilir. ▪ Hayalet pikler ▪ Sütun Kirliliği ▪ Önceki bir çalışmadan elde edilen analitlerin elüsyonu First run ▪ ▪ Sütunu ters çevirin ve yıkayın Çalışmanın sonunda daha uzun bir çalışma süresi, farklı bir temizlik veya güçlü bir solvent kullanın Second run Hayalet Tepeler mi, Rastgele Temel Gürültü mü? ▪ Bazen rastgele gibi görünen taban çizgisi gürültüsü hayalet tepe noktalarıyla aynı tedaviyi sağlayabilir, sütunu ters çevirip temizleyebilir. PİKLERİN IKIYE KATLANMASI VEYA BÖLÜNMESI (Peak doubling or splitting) Numune hacmi çok büyük ise, Toplam numune hacmi ilk pikin hacminin %15'inden az olacak şekilde mobil fazda hazırlanan numuneyi enjekte edilmelidir. Enjeksiyon solventi çok güçlü ise Daha zayıf enjeksiyon solventi kullanılmalıdır Temizlenmemiş enjektör akış yolu Enjektör rotorunu değiştirilmelidir.