Prinsip Dasar Kromatografi PDF

KROMATOGRAFI Adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat kimia yang berdasar pada perbedaan migrasi dari masing-masing komponen campuran yang terpisah pada fase diam di bawah pengaruh pergerakan fase gerak PRINSIP DASAR:  Metode pemisahan beberapa tahap (multi stage)  Ter...

KROMATOGRAFI Adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat kimia yang berdasar pada perbedaan migrasi dari masing-masing komponen campuran yang terpisah pada fase diam di bawah pengaruh pergerakan fase gerak PRINSIP DASAR:  Metode pemisahan beberapa tahap (multi stage)  Terjadi beberapa kali proses kesetimbangan antara dua fase.  Alat yang digunakan : tabung (disebut kolom) yang mengandung bahan padat granular yang sering diikatkan / dilapisi fase cair dengan gaya fisik atau kimia  fase diam.  Fase gerak : eluen yang mengalir terus menerus melewati kolom. 1  Sampel diletakkan diatas kolom, lalu eluen dialirkan melewati kolom  terjadi beberapa kali kesetimbangan antara dua fase, konstituen/zat terlarut akan bergerak ke bawah.  Ada sedikit perbedaan ratio distribusi yang diperlukan untuk zat terlarut bergerak dengan kecepatan yang berbeda melalui kolom dan terjadilah proses pemisahan satu dari yang lainnya.  Gaya pemisahan pada metode multi stage (countercurrent) ini lebih besar dari pada single-stage. 2 Pemisahan Klorofil Dan Pigmen Dari Tanaman Menggunakan Tabung ( Kolom) Yang Diisi Padatan Kalsium Karbonat Dan Dielusi Dengan Pelarut Organik End: Serangkaian pita Start: kolom pita yang berwarna gelas diisi padatan terlihat dalam kolom, kapur (CaCO3). yang berhubungan dengan warna yang ada dalam pigmen daun hasil Ekstrak etanol dari kemudian ekstrak awal. pigmen daun yang Pita pita tsb kemudian diletakkan pada atas ditentukan adalah kolom) chlorophylls, Etanol digunakan xanthophylls and untuk mengelusi / carotenoids. membawa pigmenturun ke bawah melewati kolom  Kata “chromatography” dikenalkan oleh Tswett (1906)  “chroma” atau“color” artinya warna dan “ graphein” atau “write” artinya menulis. Kromatografi : metode pemisahan dimana komponen komponen tersebut terdistribusi diantara fase diam ( stasioner) dan fase gerak ( mobile) Fase diam : padatan berpori yg digunakan sendirian atau dilapisi dgn fase diam zat cair ( disebut dengan padatan pendukung) Fase gerak : disebut eluent atau pembawa Proses dimana eluent bergerak dengan membawa komponen disepanjang kolom disebut: elusi 4  Pemisahan dapat terjadi karena komponen dari sampel mempunyai perbedaan afinitas diantara fase diam dan fase gerak dan pergerakkan mempunyai kecepatan yang berbeda beda sepanjang kolom. Hasil pemisahan digambarkan dalam kurva “kromatogram” Tiap puncak menggambarkan konstituen sampel yg terpisah ( Kualitatif) Area dibawah puncak menggambarkan ukuran jumlah relatif dari konstituen ( Kuantitatif). Dasar kromatografi: mengubah sistem kesetimbangan statis menjadi dinamis antara fase diam dan fase gerak 5  chromatogram – concentration versus elution time strongly retained species elutes last – elution order analyte is diluted during elution – dispersion zone broadening proportional to elution time  KLASSIFIKASI KROMATOGRAFI KROMATOGRAFI GAS SFC LIQUID GSC GLC COLUMN PLANAR LSC LLC BPC IEC EC TLC PC GPC GFC 7 8  KROMATOGRAFI BERDASARKAN ASAS TERJADINYA PROSES PEMISAHAN : 1. ADSORPSI (Fase diam = padat ; fase gerak = cair / gas), pemisahan tergantung perbedaan polaritas molekul. contoh :  Kromatografi kolom konvensional (CC), LSC  Kromatografi lapis tipis (TLC)  Kromatografi Penukar Ion (IEC)  Kromatografi gas padat (GSC)  Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) 2. PARTISI (Fase diam = cair ; fase gerak = cair), pemisahan tergantung perbedaan koefisien distribusi. Contoh:  Kromatografi kolom (CC), LLC  Kromatografi kertas (PC)  Kromatografi gas cair (GLC)  Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) 9 3. FILTRASI (Fase diam= padat & fase gerak = cair), pemisahan tergantung perbedaan struktur dan ukuran molekul 4. SUHU KRITIK, Pengembangan kromatografi gas dan HPLC (Fase Diam = Cair ; Fase gerak : fluida superkritik CO2) contohnya SFC Sistem kesetimbangan dalam kromatografi lebih ditekankan pada sistem kesetimbangan partisi (sifatnya ideal) dari pada adsorpsi (sifatnya non ideal) 10 KROMT METODE PEMISAHAN FASE FASE TYPE KESETM GERAK DIAM GSC/KGP GAS – PADAT GAS PADAT ABSORPSI GLC/KGC GAS – CAIR GAS CAIR PARTISI GBPC GAS – BONDED PHASE GAS F.ORG ADSORPSI / PARTISI TERIKAT LLC CAIR – CAIR CAIR CAIR PARTISI LSC CAIR – PADAT CAIR PADAT ADSORPSI LBC CAIR – BONDED PHASE CAIR F. ORG ADSORPSI/PARTISI TERIKAT IEC PERTUKARAN ION CAIR RESIN PERTUKARAN ION GPC PERMIASI GEL CAIR Z. PDT PENYARINGAN POLIMER CAIR PC CAIR- CAIR CAIR PARTISI PADAT TLC CAIR-PADAT CAIR ADSORPSI SFC GAS/ CAIR CAIR GAS/CAIR CAIR PARTISI (CO2 SC) 11  Adsorption Chromatography Adsorption chromatography is probably one of the oldest types of chromatography around. It utilizes a mobile liquid or gaseous phase that is adsorbed onto the surface of a stationary solid phase. The equilibriation between the mobile and stationary phase accounts for the separation of different solutes. 12  Partition Chromatography This form of chromatography is based on a thin film formed on the surface of a solid support by a liquid stationary phase. Solute equilibriates between the mobile phase and the stationary liquid. 13  Ion Exchange Chromatography In this type of chromatography, the use of a resin (the stationary solid phase) is used to covalently attach anions or cations onto it. Solute ions of the opposite charge in the mobile liquid phase are attracted to the resin by electrostatic forces. 14  KROMATOGRAFI ELUSI Pada dasarnya hampir semua proses kromatografi adalah elusi Dalam kolom kromatografi elusi, zat yang dipisahkan tergantung pada perbedaan partisi / distribusi antara fase diam (terpacking dalam kolom ) dan fase gerak (mengalir melalui kolom) 15 16  Jika dalam sampel terdapat zat A dan zat B yang akan dipisahkan, maka saat keduanya bergerak ke bawah melewati sepanjang kolom, kecepatan bergeraknya tergantung pada Ratio Distribusi (DC ATAU Dm ) jumlah zat terlarut dalam fase diam Dm  jumlah zat terlarut dalam fase gerak konsentrasi zat terlarut dalam fase diam Dc  konsentrasi zat terlarut dalam fase gerak Dalam kromatografi ratio distribusi lebih sering disebut dengan ratio kapasitas atau faktor kapasitas (k ) jumlah zat terlarut dalam fase diam k jumlah zat terlarut dalam fase gerak 17  Jika harga k (faktor kapasitas) kecil, maka komponen / analat akan bergerak dalam kolom lebih cepat. Jika eluen bergerak ke bawah di dalam kolom dengan kecepatan alir linear sebesar u (cm/sec), maka pergerakan komponen/analat pada kecepatan linear yang sama adalah u/(1 + k) (cm/sec). Bila komponen zat A dan zat B mempunyai harga k yang berbeda cukup besar, maka akan terjadi pemisahan. 18 tm, to = Waktu migrasi , tr = waktu retensi , h = tinggi puncak tw, W = lebar puncak , random fluctuations longitudinal diffusion (negligible in liquids) eddy diffusion or “channeling” 19  PENGARUH KECEPATAN MIGRASI RELATIF DAN KONSENTRA PELEBARAN PITA PADA RESOLUSI B A B A SI JARAK MIGRASI Beberapa variabel kimia dan fisika dapat mempengaruhi kecepatan pada pemisahan pita/puncak dan lebar pita agar didapat pemisahan yang sempurna : 1. Menambah kecepatan pada pita pemisahan 2. Mengurangi kecepatan dari luas/lebar pita 20 Alternatif tersebut dapat dilihat pada gambar dibawah ini. Kromatogram mula mula dengan puncak yg overlap Diperbaiki dengan menambah kecepatan pita pemisahan Diperbaiki dengan mengurangi kecepatan dari luas pita 21