DEMO-Kromatografi Yöntemleri PDF

Kromatografi Yöntemleri Arş. Gör. Eda AVCI Öğr. Gör. E. Ayça ALTINKAYA SAMİM Öğr. Gör. Reyhan ARICI • Kromatografi bir saflaştırma yöntemidir. Bir karışımı oluşturan farklı özellik ve yapıdaki maddelerin birbiri ile karışmayan iki faz arasındaki dağılma dengeleri ve farklı adsorbsiyon özellikleri...

Kromatografi Yöntemleri Arş. Gör. Eda AVCI Öğr. Gör. E. Ayça ALTINKAYA SAMİM Öğr. Gör. Reyhan ARICI • Kromatografi bir saflaştırma yöntemidir. Bir karışımı oluşturan farklı özellik ve yapıdaki maddelerin birbiri ile karışmayan iki faz arasındaki dağılma dengeleri ve farklı adsorbsiyon özelliklerinden yararlanılarak yapılan ayırma metodudur. • İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903) tarafından geliştirilen bir yöntemdir. Bitki pigmentlerinin renkli bileşenlerini ayırmakta kullanılmıştır. • Latince chroma (renk) ve graphein (yazmak) kelimelerinden kromatografi ismi meydana gelmiştir. Karışımı oluşturan bileşenlerin her birini saf olarak elde etmek için kullanılır. Bileşiklerin sahip olduğu polarite, çözünürlük, uçuculuk ve molekül büyüklüğü farkı nedeniyle farklı bileşikler kromatografik sistemde birbirinden ayrılır. • Sabit faz: Kromatografide, bir kolon içerisine veya düz bir yüzeye tutturulmuş faza, sabit faz (stasyoner faz) denir. Bu faz daima bir “katı” veya “katı destek üzerine emdirilmiş bir sıvı tabakasından” oluşur. • Hareketli faz: Sabit fazın üzerinden veya arasından geçen faza hareketli faz (mobil faz) denir. Bu faz daima bir “sıvı” veya “gazdan” oluşur • Sabit faz ile hareketli faz arasındaki etkileşim “yüzey tutunması/adsorpsiyon” ve “çözünürlük” ile olur. Kromatografi Uygulama Şekillerine Göre Düzlemsel Kromatografi Kolon Kromatografisi Ayrılma Mekanizmalarına Göre (Dayandıkları Prensiplere Göre) Adsorbsiyon Mobil Faza Göre Sıvı Kromatografisi Kağıt Kromatografisi Klasik Kolon Partisyon (Dağılma) Sıvı-Sıvı Kromatografisi İnce Tabaka Kromatografisi LPLC İyon Değiştirme Sıvı-Katı Kromatografisi Preparatif İTK MPLC İyon Çifti Oluşumu Kağıt Elektroforezi HPLC Moleküler Eleme Gaz Kromatografisi (GC) Afinite Gaz Kromatografisi Gaz-Katı Kromatografisi Gaz-Sıvı Kromatografisi İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ • İnce tabaka kromatografisi basit, ucuz, hassas, hızlı ve çok kullanılan bir yöntemdir. Esası adsorpsiyondur. İnce tabaka kromatografisinin kullanım amaçları: • Karışımdaki bileşenlerin sayısını belirlemek • Belirli bir maddenin karışımda olup olmadığını anlamak • Reaksiyonun yürüyüşünün kontrol edilmesi • Kolon kromatografisi için uygun koşulun belirlenmesi • Ürün saflığının kontrol edilmesi İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ Revelatör: Plak üzerinde sürüklenme tamamlandıktan sonra, gözle görünmeyen bileşiklerin görünür hale gelmesi için kullanılan çözeltilerdir. Rf (Rezolüsyon Faktörü): Maddenin sürüklendiği mesafenin plağa uygulandığı noktaya (start) olan uzaklığının, mobil fazın plak üzerinde ilerlediği son nokta (front) ile start arasındaki uzaklığa oranıdır. Bu değer 1’ den küçüktür. Aynı koşullarda aynı bileşiklerin Rf değerleri aynıdır. Pulverizatör: Revalatörü plak üzerine püskürtmek amacıyla kullanılan düzenektir. İnce tabaka kromatografisinde sabit faz olarak kullanılan adsorbanlar silikajel, alümina ve selülozdur. • Çözücü plakanın üst kısmına geldiğinde (tepeye 0.5 cm kalmalı) plaka tanktan pens yardımıyla çıkarılır ve kuruması beklenir. • Eğer yürütülen maddeler renkli ise zonlar kurşun kalemle işaretlenir. • Eğer maddeler renksiz ise; • UV lambasında bakılabilir • Plakaya sprey sıkılarak zonlar renkli hale getirilebilir • Plaka iyot buharlarına tutulabilir, böylelikle zonların yer aldığı noktalar renklenir. • Az miktarda maddenin birbirinden ayrılması ve saflaştırılması için bazen kolon kromatografisi yerine preparatif ince tabaka kromatografisi kullanılır. • İşleme başlamadan önce, uygun bir yürütücü sistem ve adsorban seçimi yapabilmek adına ince tabaka kromatografisiyle denemeler yapılır. • İşlem ince tabaka kromatografisine benzer şekilde uygulanır. • Ucu sıcaklıkla inceltilmemiş kapiler tüp yardımıyla şeritler halinde ekim yapılır. (İnce tabaka kromatografisinde ucu inceltilmiş kapiler tüplerle noktalar halinde ekim yapılır.) KOLON KROMATOGRAFİSİ • Kolon kromatografisine tatbik edilen karışım kolon içine doldurulmuş sabit faz üzerinden, hareketli faz aracılığıyla geçer ve bileşenlerine ayrılır. • En çok karşılaşılan uygulama şekli katı-sıvı kromatografisidir. Kolon kromatografisinde maddeler, sabit faza ne kadar fazla tutunurlarsa kolonu o kadar geç terk ederler. Bu tutunma sabit faz ve ayrılacak maddenin polaritesine bağlıdır. Örneğin kolonda polar bir sabit faz varsa ve ayrılacak maddenin de polaritesi fazlaysa kolonu terketmesi zor olacak ve zaman alacaktır. Kolon kromatografisi için en sık kullanılan dolgu maddeleri silika jel ve alüminadır. Her ikisi de polar dolgu maddeleridir ve polar olmayan bileşenlerin kolondan önce ayrılmalarını sağlarlar. Polar maddeler için polar, apolar maddeler için apolar çözücüler uygundur. Maddelerin kolondan ayrılma hızı adsorbanın tutucu aktivitesi ile çözücünün polaritesi aradındaki dengeye bağlıdır. GAZ KROMATOGRAFİSİ • Gaz kromatografisi, uçucu ve uçucu türevleri hazırlanabilen bileşiklerin ayrımında kullanılmaktadır. • En yaygın formu gaz-sıvı kromatografisidir. Bu yöntemde ayrımın yanı sıra, aynı anda maddelerin nitel ve nicel analizleri de uygun detektörler yardımıyla yapılabilmektedir. • Gaz kromatografisinde de diğer kromatografik yöntemlerde olduğu gibi iki faz bulunmaktadır: • 1) Hareketli (Mobil) Faz: Bu fazı taşıyıcı gaz oluşturur. Helyum, azot, hidrojen gibi inert gazlar kullanılabilir. • 2) Sabit (Stasyoner) Faz: Bu faz metilsilikon, fenil metilsilikon, polietilen glikol gibi bileşiklerin inert bir katı destek üzerine kaplanmasıyla hazırlanan çeşitli dolgu maddeleri ile doldurulmuş kolonlar veya kapiller kolonlardan meydana gelmektedir. Stasyoner faz, ayrımı yapılacak bileşiklerin kimyasal yapılarına göre seçilir. • Gaz kromotografisinde ayrımı yapılmak istenen bileşiklerin retansiyon zamanları çok önemlidir. “Rt” ile ifade edilen retansiyon zamanı, bileşiğin kolondaki alıkonma süresidir. • Aynı şartlarda verilen standartla, teşhisi yapılmak istenen bileşiğin retansiyon zamanları karşılaştırılarak bileşiğin teşhisi yapılır. • Gaz kromatografisiyle ayrılan bileşiklerin vermiş olduğu piklerin alanının ölçülmesi ile miktar tayini yapılabilmektedir. Gaz Kromotografisi-Kütle Spektrometresi (GC-MS) • Son yıllarda gaz kromatografisine, kütle spektrometresinin bağlanması ile geliştirilen GC-MS çok güçlü bir analiz tekniği olarak ortaya çıkmıştır. • Kütle spektrumu yardımıyla, GC-MS'de analizi yapılan maddelerin yapısı hakkında bilgi edinilebilmekte ve kolaylıkla teşhisi yapılabilmektedir. Bilinmeyen maddelerin teşhisinde kullanılan yüksek kapasiteli veri kütüphanelerine (data base) sahip olan GC-MS'de, kolondan çıkan bileşikleri kütle/yük (m/z) oranlarına göre ayıran kütle analizatörü mevcuttur. YÜKSEK BASINÇLI SIVI KROMATOGRAFİSİ (YBSK-HPLC) • GC tekniği ile iyonik, uçucu olmayan ve ısıya dayanıksız maddelerin ayrımı mümkün olmadığından, bu yönteme alternatif olarak HPLC tekniği geliştirilmiştir. • HPLC bir çeşit kolon kromatografisidir. • Analizi istenen numune sabit faz içeren bir kolona verilir ve yüksek basınçta pompalanan hareketli faz yardımıyla kolonda yürütülür. • Kolon çıkışında bulunan dedektör yardımıyla gelen her madde pik olarak algılanır ve bir kromatogram elde edilir. Numunenin miktarı çok az da olsa sonuç alınabilir. HPLC; • Organik ve inorganik maddelerin ayrımında, • Biyolojik materyallerden ilaç ve metabolitlerin saptanmasında, • İlaç etken ve yardımcı maddelerinin saflık ve kalite kontrollerinde, • İlaç endüstrisinde ham madde ve bitmiş ürünlerin stabilite kontrol işlemlerinde kullanılır. Farmakognozide ise; • Standardize ekstre hazırlanmasında, • Bitki materyalindeki maddelerin kalitatif/kantitatif analizlerinde ve izolasyonlarında, • İzolasyon sonrası saflık kontrolünde, • Bitkisel preparatların stabilite ve kalite kontrol analizlerinde HPLC’den yararlanılır. • HPLC’de de diğer kromatografik yöntemlerde olduğu gibi iki faz bulunmaktadır. Mobil fazın taze hazırlanması gerekmektedir. • HPLC’de iki faz bulunmaktadır: Hareketli (Mobil) Faz ve Sabit (Stasyoner) Faz. • Mobil fazın uygulanma şekline göre iki tip elüsyon mevcuttur: a. İzokratik Elüsyon: Mobil fazın bileşimi analiz boyunca aynıdır, değişmez. b. Gradient Elüsyon: Bileşenler iki veya daha fazla çözücü sistemi kullanılarak elüe edilir. Analiz süresince mobil fazın bileşimi sabit değildir, değişiklik yapılır. Mobil fazda bulunması gereken özellikler: • HPLC saflığında olmalı ve detektöre uygunluk göstermelidir. • Numuneyi çözmeli ve dolgu materyali ile reaksiyona girmemelidir. • Numuneyi tekrar kazanmaya uygun olmalıdır. • Viskoz olmamalı, hızlı akışa izin vermelidir. • Kolay alev almamalı, • Toksik olmamalı, • Ekonomik olmalıdır. • Mobil Faz Rezervuarı • Kolon HPLC Kısımları • Pompa • Detektör • Enjektör • Kaydedici Kromatografideki Temel Parametreler • Retansiyon zamanı ve retansiyon hacmi • Pik yüksekliği ve pik tabanı • Rezolüsyon • Kolonun etkinliği • Kolon kapasite faktörü • Kolon seçiciliği KAĞIT KROMATOGRAFİSİ • Sabit faz, özel süzgeç kağıtlarına emdirilmiş sıvıdır (Whatman kromatografi kağıdı). • Hareketli faz ise çözücü ya da çözücü karışımlarıdır. • Dağılım kromatografisi ilkesine dayanır. • Tüm işlemler ince tabaka kromatografisi ile aynıdır. Ancak kağıt kromatografisinde kullanılan süzgeç kağıdının boyu uzun tutulmalıdır.