Kolorimetri - Doç. Dr. Kamile Yücel PDF

KOLORİMETRİ Doç. Dr. Kamile YÜCEL  Analiz yöntemleri Analitik teknikler modern klinik laboratuvarlarda yapılan tüm ölçümlerin temelini oluşturur. 1) Işık şiddetinden faydalanarak yapılan ölçümler -Kolorimetri -Fotometri -Alev fotometresi (flame fotometre) ile ölçüm...

KOLORİMETRİ Doç. Dr. Kamile YÜCEL  Analiz yöntemleri Analitik teknikler modern klinik laboratuvarlarda yapılan tüm ölçümlerin temelini oluşturur. 1) Işık şiddetinden faydalanarak yapılan ölçümler -Kolorimetri -Fotometri -Alev fotometresi (flame fotometre) ile ölçüm -Atomik absorpsiyon spektrofotometresi (AAS) ile ölçüm 2) İyon selektif elektrotlar (ISE) yardımıyla ölçüm 3) Nefelometri ve türbidimetri 4) Florometri 5) İmmünokimyasal yöntemler 6) Elektroforez 7) Kromatografi  Giriş Foton: Işığın temel birimine, parçacığına foton denir. Atom e-’larının salınımı ile e-’lar bir orbitalden diğerine hareket ederek enerji absorblar veya geri verir. Elektromanyetik ışımayı absorbe ederek en düşük enerji düzeyinden (temel düzey), uyarılmış düzeylere geçmiş olan atomlar, temel düzeye dönüş sırasında ultraviyole veya görünür bölge sınırları içinde ışıma enerjisi yayarlar (emisyon) ve bu ışıma son derece spesifiktir. Işın: Dalgalar halinde yayılan ve belli bir enerjisi olan fotona ışın denir. Bir maddenin rengi dediğimiz şey o maddeden gözümüze ulaşan ışınlardır. Beyaz ışık, farklı dalga boyu ve farklı renklere sahip ışınların bir bileşimidir.  Giriş Dalga Boyu: Birbirini takip eden dalgaların aynı noktaları (örneğin tepe noktaları) arasındaki uzaklık dalga boyudur. Dalga boyu uzadıkça frekans azalır. Işığın farklı dalga boyları, onları farklı renkte algılamamızı sağlar. Beyaz ışıkta tek bir dalga boyundan bahsedilmez. Beyaz ışık farklı dalga boyu ve renklere sahiptir. Daha kısa aralıklı tepe noktaları daha kısa dalga boylarını ve ışığın daha fazla enerji içerdiğini gösterir. Giriş Dalga boyu; uzunluk birimleri cinsinden ifade edilir. Genel olarak Angstrom (λ) ile ifade edilebilmesine rağmen, spektrofotometrik ölçümlerde daha çok nanometre (nm) mikrometre (µm), veya milimikron (mµ) tabirleri kullanılır. 1 nm=10Ao  Giriş Elektromanyetik Işıma: Uzayda çok büyük hızla hareket eden bir enerji türüdür. Elektromanyetik ışımanın en çok karşılaşılan türleri, gözle algıladığımız görünür ışık ve ısı şeklinde algıladığımız infrared ışınlarıdır. Elektromanyetik ışınlar dalga boylarına göre farklı adlarla anılırlar: Yaklaşık olarak; 180-380 nm ……….ultraviyole (UV) (mor ötesi) 380-750 nm ……….visible light (görünür) 750-2000 nm ……….infrared (IR) (kızıl ötesi) Frekans ve dalga boyu arasında zıtlık vardır. Dalgalar, fotonlar gibi partiküllerle yayılır. Gama ve X-ray → kısa dalga boyu Radyo dalgaları → uzun dalga boylu UV, görünür ve infrared  Bir maddenin rengi Bir maddenin rengi, o maddeden gözümüze ulaşan görünür bölgedeki elektromanyetik ışınlardır. Bu ışın saydam maddeler için içinden geçip gelen, saydam olmayanlar içinse yansıyan ışınlardır. Işınların bir kısmının madde tarafından tutulması, geri kalan ışınların beyaz ışık olma özelliğini kaybetmesine, tutulan ışınların dalga boyuna göre bir renk olarak algılanmasına sebep olur. İşte madde tarafından tutulan ışınların rengi ile maddenin görünür rengini oluşturan ışınların rengi, tamamlayıcı renkler olarak adlandırılır. Yani maddelerin rengi, maddelerin tuttuğu ışının tamamlayıcısı olan (yansıttığı) ışının rengidir.  Maddelerin rengi, maddelerin tuttuğu ışının tamamlayıcısı olan ışının rengidir Renk, O maddeden gözümüze ulaşan görünür (380-750 nm) bölgedeki elektromanyetik ışınlardır ışınlar  Işık  (nm) Absorbe edilen Görünen renk renk (Tamamlayıcı) 220-380 (UV) - - 380-440 Menekşe Sarı-yeşil 440-475 Mavi Sarı 475-495 Yeşil-mavi Portakal 495-505 Mavi-yeşil Kırmızı 505-555 Yeşil Mor 555-575 Sarı-yeşil Menekşe 575-600 Sarı Mavi 600-620 Portakal Yeşil-mavi 620-700 Kırmızı Mavi-yeşil UV ve görünür ışık formları klinik biyokimya lab.’larında daha çok kullanılır. Çözelti içindeki madde miktarını ölçmek için de bu prensiplerden faydalanılır.  Işık şiddetinden faydalanarak yapılan ölçümler a-Kolorimetri b-Fotometri c-Alev fotometresi (flame fotometre) ile ölçüm d-Atomik absorpsiyon spektrofotometresi (AAS) ile ölçüm 1. Işık Şiddetinden Faydalanılarak Yapılan Ölçümler A. Kolorimetri: Çözelti içindeki madde miktarını, çözeltinin renginden faydalanarak ölçme işlemine kolorimetri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da kolorimetre denir. Kolorimetrik ölçümde, konsantrasyonu ölçülecek çözeltinin rengi değişik konsantrasyonlardaki standartların rengiyle karşılaştırılarak değerlendirilir. Bu karşılaştırma gözle yapıldığında hassas bir ölçüm yapılamaz. Bu yüzden günümüzde bunun yerini ışıkla yapılan ölçümler almıştır. Bu ölçüm yönteminde renksiz maddelerin ölçüm şansı yoktur. 1. Işık Şiddetinden Faydalanılarak Yapılan Ölçümler B. Fotometri: Çözelti içindeki madde miktarını ölçmek için, çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanılır, bu tip ölçüm yapan cihazlara fotometre denir. Yani fotometreler, fotoelektrik kolorimetrelerdir. Fotometrelerde; ◊ hem ışığın tüm bölgelerinde (UV, görünür, IR) ölçüm yapılabilir, ◊ hem de renk yerine ışık ölçüldüğü için renksiz çözeltiler de ölçülebilir. Bir çözeltiden ışık karşı tarafa geçerken bu geçen ışığı neler azaltır?  Lambert-Beer Kanunu Maddelerin rengi, maddelerin tuttuğu ışının tamamlayıcısı olan ışının rengidir. Bu olayın temelleri BEER ve LAMBERT tarafından atılmıştır. Lambert (1760) bir çözeltiden geçen ışık miktarının, ışığın çözelti içinde katettiği yolla logaritmik olarak ters orantılı, Beer (1952) ise çözeltiden geçen ışık miktarının çözeltideki madde konsantrasyonu ile logaritmik olarak ters orantılı olduğunu ortaya koymuştur.  Lambert-Beer Kanunu Bu her iki kanun birlikte Lambert-Beer kanunu olarak bilinir. Kısaca Lambert-Beer kanununa göre, bir çözeltiden geçen ışık miktarı, ışığın çözelti içinde kat ettiği yol ve çözelti konsantrasyonu ile logaritmik olarak ters orantılı, emilen ışık miktarı ise doğru orantılıdır. Solüsyona gelen ışık şiddetiyle, solüsyondan çıkan ışık şiddeti arasında Lambert-Beer kanunu gereği matematiksel bir ilişki vardır.  Lambert-Beer Kanunu Beer kanunu; Absorbans ve solüt konsantrasyonu arasındaki ilişkinin ifadesidir. Konsantrasyon arttıkça absorbans artar. Lambert kanunu; ışık yolu uzadıkça (solüsyonun derinliği arttıkça) absorbans artar. İkisi kombine edilerek bir eşitlik oluşturulmuştur.  Çözeltiye gelen ışığın tutulması→ Absorbsiyon Absorbans → Emilen ışık miktarı Çözeltiye gelen ışığın çözeltiden geçişi →Transmisyon Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin, çözeltiye giren ışık şiddetine oranı (I/Io), transmittans (T) (geçirgenlik) olarak tanımlanır. Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak ifade edilir. Çözeltiye giren ışığın yüzde kaçının çözeltiden çıktığını hesaplamak için % Transmittans kullanılır. Işığın bir kısmı emilir ve geri kalanı geçerek ışık dedektörüne gönderilir. Tüm ışık emilirse T= 0 olur. Bir küvet içine konmuş renkli bir çözeltiden çıkan ışık şiddeti (I), çözeltiye giren ışık şiddetinden (Io) daha küçüktür. Lambert-Beer kanunu: Bir çözeltiden geçen ışık miktarı, ışığın çözelti içinde katettiği yol ve çözelti konsantrasyonu ile logaritmik olarak ters orantılı, emilen ışık miktarı ise konsantrasyon ile doğru orantılıdır. Yani Bu kanuna göre absorbans (emilen ışığın miktarı) ile konsantrasyon doğru orantılıdır. Absorbans (A)= a.b.c a→ molar absorpsiyon katsayısı (ışığın dalga boyuna ve maddeye bağlı olan sabit değer) b→ ışığın çözelti içinde katetiği yol (ışık yolu) (Genelde 1cm) c→ çözelti konsantrasyonu (mol/L)  Absorbans (A)= a.b.c Işık yolu (b) ve molar absorbsiyon katsayısı(a) sabit değerler olduğundan çözeltideki madde konsantrasyonu ile ışığın çözelti tarafından tutuluşu doğrudan ilişkilidir denir. Absorbans ne kadar çoksa transmittans o kadar azdır. Aralarında negatif logaritmik ilişki vardır. Transmittans (T)= I (çıkan)/I0 (giren) %Transmittans (%T)=100 T Absorbans (optik dansite, O.D.)= -log10T  Absorbans, transmittansın negatif logaritmasıdır. Absorbans= optik dansite= A 1 I A= log = - logT = - log T Io Bir çözeltinin konsantrasyonu Absorbans (A) % transmittans Içıkan/Iogelen transmittans denir ve T ile gösterilir Transmittansın negatif logaritmasına= -logT =OD (Absorbans) denir. %Transmittans = Çözeltiye giren ışığın % kaçının çözeltiden çıktığını gösterir. Yüz ile çarpılırsa 100.T=%T log alınırsa -logT=log1/T Burada T’ yi %T ye çevirirsek 100 ile çarpılacağından log 100/%T=log100+log1/%T Burda Log 100=2 dir 2+log 1/100T=2-log%T sadeleştirirsek 2 - log %T=O.D (Absorbans)  A (OD)=2 -log %T %T 100 ise A=2-2=0 %T 10 ise A=2-1=1 %T 1 ise A=2 -0=2 %T 0,1 ise A=2-(-1)=3 Rutinde A’ın 0-2 arasındaki kısmı kullanılır.  OD (absorbans) ile %T arasında negatif bir ilişki vardır. %T OD (optik dansite) (absorbans) 0 konsantrasyon 0 konsantrasyon %T (transmittans) çözeltiye giren ışığın yüzde kaçının çözeltiden çıktığını gösterir. Fotometrik bir ölçüm yapılacağı zaman maximum hassasiyet sağlamak için aranan madde tarafından maksimum absorbe edilen dalga boyundaki ışık kullanılır. Bunun için o maddenin 1 molar çözeltisinin çeşitli dalga boylarındaki absorbans değerleri ölçülür. En yüksek ölçümün elde edildiği dalga boyu o maddenin en iyi ölçüldüğü dalga boyu olarak kullanılır. Aslında ölçümün yapıldığı dalga boyu çözeltinin renginin tamamlayıcısı olan rengin dalga boyudur.  Fotometre ve Spektrofotometre Farkı Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak ayıran ve gönderen aletler fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar.  Spektrofotometre Işık kaynağı ve prizma ile bir dedektör arasına yerleştirilen renkli maddenin, ışık spektrumunun bazı renklerini absorblaması ve konsantrasyona göre bu spektrumda değişiklik göstermesi özelliğine dayanan miktar tayin yöntemidir. Spektrofotometreler Atomlar, elektromanyetik ışımayı absorbe ederek en düşük enerji düzeyinden (temel düzey) uyarılmış düzeylere geçerler; bu geçişlerle ilgili olarak söz konusu atomun absorpsiyon spektrumları da belirlenmiştir. Fotometre ve kolorimetre cihazlarından daha gelişmiş olup, istenilen tek bir dalga boyunda ışık bir prizma aracılığıyla % 1 hassasiyet ile seçilebilmektedir. Biyolojik moleküller ışığı absorbe edebilirler, kırabilir, dağıtabilirler yada polaritesini değiştirebilirler. Spektrofotometerler ışık absorbansını ölçmek için kullanılırlar.  Spektrofotometre Çözelti içeriğindeki maddenin miktarının bulunmasında kullanılır. Temel mantığı, hazırlanan çözeltiden belirli spektrumlarda ışık geçirilmesi ve bu ışının ne kadarının çözelti tarafından absorblandığının (soğurulduğunu) bulması esasına dayanır. Çözeltinin içerdiği madde miktarı ne kadar fazla ise daha fazla ışın, çözelti tarafından soğurulur. Spektrofotometre, çözeltinin içinden geçebilen (çözelti tarafından absorblanmayan) ışığın yoğunluğu tespit ederek çözelti içeriğindeki aranan maddenin miktarı hakkında kantitatif bilgi verir. Örneğin, farklı sıcaklıklarda bakterilerin gelişiminin gösterilmesi için çeşitli ortamlara bırakılan bakteriler daha sonra çözeltiler içinde teker teker spektrofotometre ile ölçüldüğünde bakterilerin fazla olduğu örnekte daha fazla absorblanma gözlenecektir. Dolayısıyla bu da bize ortamdaki sıcaklığa bağlı bakteri büyüme hızı ile ilgili bilgi verir. Sonuçta, daha fazla bakteri daha fazla madde demektir ve bu da absorbsiyonun daha fazla olması anlamına gelir.  Spektrofotometreler Spektrofotometreler, maddenin renk yoğunluğunun ölçülmesiyle, madde miktarının veya konsantrasyonunun bulunmasını sağlayan cihazlardır. Spektrofotometrelerde kullanılacak ışık, çözeltinin kuvvetli absorbladığı dalga boyunda seçilir; örneğin kırmızı renkli sıvı için yeşil dalga boyunda (yeşil renkli sıvı için kırmızı dalga boyunda), mavi renkli sıvı için sarı dalga boyunda, sarı renkli sıvı için mavi dalga boyunda ışık seçilir. Bir spektrofotometre düzeneği, başlıca ışık kaynağı, dalga boyu seçicisi (monokromatör-prizma), dedektörden oluşur; dedektörde elektrik sinyaline çevrilen optik sinyal bir kaydedici veya bir galvanometre ile ölçüm yapılır. Fotometredeki bileşenlere ek olarak spektrofotometrede ışığı toplamak, odaklamak, yansıtmak, bölmek, ve numune üzerine belli bir şiddette göndermek amacıyla mercekler, aynalar, ışık bölücüleri, giriş ve çıkış yarıkları, prizmalar vardır. “tek” multi-dalga dalgaboyunda boyunda ışık ışık Prizma Işık Kaynağı Küvet Sıvı içeren Fotodetektör  Spektrofotometrenin Küvetten geçen ışığın şiddetini ölçer. komponentleri; Işık kaynağından gelen detektör beyaz ışıktan uygun dalga küvet boyunu seçip, diğerlerini elimine eder. Mercek Çıkış yarıklı levhası veya prizma sistemidir Cam veya monokromatör plastik numune okutma Giriş yarıklı levhası kaplarıdır. Monokromatörden çıkan ışınlardan istenilen dalga Işık boyundaki kısım geçirilir, kaynağı diğerleri tutulur. Işık kaynağından çıkan dağınık Tungsten lamba, civa ark, ışıkları monokromatöre yönlendirir. hidrojen ve döteryum lambaları  Spektrofotometre Bölümleri a. Işık kaynağı: UV-görünür bölgede tungusten lambası, civa ark, D2 döteryum ve H2 lambası gibi sürekli ışık kaynakları kullanılır. Tungsten lambaları yaygın kullanılır. Tungsten lambasının içinde bir miktar iyot veya brom buharı bulunursa lambanın ömrü artar ve bu lamba tungsten-halojen lambası olarak adlandırılır. Ultraviyole bölgede en çok kullanılan lambalar, hidrojen ve döteryum elektriksel boşalım lambalarıdır. Bu lambalar 180-380 nm arasında ışık yayar. Daha pahalı ve daha uzun ömürlü olan D2-döteryum lambasının yaydığı ışığın şiddeti H2 lambasına göre çok daha fazladır.  Spektrofotometre Bölümleri b. Dalga boyu seçicileri (monokromatörler), ışık kaynağından gelen polikromatik ışıktan uygun tek bir dalga boyunda monokromatik ışık elde edilmesini gerçekleştiren düzeneklerdir. Monokromatör bir mercek veya prizma sistemidir. Monokromatör, filtreli fotometrelerde ışık filtresidir; spektrofotometrelerde ise ışık prizmasıdır. Örnek üzerine gönderilen ışığın daha monokromatik olmasını sağlamak için bazı spektrofotometrelerde çift monokromatör kullanılır.  Spektrofotometre Bölümleri c. Işık filtreleri, camdan yapılmış ve uygun boyalarla boyanmış filtrelerdir. Portatif olup kullanıcı istediği zaman uygun dalga boyundaki filtreyi cihaza takar. Filtrelerin üzerinde geçirdikleri dalga boyu yazılıdır. Filtrenin rengi, ölçüm yapılacak çözeltinin rengine göre seçilir; örneğin, mavi ışığı tutan (sarı) bir maddenin ölçümünde sadece mavi ışığı geçiren filtre kullanılır. Işık prizmaları, cam veya kuartz olabilir. Özellikle düşük UV ışınları iyi geçirmediğinden cam prizma görünür bölge için uygundur. Kuartz prizmalar ise hem UV ışınlarını iyi geçirir, hem de görünür ışık ve IR’e yakın bölgelerde çalışmaya elverişlidir. Kuartz prizmalar pahalı spektrofotometrelerde bulunur. Prizmalar sayesinde prizmadan geçen ışık hem prizmaya girerken hem de çıkarken kırılmaya uğrar ve renk spektrumlarına ayrılır. Bu spektrumda istenen dalga boyundaki kısım özel düzenekler sayesinde, incelenecek solüsyonun bulunduğu okuma küvetine yönlendirilirken diğerleri soğurulur.  Spektrofotometre bölümleri d. Küvet: Yuvarlak bir tüp veya dört köşe olabilir. Dört köşeli olanları daha doğru ölçüm yapılmasını sağlar. Küvetler, soft veya borosilikat camdan, kuartz veya plastikten yapılır. Kuartz küvetler kullanım için idealdir fakat pahalıdır. Okuma sırasında küvetin cihaza hep aynı pozisyonda yerleştirilmesi kullanıcının dikkat etmesi gereken önemli bir husustur. Aksi halde ölçüm hatasına sebep olur. Örnek numune, kullanılan dalga boyu bölgesinde ışığı geçiren maddeden yapılmış örnek kaplarına (küvet) konularak ışık yoluna yerleştirilir. Spektrofotometre bölümleri e. Dedektör, maddenin ışığı absorblayıp absorblamadığını anlamak için ışık kaynağından gelen ışığın şiddetinin ölçülmesi amacıyla kullanılan düzenektir. UV-görünür bölgede kullanılabilen fototüp, fotosel dedektörler vardır. Bunlar üzerine düşen ışık elektrik akımına dönüştürülür. f. Galvanometre: Dedektörde oluşan elektrik akımını ölçer. Gösterge de galvanometredeki elektrik akımını %T veya absorbans olarak rakamsal olarak ifade eder. Tek ışık yollu spektrofotometrelerde, bileşenlerin tümü aynı ışık yoluna yerleştirilmiştir. Çift ışık yollu spektrofotometrelerde, monokromatörden çıkan ışık, eşit şiddette iki demete bölünerek biri örneğe diğeri sadece çözücünün bulunduğu kaba gönderilir. İkiye ayrılan ışık, iki ayrı dedektörle algılanır ve dedektörlerde oluşan sinyallerin oranı ölçülür. Böylece örnekteki geçirgenlik değeri sürekli olarak çözücününki ile karşılaştırılmış olur. Çift yollu spektrofotometreler daha hassas, daha çok kullanılır ve monokromatör kaynaklı hataları en aza indirir. Fakat tek yollu spektrofotometrelere göre fiyatları pahalıdır. Küvetlerin temizliği: -Küvetler kullanıldıktan hemen sonra bol çeşme suyu ve ardından distile sudan geçirilmelidir. -Aşırı kirlenen veya koyu renkli reaktiflerin okunduğu küvetler yumuşak deterjanlı su, çeşme suyu ve distile su ile yıkanmalıdır. Kesinlikle fırça kullanmamalıdır. -Deterjanla temizlenemeyen küvetler, %20’lik nitrik asitte bir gece bekletildikten sonra, distile sudan geçirilip kullanılır. -Küvet temizliğinde bikromat solüsyonu kullanılmamalıdır. %10’luk NaOH kullanılabilir; ancak küvetler bu çözeltide uzun süre kalmamalıdır.  Spektrofotometrik Ölçümün Yapılışı Spektrofotometrik ölçümlerde kör, standart ve numune olmak üzere üç tüp hazırlanır. 1. Kör, cihazın optik ayarlarının yapılması amacıyla kullanılan çözeltidir. Fotometrik ölçümlerde cihazın optik ayarının yani %T nin 0 ve 100 ayarlarının yapılması gerekir. Bunun deney öncesi yapılması zorunludur. Bu işleme kör ayarı, bu amaçla kullanılan numuneye de kör adı verilir. Kör çözeltisi olarak distile su veya reaktifin kendisi kullanılır. Bazı ölçümlerde numune körü de kullanılabilir. Kör ayarının temel amacı okuma küveti, solvent ve aranan madde hariç reaktif ve numunedeki diğer maddelerden kaynaklanan non-spesifik absorbsiyonların tespit edilerek analiz ölçümüne etkilerini sıfırlamaktır. Kısaca kör içinde aradığımız madde dışındaki maddelerin bulunabileceği, cihazın sıfır ayarının yapılmasında kullanılan çözeltilerdir.  Distile su körü, okuma küvetine distile su konularak hazırlanır. En sık kullanılan kördür. Daima absorbans değerinin sıfırlanması için kullanılır. Reaktif körü: Deneyde kullanılan reaktif kullanılarak hazırlanan kördür. 2. Standart, aranan maddenin bilinen konsantrasyondaki çözeltisidir. Bir veya birden fazla olabilir. Özellikle lineer olmayan reaksiyonlarda çok sayıda standart kullanılarak konsantrasyon-optik dansite grafiği çizilmelidir. 3. Numune, içindeki madde miktarını tayin etmek istediğimiz çözeltidir. Her 3 tüpe ait absorbanslar spektrofotometre ile ölçülür.  Spektrofotometrenin çalışma prensibi: *Lamba tarafından yayılan ışın demeti monokromatör (prizma) yardımıyla tek bir dalga boyundaki ışına (monokromatik ışına) dönüştürülür. *Bu ışın örneğin içinde bulunduğu odaya girer. Ölçümü yapılacak örnek, KÜVET içine konulur. *Örnekten geçen ışığın şiddeti detektör tarafından algılanır ve kaydedici ya da yazıcıya elektrik sinyali şeklinde gönderilir. SpektroFotometrik ölçümler, esas olarak iki tipte yapılır. Bunlar, end point ve kinetik okumadır. End point okumada ölçüm, reaksiyon tamamlandıktan sonra yapılır. Bunun için reaksiyon karışımı belli bir süre ve belli bir sıcaklıkta inkübe edilir. Reaksiyon tamamlanıp ürünlerin oluşumu ve dolayısıyla renk oluşumu tamamlandıktan sonra okuma yapılır. Kinetik okumada birim zamandaki absorbans değişimi ölçülür. Genellikle enzimlerin katalitik aktivitelerinin ölçümünde kullanılır. Hesaplama için deney ortamındaki kromojen maddenin molar absorpsiyon katsayısının bilinmesi gerekir.  a= molar absorbsiyon kat sayısı (sabit) b= ışığın çözelti içinde katettiği yol cm (sabit) Beer kanunu=Absorbans=a.b.c c= çözelti konsantrasyonu mol/L A (standardın absorbansı)=a.b.c (standardın konsantrasyonu) Numune içinde aynı şey geçerlidir. A (numunenin absorbansı)= a.b.c (numunenin konsantrayonu) a.b’ler ortaktır buradan standart ve numune için eşitlik çıkarırız A standart = A numune C standart C numune Buradan numune konsantrasyonu C numune= A numune x C standart eşitliği elde edilir. A standart  N.O.D (ABSORBANSI)-(Körün Abs) * Numunenin konsantrasyonu =--------------------------------------------------------x Std. konsantrasyonu S.O.D (ABSORBANSI) -(Körün Abs) NOD: Numunenin optik dansitesi- absorbansı SOD: Standardın optik dansitesi-absorbansı  Örnek Standart: Belli bir konsantrasyona sahip KMn04 (potasyum permanganat) çözeltisi Numune: Konsantrasyonu bilinmeyen KMnO4 çözeltisi Kör: Saf su Soru: 525 nm dalga boyunda, standart, numune ve kör tüplerinin absorbansları sırasıyla 0.310, 0.160, 0.010’dur. Standart tüpteki KMnO4 konsantrasyonu 10 ng/ml dir. Numune tüpündeki konsantrasyon nedir? Örnek Soru: 525 nm dalga boyunda, standart, numune ve kör tüplerinin absorbansları sırasıyla 0.310, 0.160, 0.010’dur. Standart tüpteki KMnO4 konsantrasyonu 10ng/ml dir. Numune tüpündeki konsantrasyon nedir.? Cevap: Önce körün absorbansı standardın ve numunenin absorbansından çıkarılır. Daha sonra Lambert beer kanununa göre doğru orantı kurulur. 10 ng/ml lik KMnO4 te absorbans 0.300 ise, 0.150 absorbansı veren çözeltide KMnO4 konsantrasyonu nedir Cevap: 5 ng/ml  Otoanalizörler Otomatik bir spektrofotometre, otoanalizördür. Otoanalizör, numune ve reaktifleri uygun ölçülerde alıp karıştırır, belirli süre ve ısıda inkübe eder, gerekli sürelerde optik okumaları yapıp sonunda ilgili analiz sonucunu hesaplanmış olarak kullanıcıya sunar. Bir otoanalizörün birim zamanda (1 saat) yapmış olduğu test sayısı önemlidir. Saatte onlarca hatta binlerce test yapan cihazlar vardır. Bir hastanın acil çalışılması gerekirse, cihaza hasta serumu yüklendikten sonra, ACİL komutu verilerek öncelik acil hastasına verilebilir. 1. Işık Şiddetinden Faydalanılarak Yapılan Ölçümler C. Alev fotometresi (flame fotometre) ile ölçüm Bir atomun elektronları ısı etkisi ile uyarılabilirler. Bu şekilde daha üst bir enerji seviyesine çıkmış olan bu elektronlar eski enerji düzeyine dönerken aradaki enerji farkını ışık olarak yayarlar. Bu ışınlar her bir element için spesifiktir. Uygun bir dalga boyunda bu ışınların fotometrik ölçümü yapılırsa ortamdaki madde miktarıyla orantılı ışıma nedeniyle madde konsantrasyonu belirlenmiş olur. Alev üzerine çözelti çok küçük damlacıklar halinde (sis şeklinde) püskürtülür. Na ve K kolay uyarılabildikleri için bunların ölçümünde çok kullanışlıdır. 1. Işık Şiddetinden Faydalanılarak Yapılan Ölçümler D. Atomik absorpsiyon spektrofotometresi (AAS) ile ölçüm Temel prensibi alev fotometresinin tersidir. Bunda element uyarılmaz, sadece kimyasal bağından ayrılır ve iyonlaşmamış nötral atom durumunda bulunur. Bu halde ışığı absorbe etme kapasitesindedirler. Alev fotometresinde uyarılmış atomun saldığı ışın ölçüldüğü halde, AAS’nde atomun tuttuğu ışın ölçülür. Bu cihazlarla biyolojik sıvılarda bulunan Fe, Cu, Zn, Co, Pb, Li gibi eser elementler ölçülür. 2. İyon selektif elektrotlar (ISE) yardımıyla ölçüm Özel elektrotlar yardımı ile numunelerde iyon farkının bir membranda (zarda) meydana getirdiği potansiyel farkı ölçülür. Böylece numunelerdeki madde konsantrasyonu tayin edilir. Ölçülen her bir element için ayrı bir elektrot vardır. Başta Na, K, Ca, Cl va Li olmak üzere pek çok elektrolitin (iyonun) tayininde geliştirilmiş bir yöntemdir.  3. Nefelometri ve Türbidimetri İkisi de Bulanıklığın ölçümü esasına dayanan yöntemlerdir. Türbidimetride, çözeltiye gelen ışık şiddetinde çözeltideki partiküllerin neden olduğu saçılmadan dolayı ortaya çıkan ışık kaybı ölçülür. Bunun için, absorbsiyonun olmadığı dalga boyundaki ışık ve fotometreler veya kolorimetreler kullanılır. Deney ortamının bulanık olması durumunda, ışık kaynağından çıkan ışınların tamamı fotosele (dedektör) ulaşamaz. Fotosele ulaşan miktar, ortamın bulanıklığı ile ters orantılıdır. Bundan faydalanılarak bulanıklığa sebep olan madde konsantrasyonu hesaplanır. Bulanık çözeltiden geçen ışık ölçülür. Bu metod genelde, numunedeki proteinlerin ölçümünde kullanılır. Proteinler denatüre edilerek bulanıklık oluşturulur. Bulanıklık, ortamdaki protein konsantrasyonu ile doğru orantılıdır  3. Nefelometri ve Türbidimetri Nefelometride, çözeltideki partiküllerce geliş eksenine göre 90o açıyla yerleştirilmiş olan fotosele doğru saptırılan ışınlar ölçülür. Çeşitli açılarda saçılan ışınları ölçen farklı tip nefelometreler vardır. Türbidimetriden diğer farkı, partikül sayısı arttıkça türbidimetride % T azalırken, burada artar. Bulanık çözeltinin dağıttığı ışık ölçülür. %T: çözeltiye giren ışığın yüzde kaçının çözeltiden çıktığını gösterir (% transmittans).  4. Fluorometri Bazı bileşikler, ışık (enerji) absorbe ettiklerinde uyarılırlar; elektronları düşük enerji seviyesinden yüksek enerji seviyesine çıkarlar. Sonra bu elektronlar eski enerji seviyelerine veya onun biraz üstündeki bir seviyeye dönerler ve dışarıya ilk aldıkları enerjiye eşit veya biraz daha az enerjiyi ışık tarzında salarlar. Bir maddenin bir çözeltide çok küçük konsantrasyonlarda bile UV etkisi altında kuvvetli fluoresans verme özelliklerine dayanan miktar tayin yöntemidir. Fluorometride, fluorometre denilen cihazlarla madde konsantrasyonu, fluoresans ışımanın ölçümü ile tayin edilir.  5. İmmünokimyasal yöntemler Düşük konsantrasyonlu maddelerin ölçümünde kullanılan yöntemlerdir. Bu yöntemlerin ortak noktası, ölçülecek maddeye karşı bir antikor içermesi ve ortamda bir işaretleyici olmasıdır. Deney sonunda bu işaretleyicilerin miktarı ölçülerek madde miktarı hesaplanır. Radyoimmünoassay (RİA) yönteminde işaretleyici olarak radyoaktif madde kullanılır. Fluoresan immünoassay (FİA) yönteminde işaretleyici olarak fluoresan madde kullanılır. Luminoassay ve kemilüminoassay (LİA) yönteminde işaretleyici olarak luminesan madde kullanılır. Enzimimmünoassay (EİA) yönteminde işaretleyici olarak enzim kullanılır.  6. Elektroforez Elektroforez, yüklü partiküllerin bir elektrik akımının etkisiyle birbirinden ayrılması işlemidir. Elektroforez için dört şeye ihtiyaç vardır: -iyonların hareket edebileceği uygun bir ortam (destek ortamı) -elektriksel alanı oluşturmak için doğru akım sağlayacak güç kaynağı -uygun pH’da bir tampon çözelti -birbirinden ayrılan bantları kantitatif olarak değerlendirebilen dansitometre. Elektroforez çeşitleri: -Kağıt elektroforezi -Agaroz jeli elektroforezi -Selüloz asetat elektroforezi -Poliakrilamid jel elektroforezi -Nişasta jeli elektroforezi -Kapiller elektroforez  7. Kromatografi Kromatografi, herhangi bir karışımdaki maddelerin biri sabit diğeri hareketli olan iki ayrı çözücüye karşı olan fizikokimyasal özelliklerinden faydalanılarak birbirlerinden ayrılmaları işlemidir. Hareketli faza göre gaz kromatografi ve sıvı (likit) kromatografi olarak sınıflandırılır. Yüksek performanslı likit kromatografi (HPLC), normal sıvı kromatografi cihazının gelişmişidir. Ayrıştırma işlemi için ya ince tabakalar veya kağıt ya da kolonlar kullanılır.