Metodi Tecnici di Chimica e Biochimica PDF - Lezione 1

METODI TECNICI DI CHIMICA E BIOCHIMICA Lezione 1 SERENA BONIN PRESENTAZIONE DEL CORSO Obiettivi del Corso Fornire le conoscenze di base sui metodi analitici di tipo chimico e biochimico impiegati nell’ambito della Laboratorio biomedico. Testo di Approfondimento: Ciaccio: Trattato di Biochimica...

METODI TECNICI DI CHIMICA E BIOCHIMICA Lezione 1 SERENA BONIN PRESENTAZIONE DEL CORSO Obiettivi del Corso Fornire le conoscenze di base sui metodi analitici di tipo chimico e biochimico impiegati nell’ambito della Laboratorio biomedico. Testo di Approfondimento: Ciaccio: Trattato di Biochimica Clinica e Medicina di Laboratorio-Ed EDISES, anno di pubblicazione 2021 Modalità d’esame: testo scritto (prova parziale) 2 PRESENTAZIONE DEL CORSO Teams del corso Codice: f8b88tp Materiale del corso File PowerPoint caricati nel canale Teams 3  CLASSIFICAZIONE DEL LABORATORIO BIOMEDICO SULLA BASE DELLA MATRICE BIOLOGICA Area siero e/o plasma (Li eparina oe/o plasma EDTA) Area ematologia (EDTA) Area coagulazione (Na citrato) Area Urine e altri materiali (altri contenitori) CLASSIFICAZIONE DEL LABORATORIO BIOMEDICO SULLA BASE DELLE ATTIVITÀ TECNICHE ANALITICHE/STRUMENTI IMPIEGATI Area di accettazione dei Area proteine campioni Area di tossicologia Area chimica clinica Area di microbiologia Area immunochimica Area di immunoematologia Area emocromocitometrico Area di biologia molecoare e/o citogenetica Area esami di coagulazione Altre Aree (autoimmunità, test funzionali…) LABORATORI PLURIDISCIPLINARI LABORATORI Area esami urine standard SPECIALISTICI 4  FUNZIONE DEL LABORATORIO BIOMEDICO Assistere il medico nella:  Diagnosi di una malattia  Prognosi  Scelta e monitoraggio della terapia  Screening Laboratorio X Attività clinica 5  LABORATORIO BIOMEDICO Genera numeri che diventano informazioni cliniche qualificate solo se ottenuti con ben determinati criteri. Questi dati sono il risultato di MISURAZIONI che sono il compito principale del tecnico sanitario di laboratorio biomedico. IL TECNICO DI LABORATORIO BIOMEDICO o Deve conoscere le variabili che possono influenzare una misura o Trattare in maniera corretta i campioni in esame o Conoscere le tecniche di misura manuale e i principi di funzionamento 6 degli strumenti di laboratorio  DEFINIZIONI DI METROLOGIA Misurazione: processo mediante il quale si arriva a descrivere quantitativamente una proprietà, grandezza, di una cosa o un fenomeno Misura: il risultato di un processo di misurazione formato da un insieme di tre dati (valore numerico, unità di misura e grado di incertezza) Grandezza: attributo di una cosa o di un fenomeno che può essere individuato qualitativamente o quantitativamente Misurando: grandezza oggetto della misurazione, che deve essere attentamente individuato e di cui è necessario definire lo stato (es T) Unità di misura: grandezza adottata per convenzione per esprimere quantitativamente grandezze aventi la stessa dimensione Incertezza di misura: stima caratterizzante il campo di valori entro 7 i quali cade il valore proprio più probabile del misurando (analisi statistica).  PROCESSO DI MISURAZIONE Individuazio ne del Scelta del Motivo della misurando metodo di Misurazione (definire il Misura suo stato) 8  METODO DI MISURA DIRETTI INDIRETTI ES. Potenziometria per Richiedono vari passaggi prima di misurare la ddp dovute a ottenere il segnale da misurare cariche elettriche di ioni È fondamentale conoscere le trasportati in soluzione relazioni fra i prodotti che si formano nelle reazioni durante le Abbassamento del punto reazioni che si sviluppano nei criogenico (osmolalità di un procedimenti di misura per poter campione) risalire, ad es, alla concentrazione misurando un segnale Permettono di ottenere Ogni passaggio porta con sé un risulati rapportabili tra loro grado di incertezzaImprecisione con bassa incertezza di totale misura. 9  METODI INDIRETTI La grandezza non è misurabile direttamente ma richiede l’utilizzo di reagenti specifici in grado di formare con la sostanza in esame dei prodotti conosciuti che portano con sé un segnale misurabile dagli strumenti di laboratorio. Mediante l’impiego di una strumentazione idonea, si rileva un segnale che viene trasformato in MISURA mediante un processo logico/pratico: LA CALIBRAZIONE Il rapport fra segnale e grandezza in alcuni casi è stabilito da reazioni chimiche o fisiche. Nell’ambiìto della spettrofotometria viene molto spesso impiegata la legge d LAMBERT-BEER 1 0  LEGGE DI LAMBERT-BEER Descrive i fenomeni di assorbimento delle radiazioni elettromagnetiche e sta alla base delle applicazioni di spettrofotometria. Supponiamo che una luce monocromatica di intensità I 0 colpisca una soluzione contenuta in una cuvette e sia I l’intensità della radiazione uscente Si definisce trasmittanza T il rapport fra l’intensità della radiazione uscente I (cioè quella che attraversa la soluzione) e quella della radiazione entrante I 0 (ovvero della sorgente) Si definisce assorbanza A abs il logaritmo in base 10 dell’inverso di T = 1 1  LEGGE DI LAMBERT-BEER Aabs e T sono correlate rispettivamente alla frazione di energia radiante assorbita o trasmessa dal campione (soluzione), quindi sono NUMERI PURI L’assorbimento di radiazioni elettromagnetiche è descritto dalla legge (sperimentale) di Bouguer-Lambert-Beer o legge di Beer  La legge di Beer è una legge generale a cui obbediscono i fenomeni di assorbimento di radiazione elettromagnetica  La dimostrazione della legge di Beer è stata sviluppata considerando come modello l’assorbimento di analiti in soluzione c I  È stato dimostrato che l’intensità I della radiazione I0 uscente dal campione è funzione : o della radiazione incidente I 0 o del cammino ottico b, ovvero delle lunghezza del b percorso che la radiazione fa all’interno della soluzione o dalla concentrazione dell’analita in soluzione 1 2  LEGGE DI LAMBERT-BEER = = è il coeffi ciente di assorbimento molare e dipende: o dalla della radiazione assorbita I0 c I o dal solvente o dalla specie chimica che dà l’assorbimento Quindi più correttamente la Legge di Beer si b scrive: = NON è noto, quindi questa tecnica è una TECNICA ANALITICA RELATIVA, poiché è necessario costruire una curva di taratura con soluzioni standard dell’analita 1 3  LEGGE DI LAMBERT-BEER il coeffi ciente di assorbimento molare (ε) rappresenta l’Assorbanza (o Densità Ottica) di una soluzione con concentrazione 1M e a cammino ottico unitario (1cm) Natura chimica Temperatura e solvente Lunghezza d’onda = La radiazione assorbita dipende dal cammino ottico in cui avviene l’assorbimento, dalla concentrazione delle molecole che assorbono, e come assorbe la sostanza e le condizioni in cui si trova. 1 4 ASSORBIMENTO IN FUNZIONE DEL CAMMINO OTTICO E DELLA CONCENTRAZIONE Assorbanza in funzione della lunghezza del cammino ottico La risposta dell’assorbanza in funzione della concentrazione è lineare solo in un intervallo di valori 1 5  UTILITÀ DELLA MISURAZIONE DELL’ASSORBIMENTO DI UNA SOLUZIONE Utilizzo pratico della legge di Beer Il coeffi ciente di assorbimento molare rappresenta la pendenza della retta di calibrazione Assorbanza vs. concentrazione (con cammino ottico unitario) 1 6 DIPENDENZA DELLA LEGGE DI BEER DALLA CONCENTRAZIONE Tipici spettri di assorbimento del MnO4 - a cinque diverse concentrazioni. I numeri adiacenti alle curve indicano la concentrazione del Mn in ppm. La specie assorbente è lo ione permanganato; il cammino ottico della cella è 1 cm. Il grafico dell’assorbanza alla λ del picco a 525 nm in funzione della concentrazione è lineare e quindi la relazione soddisfa la legge di Beer. 1 7  DEVIAZIONI DALLA LINEARITÀ DELLA LEGGE DI BEER FATTORI FISICI E CHIMICI o Concentrazioni troppo elevate. Si ha un cambiamento dell’indice di rifrazione della soln o Concentrazioni troppo elevate di assorbente (C > 0,01 M) o di elettrolita o Variazione del pH: HIn + H 2O H3O+ + In- o Temperatura. Può influire su un sistema in equilibrio chimico. o Soluzioni torbide. Effetto scattering della luce. 1 8  DEVIAZIONI DALLA LINEARITÀ DELLA LEGGE DI BEER FATTORI STRUMENTALI o Solo con radiazioni monocromatiche si verifica un’aderenza stretta alla legge di Beer. o Luce diffusa. La radiazione che esce dal monocromatore è contaminata da una piccola quantità di luce diffusa. o Rumori strumentali o Se S è l’intensità di luce “spuria” proveniente dallo strumento: o Se C è elevata, I tende a 0 L’errore influenza in modo maggiore l’assorbanza 1 9 APPLICAZIONI QUANTITATIVE DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO o Ampia applicabilità o Alta sensibilità: i limiti di rivelabilità variano da 10 -4 a 10-5 M e si può arrivare anche a 10 e 10 M con accorgimenti. -6 -7 o Selettività da moderata ad alta. o Buona accuratezza. Gli errori con apparecchiature e procedure normali sono dell’ordine del 1-5%; con precauzioni fino a 0.1%. o Facilità e convenienza. 2 0  SPETTROFOTOMETRO o Gli strumenti usati per misurare l’assorbimento della luce da parte di soluzioni sono detti spettrofotometri. o Hanno diversi elementi:  Sorgente di luce  Monocromatore  Compartimento campioni (porta cuvette)  Rivelatore  Indicatore del segnale Schema a blocchi di uno spettrofotometro 2 1  APPLICAZIONI QUANTITATIVE DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO o Selezione della lunghezza d’onda o Ottimizzazione variabili che influenzano l’assorbanza (es. pH, mascheramento interferenti) o Determinazione della relazione tra assorbanza e concentrazione con opportuno metodo di calibrazione o I calibratori in immunochimica vengono forniti con i kit per poter generare curve di calibrazione su più punti (calibrazione con standard esterno). 2 2  APPLICAZIONI QUANTITATIVE DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO o E’ di importanza fondamentale che la composizione degli standards sia il più vicina possibile a quella del campione incognito poiché’ soluzioni diverse possono dare tipi di interferenze che influenzano il segnale 2 3 APPLICAZIONI QUANTITATIVE DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO CHIMICA CLINICA 1. Le analisi di chimica clinica misurano le concentrazioni o le attività delle sostanze (ioni, molecole, complessi) presenti nei fluidi corporei. 2. Per le analisi si possono utilizzare diversi tipi di fluidi corporei, ad esempio sangue intero, plasma, siero, urine e liquido cerebrospinale. 3. L'interpretazione medicale dei risultati delle analisi si basa sul confronto rispetto a un intervallo di riferimento, che riflette la gamma dei valori previsti per gli individui sani o un livello 2 deciso dai medici (MDL) per la diagnosi e il trattamento della 4  CHIMICA CLINICA La chimica clinica è una scienza quantitativa che si occupa della misurazione delle quantità di sostanze biologicamente rilevanti (denominati analiti) presenti nei fluidi corporei. I metodi per la misurazione di queste sostanze sono progettati in modo rigoroso allo scopo di fornire valutazioni accurate della loro concentrazione. 2 5  CHIMICA CLINICA La chimica clinica è la branca della medicina di laboratorio che si occupa principalmente delle molecole. Le analisi in un laboratorio di chimica clinica consentono di misurare le concentrazioni di ioni biologicamente significativi (sali e minerali), piccole molecole organiche e macromolecole (soprattutto proteine). 2 6  CHIMICA CLINICA ANALITI PIÙ COMUNI 2 7  SERENA BONIN Dip. Di Scienze Mediche, Chirurgiche e della Salute [email protected] www.units.it