Spettrofotometria UV-Vis: Principi Fondamentali

Spettrofotometria: Principi Teorici

• La spettrofotometria si basa sul riconoscimento di una specie chimica in seguito a una sua modificazione energetica.
• Uno o più atomi vengono eccitati da una radiazione, assorbendo fotoni e subendo transazioni elettroniche o movimenti vibrazionali o rotazionali.

Spettrofotometria UV-VIS

• È una delle metodiche analitiche più diffuse e utilizzate in campo alimentare.
• Si tratta di una tecnica molto versatile, adattabile per determinare numerosi analiti.
• La spettrofotometria UV-Visibile si basa sull'assorbimento di radiazioni elettromagnetiche monocromatiche del campo del visibile e dell'UV.
• La radiazione UV-VIS rappresenta solo una piccola parte dello spettro elettromagnetico.
• L'ultravioletto (UV) si trova tra 10 e 400 nm, ma in spettroscopia si usa l'intervallo 200-400 nm.
• La regione del visibile è tra 400 e 800 nm, con 400 nm come la radiazione più energetica (blu-violetto) e 800 nm come la radiazione meno energica.(rosso)
• La spettrofotometria UV/Visibile misura l'assorbimento selettivo di radiazioni tra 10 nm e 780 nm.
• Tale gamma spettrale si suddivide in UV lontano (10 - 200 nm), UV vicino (200 - 380 nm) e Visibile (380 - 780 nm).
• La spettroscopia UV-VIS misura la quantità di radiazione assorbita o emessa dalle molecole, dovuta all'eccitazione degli elettroni di legame.

Spettro e Analisi Qualitativa

• L'aspetto qualitativo della spettrofotometria UV-VIS può essere rappresentato dallo spettro bidimensionale.
• Sull'asse delle ascisse si riporta la lunghezza d'onda.
• Sull'asse delle ordinate si riporta l'assorbanza (in Au o mAu).
• Lo studio dello spettro può fornire informazioni sulla natura della molecola, come la lunghezza d'onda del massimo assorbimento.
• Lo spettro di una molecola può variare in funzione della natura del solvente (polarità, analita, pH e temperatura).

Spettrofotometri: Classificazione e Componenti Base

• Gli spettrofotometri possono essere classificati come a singolo o doppio raggio.
• Lo strumento di base è costituito da una sorgente luminosa (lampada), un sistema di selezione della lunghezza d'onda (monocromatore), un alloggio per il campione, un rivelatore e un registratore del segnale.
• Gli spettrofotometri a doppio raggio misurano contemporaneamente l'assorbimento di due celle: una con il campione e una con il bianco di riferimento.
• L'apparecchio fornisce automaticamente il rapporto dell'intensità dei segnali e compensa l'assorbimento dovuto al bianco.

Sorgente Luminosa

• La sorgente luminosa può essere una lampada al deuterio per l'analisi nel campo dell'UV (180-370 nm) oppure al tungsteno o tungsteno-alogena per l'analisi nel campo del visibile (330-2500 nm).
• La lampada emette radiazioni di intensità costante e stabile con un basso rumore di fondo.

Monocromatore

• Dispositivo che separa il fascio di luce prodotto dalla lampada nelle diverse lunghezze d'onda.
• L'intervallo di lunghezze d'onda trasmesso da un monocromatore è definito come banda passante spettrale, generalmente inferiore a 1-2 nm negli strumenti di buon livello.
• Inizialmente si usava il prisma, ma ora si utilizzano i reticoli di diffrazione.

Celle o Cuvette

• Contenitori trasparenti di forma rettangolare, con lunghezza variabile da 1 mm a 100 mm (le più usate 10 mm).
• Sono realizzate in vetro o quarzo, con volumi variabili da 3 mL a meno di 5 µL.
• Le cuvette in quarzo garantiscono trasmittanze maggiori dell'80% tra 200 e 2.500 nm, offrendo accuratezza e riproducibilità.
• Le cuvette monouso (polistirene o metacrilato) non richiedono pulizia, ma sono sensibili a certi solventi, si rigano facilmente, hanno scarsa resistenza termica e non sono utilizzabili a lunghezze d'onda inferiori a 200-300 nm.

Rivelatori

• Trasformano il segnale luminoso in un segnale elettrico.
• La radiazione UV-VIS ha sufficiente energia per promuovere la fotoemissione, ovvero la produzione di elettroni a seguito dell'interazione della radiazione con una superficie reattiva.
• Tra i rivelatori si trovano fotocellule e fotomoltiplicatori, costituiti da strutture sottovuoto ad alto voltaggio ingombranti.
• Attualmente sono molto diffusi i fotodiodi, elementi di piccole dimensioni, economici, veloci, lineari e con basso rumore.

Amplificatore e Registratore

• L'amplificatore amplifica il segnale elettrico del rivelatore.
• Il registratore fornisce il valore di assorbanza.

Teoria del Funzionamento dello Spettrofotometro

• Il parametro valutato dallo spettrofotometro è l'assorbanza (A), definita dalla formula A=log(I₀/Iₜ).
• I₀ è l'intensità della luce incidente prima del campione.
• Iₜ è l'intensità della luce trasmessa attraverso il campione.
• L'assorbanza è un valore senza unità di misura che va da 0 (luce trasmessa uguale all'entrata) a 2 (luce trasmessa è 1/100 di quella incidente).
• L'assorbanza segue la legge di Lambert e Beer, affermando che la concentrazione del campione nella cuvetta è proporzionale alla sua assorbanza.
• La legge di Lambert-Beer è espressa come A = εcl dove:
• ɛ è il coefficiente di estinzione molare (M-1cm-1)
• c è la concentrazione molare del campione nella cuvetta (M)
• l è il cammino ottico, ovvero la lunghezza della cuvetta (cm)

Limiti dello Strumento

• I limiti dipendono dal modello di spettrofotometro, dalle sue caratteristiche specifiche, dalla sensibilità e dalla precisione dell'operatore.
• I campioni devono essere puliti e senza residui grossi o impurità.
• Le cuvette devono essere pulite per evitare fenomeni di assorbimento o riflessioni errate.
• È necessario conoscere la lunghezza d'onda della luce assorbita dalle molecole da cercare.
• Impostare lo strumento correttamente nel caso di analisi a singola lunghezza d'onda.
• Se la composizione del campione è ignota, osservare lo spettro totale e analizzare i singoli picchi nel grafico per determinare le molecole presenti.

Procedimento Analitico

• Preparare campioni standard di cui si misura l'assorbanza.
• Costruire una retta di taratura (assorbanza contro la concentrazione) e la retta di regressione tra due concentrazioni standard comprese nell'intervallo.
• L'analisi può essere effettuata direttamente sulla sostanza disciolta in un mezzo trasparente che assorbe a una determinata lunghezza d'onda.
• Eseguire preventivamente una prova in bianco con un liquido contenente tutti i reattivi tranne la sostanza da analizzare.
• Utilizzando uno spettrofotometro a raggio singolo, portare la trasmittanza al 10% inserendo la prova in bianco, quindi misurare l'assorbanza del campione.
• Utilizzando uno spettrofotometro a doppio raggio, azzerare lo strumento senza assorbanza nel raggio del campione e della prova di riferimento: la cuvetta con il solvente viene emessa nella direzione del raggio di riferimento, quella con il campione nella direzione del raggio del campione.

Curva di Taratura e Limite di Rivelabilità

• Nella curva di taratura, il segnale misurato è rapportato alla concentrazione.
• Il limite di rivelabilità consiste nella concentrazione o nella quantità di sostanza che dà un segnale di ampiezza doppia della deviazione standard riferita ad almeno 10 misure, ovvero la concentrazione più piccola rilevabile con il 95% di probabilità.

Colorimetri

• Molti spettrofotometri moderni possono essere utilizzati come colorimetri, apparecchi in grado di misurare le radiazioni approssimandosi alla sensazione visiva percepita dall'occhio umano.
• Lavorando su campioni trasparenti e in soluzione, è possibile effettuare una scansione tra 380 e 780 nm, impostando l'osservatore standard e il tipo di sorgente (in genere 10° e D65), ottenendo valori di coordinate cromatiche nel sistema CIE (Commision International d'Eclairage).
• Il sistema CIE si basa sulla teoria secondo cui ogni colore contiene diverse misure dei valori RGB (rosso, verde, blu), detti TRISTIMOLO.
• Ogni colore del sistema CIE è specificato dalla sua lunghezza d'onda e dai tre valori tristimolo definiti da X (rosso), Y (verde) e Z (blu).
• I tre colori sono miscelati in proporzioni diverse per formare i diversi colori CIE, con la somma delle percentuali di X, Y e Z (coordinate trigonometriche) pari ad 1 (X+Y+Z=1).
• Per vedere un colore CIE, si rappresenta un grafico con i parametri X e Y, con il rosso sulle ordinate e il verde sulle ascisse. Lo sviluppo lungo l'asse Z, dal bianco al nero, permette di inserire il fattore luminanza e quindi tutti i colori desaturati.
• I colori sono identificabili tramite un sistema cartesiano di coordinate x, y ed eventualmente z.