Southern Blotting: principi e applicazioni

Valutazione della Qualità e Quantità del DNA

• La valutazione della quantità e qualità del DNA si può effettuare tramite la corsa elettroforetica.
• Gli acidi nucleici sono carichi e separabili in un campo elettrico tramite una matrice porosa e un tampone con EDTA.
• La velocità di migrazione dipende dalle dimensioni e dalla forma delle molecole.

Matrici Elettroforetiche

• Agarosio:
  • Polisaccaride che crea una matrice con pori di dimensione variabile.
  • Consente di separare frammenti che differiscono di almeno 20/30 bp.
  • Concentrazioni variabili di agarosio influenzano la separazione: più agarosio per frammenti piccoli, meno per frammenti grandi.
  • La corsa avviene a voltaggio costante di 3 V/cm.
• Acrilammide:
  • Offre una maggiore risoluzione, separando frammenti molto simili.
  • Concentrazione minima del 3%, utilizzata per frammenti fino a 500 bp.
• Elettroforesi in campo pulsato:
  • Usata per frammenti di DNA molto grandi.
  • Gli elettrodi sono posti a 45 gradi, e il campo elettrico cambia continuamente.
  • Comunemente usata per cromosomi di lievito.

Esecuzione della Corsa Elettroforetica

• I campioni sono caricati in pozzetti con loading buffer e glicerolo per aumentarne la densità.
• La corsa avviene in presenza di coloranti.
• L'etidio bromuro, un mutageno, era usato storicamente ma ora sostituito da sostanze intercalanti del DNA fluorescenti se eccitate con UV o luce blu.
• La visualizzazione avviene tramite un transluminatore o gelDOC.
• Metodi radioattivi come il silver staining sono un'alternativa.
• Alla fine della corsa, si osservano bande di DNA: il DNA genomico in alto e i prodotti di PCRT in basso.

Stima delle Dimensioni e della Concentrazione

• Si stima la dimensione dei frammenti usando un marcatore di pesi molecolari.
• La concentrazione del DNA si stima a livello occhiometrico confrontando con una scala di DNA genomico a concentrazioni note.

Qualità del DNA

• Informazioni sulla qualità si ottengono osservando: una banda unica indica DNA integro, uno smear indica DNA degradato.

Recupero del DNA

• Frammenti di interesse possono essere recuperati dal gel per purificare il DNA.

Sistemi di Microfluidica

• In alternativa ci sono sistemi di microfluidica con chip contenenti pozzetti e canali con matrici.
• Un sistema di rilevazione visualizza la corsa del DNA tramite coloranti, dando un'immagine digitale.

Analisi Spettrofotometrica

• Il DNA in soluzione acquosa ha un picco di assorbanza a 260 nm, usato per dedurne la concentrazione.
• Risultati attendibili si ottengono con assorbanza tra 0,1 e 1 OD.
• Le misurazioni vanno effettuate dopo aver azzerato lo spettrofotometro con il bianco e usando cuvette di quarzo trasparenti a UV.
• Per il dsDNA: 1 OD = 50 ng/μL, mentre per il ssDNA è 40 ng/μL.

Valori di Assorbanza del DNA

• a 280nm: assorbanza delle proteine (OD260/OD280 deve essere compreso tra 1,8 e 2).
• a 230nm: contaminazione da guanidinio, fenolo o polisaccaridi (2.0/2.2).
• a 320nm: assorbanza bassa indica che la misurazione è corretta.

Nanodrop

• Spettrofotometro che consente di analizzare piccoli volumi di DNA (1,5-2 µL), evitando sprechi.
• Una goccia di DNA viene caricata, e un raggio UV misura l'assorbanza.

Manipolazione Enzimatica del DNA Purificato

• Il DNA si può manipolare con enzimi purificati o prodotti in maniera ricombinante, che svolgono diversi ruoli all'interno della cellula.

Nucleasi

• Tagliano il DNA nel legame fosfodiesterico.
• Classificate come esonucleasi (accorciano e degradano dagli acidi nucleici a partire dalle estremità) o endonucleasi (rompono internamente).
• Endonucleasi di restrizione:
  • Tagliano il DNA in sequenze specifiche.
  • Producono estremità piatte o coesive.
  • Utilizzate per il clonaggio classico.
  • Si può stimare la frequenza di taglio in base alla ricorrenza del sito di restrizione.
• Reazione di restrizione:
  • DNA, buffer tipico per l'enzima, e l'enzima di restrizione vengono incubati a 37°C.
  • La durata varia in base alla digestione analitica o preparativa, ma per il clonaggio serve un periodo di 3 ore.
  • Dopo la reazione, si purifica il DNA per togliere l'enzima.

Ligasi

• Uniscono molecole di acidi nucleici riparando discontinuità tra nucleotidi.
• Funzionano con estremità piatte o coesive, con maggiore efficienza per quelle coesive.
• L'enzima T4 DNA ligasi di E. coli è comunemente usato.
• Sito di restrizione si aggiunge tramite PCR utilizzando primer a cui vengono aggiunti, per essere poi inseriti in un vettore.

Polimerasi

• Copiano gli acidi nucleici usando uno stampo e necessitano di un primer.
• DNA polimerasi I:
  • Attività polimerasica ed esonucleasica in direzione 5'-3'.
  • Rimuove e sostituisce i nucleotidi adiacenti a un nick.
• Frammento di Klenow:
  • Deriva dalla DNA polimerasi I, ma ha solo attività di sintesi.
  • Non sostituisce i nucleotidi esistenti.
• Taq DNA polimerasi I:
  • Deriva da Thermus aquaticus.
  • Usata per la PCR perché è termostabile.
• Trascrittasi inversa:
  • Deriva dai virus e usa l'RNA come stampo per sintetizzare cDNA.

Enzimi di Modificazione

• Rimuovono o aggiungono gruppi chimici.
• Fosfatasi alcalina:
  • Rimuove il fosfato in 5' dalle molecole di DNA.
• Polinucleotide kinasi (PNK):
  • Aggiunge il gruppo fosfato in posizione 5' terminale.
  • Usata per le ligazioni che necessitano il fosfato.
• Questi enzimi utili per sostituire il fosfato presente in DNA con un fosfato radioattivo o marcato

Ibridazione Molecolare

• Il processo di ibridazione molecolare si basa sulla denaturazione e rinaturazione del DNA.
• Un aumento della temperatura causa denaturazione, un processo reversibile tramite raffreddamento.
• La composizione del DNA influenza il processo: maggiore è il numero di GC, più calore serve per la denaturazione.
• La temperatura di Melting è la temperatura alla quale il 50% delle molecole di DNA sono denaturate.

Processo di Ibridazione

• Due filamenti di DNA tendono a ibridarsi a temperature più basse, formando inizialmente un ibrido instabile.
• Solo quando l'ibridazione è sufficientemente completa, l'ibrido diventa stabile.
• La stabilità dipende dalla complementarietà delle basi e dalla temperatura.
• L'ibridazione DNA/DNA permette di studiare l'organizzazione dei geni tramite Southern blotting, o effettuare screening di librerie genomiche o di cDNA.

Applicazioni dell'Ibridazione Molecolare

• Definire quanti membri di una famiglia genica sono presenti in un genoma (Southern blotting)
• Verificare il numero di copie di un transgene inserite in organismi transgenici (Southern blotting)
• Arricchire in geni presenti solo in determinati tessuti
• Isolare cloni genomici in librerie genomiche o di cDNA.
• Analisi microarray

Southern Blotting

• Serve per identificare in che punto di un dna è presente un gene di interesse
• Protocollo che sfrutta l'ibridazione molecolare del DNA, trasferito su una membrana testata con sonde.

Procedura

• Il DNA genomico è digerito e separato tramite gel elettroforesi.
• I frammenti di DNA sono trasferiti su una membrana di nitrocellulosa.
• In alcuni casi, il DNA è trattato con HCl e soluzioni denaturanti e neutralizzanti per facilitare il trasferimento.
• Quindi si recupera la membrana e il DNA viene fissato tramite UV o calore.
• La membrana è ibridata con sonde marcate.
• Dopo l'ibridazione, la membrana viene lavata e analizzata per rilevare l'appaiamento della sonda.

Membrane

• Nitrocellulosa:
  • Bassa capacità di legame in particolare con frammenti piccoli.
  • Legame idrofobico non covalente.
  • Poco robusta e difficilmente riutilizzabile.
  • Basso background.
• Nylon:
  • Maggiore capacità di legame.
  • Legame covalente.
  • Più robusta e riutilizzabile.
  • Esistono diverse tipologie (neutre o cariche positivamente).

Condizioni di Ibridazione

• La membrana è preibridata per evitare legami aspecifici.
• L'ibridazione avviene in tubi, bustine di plastica o vaschette a temperature specifiche, in base al buffer usato.
• Dopo l'ibridazione, le membrane sono lavate con buffer a concentrazioni decrescenti di sali.
• La sonda ibridata può essere rimossa e la membrana riusata.

Oligonucleotidi Come Sonde

• Si amplificano e si purificano oligo con una temperatura di Melting almeno 10°C superiore a quella dell'ibridazione.
• Si possono usare sonde eterologhe (geni condivisi in diversi organismi) o sonde degenerate (nucleotidi variabili).

Marcatura delle Sonde

• La sonda deve essere resa visibile marcandola, incorporando nucleotidi tracciabili con radioattività o meno.
• Dopo la marcatura, è importante purificare la sonda.
• Marcatura terminale:
  • Il processo della marcatura terminale è la marcatura della sonda in posizione terminale con l'uso della polinucleotide chinasi.
  • si verifica la sostituzione del gruppo OH con un fosfato marcato in posizione 5' terminale, produce bassi livelli marcatura

Metodi di Marcatura

• Marcatura interna:
  • Utilizza DNA polimerasi I frammenti di Klenow ed ATP marcato.
• Marcatura mediante nick translation:
  • Crea dei nick e i ripara con DNA polimerasi I e ATP marcato.
• Marcatura mediante end filling:
  • Ripara le estremità a singolo filamento con il frammento di Klenow e ATP marcato.
• Marcatura mediante random priming:
  • Vengono usati degli oligonucleotidi randomici che si legheranno al frammento.
• Marcature non radioattive:
  • Sono meno pericolose e meno costose.

Analisi Microarray

• Su un supporto solido si trovano gli oligonucleotidi complementari a tutti i geni del genoma.
• Il cDNA ottenuto da un organismo in determinate condizioni è marcato e ibridato al supporto.

Analisi del DNA Mediante PCR

• La PCR si compone di tre step: denaturazione, annealing, ed extension.

Disegno dei Primer

• Il processo si basa sul disegno di primer con sequenze di 20-25 paia di basi con una temperatura di melting e annealing definita dall'operatore.
• La temperatura di melting (Tm) è quella a cui metà del primer si dissocia dal templato.
• Tm = (4 x GC) + (2 x AT)
• La temperatura di annealing deve essere vicina alla temperatura di melting, per favorire la specificità.
• La temperatura di annealing deve essere definita dall'operatore.
• Il primer forward corrisponde alla sequenza 5'→3 mentre il primer reverse è il reverse complement letto dalla fine.
• Il 5' del primer può essere modificato se ha siti di restrizione e tag fluorescenti.
• Ci sono dei software specializzati per il disegno di primer che consentono di ottimizzare le sequenze affinché non ci siano ripiegamenti all'interno del primer.

Allestimento della Reazione e Componenti

• Preparando la reazione, si parte sempre dai volumi più grandi per poi arrivare ai più piccoli.
• Buffer 10X (o 5X):
  • Mantiene condizioni di pH per la reazione.
  • Puó contenere componenti tipo MCl2.
• MgCl2 (da 1,25 a 2,5 mM):
  • Serve a modulare la specificità della reazione.
• dNTPs (concentrazione finale 200uM per ciascun dNTP)
  • Possono limitare perché si arriva a saturazione e si ferma la per.
• Primers (0,4 μΜ):
• Templato:
  • Piccolo in caso di DNA plasmidico
  • Piú alto in caso di DNA genomico perché quest'ultimo contiene inibitori.
• Taq DNA Polimerasi:
  • Si usano da 0,5 a 2,5u

Funzionamento Taq DNA Polimerasi

• Processività: può allungare 1000 bp al minuto.
  • Alcune Taq presentano attività di proofreading, ma diminuisce la processività.
• Taq hot start: hanno un anticorpo complessato all'enzima Impedisce che l'enzima inizi prima che le condizioni ottimali.
• Errore: 1 ogni 9000 bp
• Taq normali aggiungno A al 3' terminate senza bisogno di avere T all'estremitá
• ibridazione a temp ambiente quindi si usano su ghiaccio.

Ciclo Universale PCR

• Denaturazione iniziale a 93 gradi
• Denaturazione a 93 gradi: I Filamenti si separano
• Annealing a Tm-5. I primers si appiano al DNA
• Estensione a 72 l'enzima si lega e allunga
• Si estende alla fine a 72 per i filamemti non comèleti

Come Ottimizzano le Reaktion

• Iloperatore lavora sulla temperatura di melting
• In alternativa si modifica in caso di presenza di magnesio: la quantitá aumenta o si diminuisce per una rezione aspecifca.
• Anche dNTPS e Taq facilitano la reazione.

Applicazioni della PCR

• Multiplex PCR:
  • Consente di amplificare diverse regioni con piú primer e una data temp.
  • Utilizzato in genotiprizazzione high-throughput.
• Nested:
  • Induce duplicazione successive.
  • Consente a arricchire in target di interesse.
• Touchdown:
  • Identifica la temp ideale in PCR. PCR inversa:consente di estrarre le sequenza adiacenti a gene di interesse.
• Allele: Consente di amplificare e selezionare mediante PCR di una certa variante.
• quantitiva real time PCR: permette di quantificare il target, implica applicazione a diagnosi molecolare.

Analisi con QPCR

• Ci sono diversi livelli di reazione
• Inizio si ha Target basso
• Poi una fase lineare, esponenziale
• alla fina una diminuisce in efficiienza
• Importate il ciclo perche durante fase esponenziale si stabilizzea il numero di copie che ho come target (molten si usa su gel)
• È necessaruo che il C, si super in un plot a ogni singolo campioni e poi si interoga la frazione quantificata

Misurazione

• Strumento con un ottima che per le lezioni e per il posizionamento dove c'è la reazione.

Analisi Semi quantistica

• Prima che sia introdotta bisogna seguirla con lezioni fatte di gel dove si vede il base con la presentazione.

Si Possono Fare 2 Strategire

• Sbirgreen: se escono un po' specifici li prende
• Sequenza tagmen: e ci va a spaccare.

Strategia Esatta

• Utilizzato per tamponi molecolari
• Droplete quantifica molto in basso la copie non nel Target.

Marker

• Per valutare a diversi livelli
• Permette di fare un analisi
• Con analisi descritta ci sono diverse porzioni di DNA che si stanno studiando.
• Vengono in luce le differenze che ci stanno in DNA.

Esplora i principi del Southern blotting, inclusi i fattori che influenzano l'ibridazione DNA/DNA e le applicazioni tipiche. Approfondisci i passaggi essenziali come il trasferimento del DNA e il fissaggio alla membrana. Analisi di risultati inaspettati e interpretazione di bande intense.