Analisi Strumentale Spettrofotometria PDF - Università San Raffaele

Docente Alessandra De Bruno Lezione Analisi strumentale: spettrofotometria  Alessandra De Bruno Obiettivi: Ø La spettrofotometria, principi teorici Ø Gli Spettrofotometri; Ø Teoria del funzionamento dello spettrofotometro; Ø Procedime...

Docente Alessandra De Bruno Lezione Analisi strumentale: spettrofotometria  Alessandra De Bruno Obiettivi: Ø La spettrofotometria, principi teorici Ø Gli Spettrofotometri; Ø Teoria del funzionamento dello spettrofotometro; Ø Procedimento analitico; Ø I colorimetri Analisi strumentale: spettrofotometria 2 di 24  Alessandra De Bruno 1. Spettrofotometria la scienza spettrofotometrica si basa sul riconoscimento di una specie chimica in seguito a una sua modificazione energetica: quando uno o più atomi vengono eccitati da una radiazione assorbono fotoni e subiscono transazioni elettroniche o movimenti vibrazionali o rotazionali. Analisi strumentale: spettrofotometria 3 di 24  Alessandra De Bruno 1.1 Spettrofotometria UV-VIS.. rappresenta una delle metodiche analitiche più diffuse e utilizzate in campo alimentare. Si tratta di una tecnica molto versatile, in quanto le metodiche possono essere facilmente adattate per determinare numerosissimi analiti. La spettrofotometria UV- Visibile si basa sull'assorbimento di radiazioni elettromagnetiche monocromatiche del campo del visibile e dell’UV. Analisi strumentale: spettrofotometria 4 di 24  Alessandra De Bruno La radiazione UV-VIS rappresenta solo una piccola parte dello spettro elettromagnetico. L'ultravioletto è una regione compresa tra 10 e 400 nm ( 1 nm= 10-9 m), anche se la zona che si usa in spettroscopia di solito è quella nell'intervallo 200- 400 nm. La regione del visibile è compresa tra 400 e 800 nm, dove 400 nm è quella più energetica(blu- violetto) mentre 800 nm corrisponde alla radiazione meno energica (rosso). Analisi strumentale: spettrofotometria 5 di 24  Alessandra De Bruno Riassumendo: la spettrofotometria UV/Visibile si basa sull’assorbimento selettivo da parte di molecole, delle radiazioni con lunghezza d’onda compresa fra 10 nm e 780 nm. Tale gamma spettrale si può suddividere in tre regioni: UV lontano (10 - 200 nm) UV vicino (200 - 380 nm) Visibile (380 - 780 nm) Il principio che regola le metodiche spettrofotometriche: è la misura della quantità di radiazione assorbita o emessa dalle molecole. Nella spettroscopia UV-VIS l'assorbimento di una radiazione è dovuto all'eccitazione degli elettroni di legame. Analisi strumentale: spettrofotometria 6 di 24  Alessandra De Bruno 1.2 Lo spettro e l’analisi qualitativa L'aspetto qualitativo della spettrofotometria UV- VIS può essere rappresentato dallo spettro (figura). Questo è la rappresentazione bidimensionale su due assi cartesiani dove: sull'asse delle ascisse si riporta la lunghezza d’onda; sull'asse delle ordinate l'assorbanza (in Au o mAu). Lo studio dello spettro può fornire informazioni sulla natura della molecola ad esempio, la lunghezza d'onda dove si osserva il massimo assorbimento. Inoltre, lo spettro di una molecola può variare in funzione della natura del solvente (polarità, analita, pH e temperatura. Analisi strumentale: spettrofotometria 7 di 24  Alessandra De Bruno 2. Gli Spettrofotometri Strumento di base, costituito da: Classificazione: - sorgente luminosa (lampada); Strumento che misura nel contempo - sistema di selezione della lunghezza d’onda l'assorbimento di due celle: una contiene il (monocromatore); campione; l'altra il bianco di riferimento. - alloggio per il campione; Singolo Doppio L'apparecchio fornisce automaticamente il - Rivelatore; raggio raggio rapporto dell'intensità dei segnali e compensa a - registratore del segnale l'assorbimento dovuto al bianco. b Analisi strumentale: spettrofotometria 8 di 24  Alessandra De Bruno Esempio di schema a blocchi di uno spettrofotometro: «S» è la sorgente luminosa che può essere una lampada: A (A) deuterio per l'analisi nel campo dell’UV (180-370 nm); (B) tungsteno o tungsteno-alogena per analisi nel campo del visibile (330- 2500 nm). La lampada è un dispositivo che emette radiazioni di intensità costante e stabile su tutto lo spettro con un basso rumore di fondo. B Analisi strumentale: spettrofotometria 9 di 24  Alessandra De Bruno «M» il monocromatore è il dispositivo che permette di separare il fascio di luce prodotto dalla lampada nelle diverse lunghezze d'onda che lo compongono. L'intervallo di lunghezze d'onda trasmesso da un monocromatore viene definito: banda passante spettrale e questo valore è generalmente inferiore a 1-2 nm negli strumenti di buon livello. Il primo sistema utilizzato era il prisma (a), attualmente vengono utilizzati i reticoli di diffrazione, costituiti da una superficie munita di numerosi solchi paralleli che riflette la radiazione incidente di un certo angolo R. Analisi strumentale: spettrofotometria 10 di 24  Alessandra De Bruno «C» Celle o cuvette contenitori trasparenti (normalmente di forma rettangolare) di lunghezza variabile da 1 mm a 100 mm (più usate 10 mm ). Possono essere realizzate in vetro o quarzo ed eventualmente anche munite di tappo in PTFE. I volumi sono variabili da 3 mL meno di 5 µL. Le cuvette in quarzo garantiscono trasmittanze maggiori dell’80% in intervalli compresi tra 200 e 2.500 nm. Inoltre offrono la migliore prestazione in termini di accuratezza e riproducibilità. Le cuvette monouso (polistirene o metacrilato) presentano il vantaggio di non richiedere la pulizia dopo l’uso. I difetti sono legati alla sensibilità a certi solventi, alla facilità di rigatura delle superfici, alla scarsa resistenza termica e all'impossibilità di utilizzarle a lunghezze d'onda inferiori a 200-300 nm. Analisi strumentale: spettrofotometria 11 di 24  Alessandra De Bruno Analisi strumentale: spettrofotometria 12 di 24  Alessandra De Bruno «R» Rivelatori trasformano il segnale luminoso in un segnale elettrico. La radiazione UV-VIS ha sufficiente energia per promuovere la fotoemissione, cioè la produzione di elettroni a seguito dell'interazione della radiazione con una superficie reattiva. Rivelatori di questo tipo sono le fotocellule e i fotomoltiplicatori, costituiti da strutture sottovuoto ad alto voltaggio piuttosto ingombranti. Attualmente sono molto diffusi i fotodiodi, elementi di piccole dimensioni e relativamente economici, con risposta veloce, buona linearità, basso rumore. Analisi strumentale: spettrofotometria 13 di 24  Alessandra De Bruno «A» Amplificatore: Che amplifica il segnale elettrico del rivelatore «I»: Registratore: Che fornisce il valore di assorbanza Analisi strumentale: spettrofotometria 14 di 24  Alessandra De Bruno 3. Teoria del funzionamento dello spettrofotometro Il parametro che lo spettrofotometro è in grado di valutare è l’assorbanza (A) che viene definita dalla formula: A=log(Io/It) Dove I0 e It sono l’intensità di luce, rispettivamente, prima del campione (incidente) e trasmessa. L’assorbanza è un valore senza unità di misura che va da 0 (luce trasmessa uguale a quella in entrata) a 2 (luce trasmessa è 1/100 di quella incidente). Analisi strumentale: spettrofotometria 15 di 24  Alessandra De Bruno L’assorbanza segue la legge di Lambert e Beer che afferma che la concentrazione del campione nella cuvetta è proporzionale alla sua assorbanza. A= εcl ε è il coefficiente di estinzione molare (M-1cm-1), ovvero una costante che varia a seconda delle caratteristiche della sostanza. Essa varia a seconda della lunghezza d’onda incidente e indica la capacità di una sostanza di assorbire la data radiazione; c è la concentrazione molare del campione nella cuvetta (M); l è il cammino ottico, ovvero la lunghezza della cuvetta (cm). Analisi strumentale: spettrofotometria 16 di 24  Alessandra De Bruno 4. Limiti dello strumento I limiti dipendono dal modello di spettrofotometro e dalle sue caratteristiche specifiche e sensibilità ma anche dalla precisione dell’operatore. Per una buona misurazione i campioni devono essere puliti e senza residui grossi o impurità. È importante che le cuvette siano perfettamente pulite nei lati dove passa la luce per evitare fenomeni di assorbimento o riflessioni di luce errati. Per di più è necessario conoscere la lunghezza d’onda della luce assorbita dalle molecole che si stanno cercando, così da poter impostare lo strumento nella maniera corretta, nel caso di analisi a singola lunghezza d’onda. Nel caso in cui la composizione del campione sia ignota si può osservare lo spettro totale e, successivamente, analizzare i singoli picchi nel grafico per determinare le molecole presenti. Analisi strumentale: spettrofotometria 17 di 24  Alessandra De Bruno 5. Procedimento analitico: Vengono preparati alcuni campioni standard di cui si misura l’assorbanza, si costruisce una retta di taratura (ponendo l’assorbanza contro la concentrazione) e la retta di regressione tra due concentrazioni standard comprese nell’intervallo. L'analisi può essere effettuata direttamente sulla sostanza da esaminare messa in un mezzo trasparente che assorbe a una determinata lunghezza d’onda. Viene preventivamente eseguita una prova in bianco di un liquido che contiene tutti i reattivi tranne la sostanza da analizzare Analisi strumentale: spettrofotometria 18 di 24  Alessandra De Bruno Ø Utilizzando uno spettrofotometro a raggio singolo si porta la trasmittanza al 10% inserendo la prova in bianco e poi si misura l'assorbanza del campione. Ø Utilizzando uno spettrofotometro a doppio raggio occorre azzerare lo strumento senza che si verifichi assorbanza nel raggio del campione e della prova di riferimento: la cuvetta che contiene il solvente viene emessa nella direzione del raggio di riferimento mentre quella con il campione viene messa nella direzione del raggio del campione. Analisi strumentale: spettrofotometria 19 di 24  Alessandra De Bruno Curva di taratura e limite di rivelabilità nella curva di taratura il segnale misurato è rapportato alla concentrazione. Il limite di rivelabilità consiste nella concentrazione o nella quantità di sostanza che dà un segnale di ampiezza doppia della deviazione standard riferita ad almeno 10 misure, cioè la concentrazione più piccola che può essere rivelata con il 95% di probabilità. Analisi strumentale: spettrofotometria 20 di 24  Alessandra De Bruno 6. I colorimetri Gran parte dei moderni spettrofotometri possono essere utilizzati come colorimetri, apparecchi che sono in grado di misurare le radiazioni approssimandosi alla sensazione visiva percepita dall’occhio umano. Lavorando su campioni trasparenti e in soluzione è possibile effettuare una scansione tra 380 e 780 nm, impostare l’osservatore standard e il tipo di sorgente (in genere 10° e D65, rispettivamente), ottenendo valori di coordinate cromatiche nel sistema CIE (Commision International d’Eclairage). Analisi strumentale: spettrofotometria 21 di 24  Alessandra De Bruno Il sistema CIE si basa sulla teoria secondo la quale in ogni colore sono presenti in diverse misure i valori RGB, detti TRISTIMOLO. Questi sono ricavati dalla curva di risposta dell’occhio di un osservatore sottoposto alla tripletta RGB. Ogni colore del sistema CIE è specificato dalla sua lunghezza d’onda e dai tre valori tristimolo definiti da X (rosso), Y (verde) e Z (blu). I tre colori sono miscelati in proporzioni diverse per formare i diversi colori CIE, in modo tale che la somma delle percentuali di X, Y e Z, dette coordinate trigonometriche, sia sempre pari ad 1 (X+Y+Z=1). Analisi strumentale: spettrofotometria 22 di 24  Alessandra De Bruno Per vedere un colore CIE si rappresenta un grafico dove sono riportati solamente i parametri X e Y, rosso sulle ordinate e verde sulle ascisse. Lo sviluppo lungo l’asse Z, dal bianco al nero, permette di inserire il fattore luminanza e quindi tutti i colori desaturi dal bianco al nero. I colori sono quindi identificabili grazie ad un sistema cartesiano di coordinate x, y ed eventualmente z. Analisi strumentale: spettrofotometria 23 di 24  Alessandra De Bruno Analisi strumentale: spettrofotometria 24 di 24