Podcast
Questions and Answers
In un protocollo di isolamento plasmidico che impiega sferoplasti e Triton X-100, quale delle seguenti affermazioni descrive più accuratamente la distribuzione differenziale del DNA genomico e plasmidico durante le fasi di centrifugazione?
In un protocollo di isolamento plasmidico che impiega sferoplasti e Triton X-100, quale delle seguenti affermazioni descrive più accuratamente la distribuzione differenziale del DNA genomico e plasmidico durante le fasi di centrifugazione?
- Sia il DNA genomico che i plasmidi precipitano selettivamente in seguito all'aggiunta di Triton X-100, consentendo una facile separazione tramite risospensione differenziale.
- Il DNA genomico, legato ai frammenti di membrana e parete cellulare, sedimenta durante la centrifugazione, mentre i plasmidi, presenti in forma superavvolta, rimangono prevalentemente in soluzione. (correct)
- Il DNA genomico, inizialmente legato alla membrana, viene completamente rilasciato in soluzione dal Triton X-100, rendendo impossibile la sua separazione dai plasmidi mediante centrifugazione.
- Il DNA genomico, frammentato dal Triton X-100, rimane in soluzione insieme ai plasmidi, richiedendo ulteriori passaggi di purificazione selettiva basati sulla dimensione.
Quale meccanismo molecolare spiega la diversa suscettibilità alla denaturazione alcalina tra il DNA plasmidico superavvolto e il DNA genomico lineare, consentendo la loro separazione?
Quale meccanismo molecolare spiega la diversa suscettibilità alla denaturazione alcalina tra il DNA plasmidico superavvolto e il DNA genomico lineare, consentendo la loro separazione?
- Il DNA superavvolto è protetto dalla denaturazione alcalina da proteine leganti specifiche che formano complessi stabili anche a pH elevati, mentre il DNA genomico lineare non beneficia di tale protezione.
- La denaturazione alcalina è un processo dipendente dalla sequenza, e il DNA genomico lineare contiene specifiche sequenze ricche di AT che lo rendono più suscettibile alla separazione dei filamenti rispetto al DNA plasmidico.
- Il DNA superavvolto, a causa della sua elevata densità di carica negativa, resiste alla denaturazione indotta da pH elevato perché le interazioni elettrostatiche stabilizzano la doppia elica.
- La topologia superavvolta del DNA plasmidico impedisce la completa separazione dei filamenti in ambiente alcalino a causa di vincoli topologici, mentre il DNA lineare è libero di denaturarsi completamente. (correct)
In un protocollo di isolamento del DNA fagico, quale delle seguenti strategie è cruciale per massimizzare la resa del DNA purificato, considerando le sfide associate all'ottimizzazione dell'infezione batterica?
In un protocollo di isolamento del DNA fagico, quale delle seguenti strategie è cruciale per massimizzare la resa del DNA purificato, considerando le sfide associate all'ottimizzazione dell'infezione batterica?
- Ottimizzare il rapporto fago-cellula (MOI) per bilanciare la lisi cellulare precoce e la produzione di particelle virali, seguito da un'accurata rimozione delle proteine del capside tramite digestione enzimatica. (correct)
- Indurre la lisi batterica mediante shock termico anziché infezione fagica, evitando così la variabilità nella resa di DNA dovuta alla competenza batterica e alla resistenza fagica.
- Utilizzare una proteasi a spettro ristretto che degradi selettivamente le proteine del capside fagico senza danneggiare le proteine batteriche, massimizzando così la resa di DNA.
- Implementare un sistema di coltura continua (chemostato) per mantenere una popolazione batterica in crescita esponenziale stabile, ottimizzando così l'infezione e la produzione fagica.
Durante l'estrazione di plasmidi da cellule batteriche, l'aggiunta di saccarosio al 25% serve a:
Durante l'estrazione di plasmidi da cellule batteriche, l'aggiunta di saccarosio al 25% serve a:
Un ricercatore sta tentando di isolare DNA plasmidico da un ceppo batterico ricombinante. Dopo aver eseguito la lisi alcalina e la neutralizzazione, osserva che la preparazione di DNA è altamente viscosa. Quale delle seguenti modifiche al protocollo risolverebbe più efficacemente questo problema?
Un ricercatore sta tentando di isolare DNA plasmidico da un ceppo batterico ricombinante. Dopo aver eseguito la lisi alcalina e la neutralizzazione, osserva che la preparazione di DNA è altamente viscosa. Quale delle seguenti modifiche al protocollo risolverebbe più efficacemente questo problema?
In un esperimento di trasfezione con DNA plasmidico, si sospetta che l'efficienza sia limitata dalla degradazione del DNA da parte di nucleasi extracellulari. Quale strategia si rivelerebbe la più efficace per proteggere il DNA plasmidico e aumentare l'efficienza di trasfezione?
In un esperimento di trasfezione con DNA plasmidico, si sospetta che l'efficienza sia limitata dalla degradazione del DNA da parte di nucleasi extracellulari. Quale strategia si rivelerebbe la più efficace per proteggere il DNA plasmidico e aumentare l'efficienza di trasfezione?
Un ricercatore sta confrontando l'efficacia di diversi metodi di purificazione del DNA genomico. Dopo aver applicato i campioni a un gel di agarosio per elettroforesi, osserva che un campione mostra una banda sfocata e di basso peso molecolare. Quale delle seguenti cause è più probabile che abbia contribuito a questo risultato?
Un ricercatore sta confrontando l'efficacia di diversi metodi di purificazione del DNA genomico. Dopo aver applicato i campioni a un gel di agarosio per elettroforesi, osserva che un campione mostra una banda sfocata e di basso peso molecolare. Quale delle seguenti cause è più probabile che abbia contribuito a questo risultato?
Una coltura batterica è stata infettata con un fago litico. Tuttavia, dopo un periodo di incubazione previsto, non si osserva alcuna lisi e la densità ottica della coltura rimane stabile. Quale delle seguenti ipotesi è più probabile che spieghi questo risultato inatteso?
Una coltura batterica è stata infettata con un fago litico. Tuttavia, dopo un periodo di incubazione previsto, non si osserva alcuna lisi e la densità ottica della coltura rimane stabile. Quale delle seguenti ipotesi è più probabile che spieghi questo risultato inatteso?
In quali condizioni l'etanolo, rispetto all'isopropanolo, è preferibile per la precipitazione del DNA, considerando le implicazioni per la purezza e la resa in esperimenti successivi?
In quali condizioni l'etanolo, rispetto all'isopropanolo, è preferibile per la precipitazione del DNA, considerando le implicazioni per la purezza e la resa in esperimenti successivi?
Considerando le proprietà chimiche e le interazioni molecolari, quale sarebbe l'effetto teorico dell'omissione del lavaggio con etanolo al 75% in una procedura di precipitazione del DNA e come influenzerebbe le successive analisi enzimatiche?
Considerando le proprietà chimiche e le interazioni molecolari, quale sarebbe l'effetto teorico dell'omissione del lavaggio con etanolo al 75% in una procedura di precipitazione del DNA e come influenzerebbe le successive analisi enzimatiche?
In un contesto di biologia molecolare applicata, se si riscontrasse una significativa degradazione del DNA estratto nonostante l'utilizzo di Tris-EDTA, quale modifica al protocollo di estrazione sarebbe più appropriata per mitigare il problema, considerando le diverse vie di degradazione del DNA?
In un contesto di biologia molecolare applicata, se si riscontrasse una significativa degradazione del DNA estratto nonostante l'utilizzo di Tris-EDTA, quale modifica al protocollo di estrazione sarebbe più appropriata per mitigare il problema, considerando le diverse vie di degradazione del DNA?
Quale implicazione biochimica deriverebbe dall'utilizzo di acqua deionizzata anziché Tris-EDTA per la risospensione del pellet di DNA dopo la precipitazione con etanolo, considerando la stabilità a lungo termine del DNA e la sua suscettibilità all'idrolisi?
Quale implicazione biochimica deriverebbe dall'utilizzo di acqua deionizzata anziché Tris-EDTA per la risospensione del pellet di DNA dopo la precipitazione con etanolo, considerando la stabilità a lungo termine del DNA e la sua suscettibilità all'idrolisi?
In uno scenario in cui si estrae DNA da un campione vegetale particolarmente ricco di polisaccaridi, e il CTAB non performs come previsto, quale alterazione del protocollo potrebbe aumentare la resa e la purezza del DNA estratto, considerando le interazioni competitive tra CTAB, polisaccaridi e DNA?
In uno scenario in cui si estrae DNA da un campione vegetale particolarmente ricco di polisaccaridi, e il CTAB non performs come previsto, quale alterazione del protocollo potrebbe aumentare la resa e la purezza del DNA estratto, considerando le interazioni competitive tra CTAB, polisaccaridi e DNA?
Se, durante l'estrazione del DNA, si osserva una co-precipitazione eccessiva di RNA, quale strategia specifica si potrebbe implementare per ridurre la contaminazione da RNA senza compromettere l'integrità del DNA, data la somiglianza chimica tra i due acidi nucleici?
Se, durante l'estrazione del DNA, si osserva una co-precipitazione eccessiva di RNA, quale strategia specifica si potrebbe implementare per ridurre la contaminazione da RNA senza compromettere l'integrità del DNA, data la somiglianza chimica tra i due acidi nucleici?
In un esperimento di estrazione di DNA da tessuti difficili, come quelli ricchi di lipidi e proteine complesse, quale modifica al buffer di lisi potrebbe ottimizzare la resa del DNA minimizzando la co-estrazione di contaminanti, considerando le interazioni tra DNA, lipidi, proteine e i reagenti di lisi?
In un esperimento di estrazione di DNA da tessuti difficili, come quelli ricchi di lipidi e proteine complesse, quale modifica al buffer di lisi potrebbe ottimizzare la resa del DNA minimizzando la co-estrazione di contaminanti, considerando le interazioni tra DNA, lipidi, proteine e i reagenti di lisi?
Considerando le limitazioni delle tecniche di estrazione di DNA basate su CTAB in termini di tossicità e impatto ambientale, quale approccio alternativo potrebbe essere impiegato per l'estrazione di DNA di alta qualità da campioni vegetali, mantenendo al contempo un'alta resa e purezza, con un occhio di riguardo alla sostenibilità e alla sicurezza del laboratorio?
Considerando le limitazioni delle tecniche di estrazione di DNA basate su CTAB in termini di tossicità e impatto ambientale, quale approccio alternativo potrebbe essere impiegato per l'estrazione di DNA di alta qualità da campioni vegetali, mantenendo al contempo un'alta resa e purezza, con un occhio di riguardo alla sostenibilità e alla sicurezza del laboratorio?
In un esperimento di Southern blotting, quale delle seguenti modifiche al protocollo di trasferimento influenzerebbe maggiormente l'efficienza del trasferimento di frammenti di DNA di grandi dimensioni (>10 kb) da un gel di agarosio a una membrana di nylon caricata positivamente?
In un esperimento di Southern blotting, quale delle seguenti modifiche al protocollo di trasferimento influenzerebbe maggiormente l'efficienza del trasferimento di frammenti di DNA di grandi dimensioni (>10 kb) da un gel di agarosio a una membrana di nylon caricata positivamente?
Considerando la chimica delle interazioni DNA-membrana nel Southern blotting, quale delle seguenti affermazioni descrive più accuratamente il motivo per cui le membrane di nylon caricate positivamente esibiscono generalmente una maggiore capacità di legame del DNA rispetto alle membrane di nitrocellulosa?
Considerando la chimica delle interazioni DNA-membrana nel Southern blotting, quale delle seguenti affermazioni descrive più accuratamente il motivo per cui le membrane di nylon caricate positivamente esibiscono generalmente una maggiore capacità di legame del DNA rispetto alle membrane di nitrocellulosa?
Durante la fase di pre-ibridazione nel Southern blotting, quale sarebbe l'effetto più probabile sull'analisi se una quantità insufficiente di DNA carrier denaturato (ad esempio, DNA di sperma di salmone) fosse inclusa nella soluzione di pre-ibridazione?
Durante la fase di pre-ibridazione nel Southern blotting, quale sarebbe l'effetto più probabile sull'analisi se una quantità insufficiente di DNA carrier denaturato (ad esempio, DNA di sperma di salmone) fosse inclusa nella soluzione di pre-ibridazione?
Si consideri un Southern blot in cui, dopo il trasferimento e il cross-linking UV, non si osserva alcun segnale dopo l'ibridazione con una sonda specifica. Quale delle seguenti ipotesi è la più probabile data la riuscita delle fasi di preparazione del DNA, digestione enzimatica e corsa elettroforetica?
Si consideri un Southern blot in cui, dopo il trasferimento e il cross-linking UV, non si osserva alcun segnale dopo l'ibridazione con una sonda specifica. Quale delle seguenti ipotesi è la più probabile data la riuscita delle fasi di preparazione del DNA, digestione enzimatica e corsa elettroforetica?
In un esperimento di Southern blotting, si utilizza una membrana di nitrocellulosa che, a posteriori, si scopre essere stata conservata impropriamente in condizioni di elevata umidità. Quale impatto negativo specifico si prevede di osservare sui risultati dell'esperimento?
In un esperimento di Southern blotting, si utilizza una membrana di nitrocellulosa che, a posteriori, si scopre essere stata conservata impropriamente in condizioni di elevata umidità. Quale impatto negativo specifico si prevede di osservare sui risultati dell'esperimento?
Immagina di ottimizzare un protocollo di Southern blotting per rilevare un gene a bassa espressione in campioni di DNA genomico digerito. Quale combinazione di strategie migliorerebbe simultaneamente la sensibilità e ridurrebbe il background?
Immagina di ottimizzare un protocollo di Southern blotting per rilevare un gene a bassa espressione in campioni di DNA genomico digerito. Quale combinazione di strategie migliorerebbe simultaneamente la sensibilità e ridurrebbe il background?
Dopo aver eseguito il trasferimento del DNA da un gel di agarosio a una membrana di nylon caricata positivamente, si scopre che il cross-linking tramite UV è stato omesso. Quale metodo alternativo, tra i seguenti, sarebbe più efficace per fissare irreversibilmente il DNA alla membrana, garantendo la conservazione del campione per future analisi di ibridazione?
Dopo aver eseguito il trasferimento del DNA da un gel di agarosio a una membrana di nylon caricata positivamente, si scopre che il cross-linking tramite UV è stato omesso. Quale metodo alternativo, tra i seguenti, sarebbe più efficace per fissare irreversibilmente il DNA alla membrana, garantendo la conservazione del campione per future analisi di ibridazione?
Durante l'esecuzione di un Southern blot, si osserva che il segnale ottenuto è significativamente inferiore rispetto alle aspettative, nonostante tutti i controlli procedurali siano stati eseguiti correttamente. Approfondendo l'analisi, si sospetta un problema nella preparazione della sonda radioattiva. Quale dei seguenti parametri, se compromesso, potrebbe più probabilmente spiegare la debolezza del segnale di ibridazione?
Durante l'esecuzione di un Southern blot, si osserva che il segnale ottenuto è significativamente inferiore rispetto alle aspettative, nonostante tutti i controlli procedurali siano stati eseguiti correttamente. Approfondendo l'analisi, si sospetta un problema nella preparazione della sonda radioattiva. Quale dei seguenti parametri, se compromesso, potrebbe più probabilmente spiegare la debolezza del segnale di ibridazione?
In un'elettroforesi su gel di agarosio, quale parametro influenza maggiormente la risoluzione nella separazione di frammenti di DNA di dimensioni comprese tra 2000 e 3000 bp, considerando che si desidera ottimizzare la distinzione tra frammenti che differiscono solo di 50 bp?
In un'elettroforesi su gel di agarosio, quale parametro influenza maggiormente la risoluzione nella separazione di frammenti di DNA di dimensioni comprese tra 2000 e 3000 bp, considerando che si desidera ottimizzare la distinzione tra frammenti che differiscono solo di 50 bp?
Considerando un'elettroforesi in campo pulsato (PFGE) utilizzata per separare frammenti di DNA genomico di Lactobacillus casei di dimensioni superiori a 50 kbp, quale tra le seguenti modifiche procedurali risulterebbe più critica per ottimizzare la separazione di frammenti che mostrano co-migrazione?
Considerando un'elettroforesi in campo pulsato (PFGE) utilizzata per separare frammenti di DNA genomico di Lactobacillus casei di dimensioni superiori a 50 kbp, quale tra le seguenti modifiche procedurali risulterebbe più critica per ottimizzare la separazione di frammenti che mostrano co-migrazione?
In un laboratorio di biologia molecolare, si riscontra che la migrazione elettroforetica di un plasmide superavvolto da 3 kb appare significativamente alterata (maggiore velocità di migrazione) rispetto al marker di peso molecolare lineare. Quale modifica al protocollo elettroforetico risolverebbe più efficacemente tale discrepanza, consentendo una stima accurata delle dimensioni?
In un laboratorio di biologia molecolare, si riscontra che la migrazione elettroforetica di un plasmide superavvolto da 3 kb appare significativamente alterata (maggiore velocità di migrazione) rispetto al marker di peso molecolare lineare. Quale modifica al protocollo elettroforetico risolverebbe più efficacemente tale discrepanza, consentendo una stima accurata delle dimensioni?
Durante un'analisi elettroforetica di routine, si osserva una marcata sfocatura delle bande di DNA, nonostante l'utilizzo di un tampone di corsa nuovo e una corretta preparazione del gel. Quale aggiustamento procedurale affronterebbe direttamente la causa più probabile di questo problema?
Durante un'analisi elettroforetica di routine, si osserva una marcata sfocatura delle bande di DNA, nonostante l'utilizzo di un tampone di corsa nuovo e una corretta preparazione del gel. Quale aggiustamento procedurale affronterebbe direttamente la causa più probabile di questo problema?
In un esperimento di separazione elettroforetica di frammenti di DNA ottenuti tramite PCR, si nota che, nonostante l'utilizzo di primer specifici e condizioni di reazione ottimali, compaiono bande multiple e non definite sul gel. Quale approccio sperimentale sarebbe il più efficace per discernere e isolare il frammento di DNA desiderato?
In un esperimento di separazione elettroforetica di frammenti di DNA ottenuti tramite PCR, si nota che, nonostante l'utilizzo di primer specifici e condizioni di reazione ottimali, compaiono bande multiple e non definite sul gel. Quale approccio sperimentale sarebbe il più efficace per discernere e isolare il frammento di DNA desiderato?
Un ricercatore sta ottimizzando un protocollo di elettroforesi su gel di acrilammide denaturante (PAGE) per la separazione di piccoli oligonucleotidi (15-30 nt). Nonostante varie modifiche alla concentrazione dell'acrilammide e alle condizioni di corsa, la risoluzione ottenuta rimane insoddisfacente. Quale ulteriore modifica al protocollo avrebbe il maggiore impatto sull'incremento della risoluzione?
Un ricercatore sta ottimizzando un protocollo di elettroforesi su gel di acrilammide denaturante (PAGE) per la separazione di piccoli oligonucleotidi (15-30 nt). Nonostante varie modifiche alla concentrazione dell'acrilammide e alle condizioni di corsa, la risoluzione ottenuta rimane insoddisfacente. Quale ulteriore modifica al protocollo avrebbe il maggiore impatto sull'incremento della risoluzione?
Dopo aver eseguito un'elettroforesi su gel di agarosio, si osserva che il DNA genomico ad alto peso molecolare rimane intrappolato nei pozzetti, mentre i frammenti più piccoli migrano normalmente. Quale tra le seguenti cause è la più probabile responsabile di questo fenomeno?
Dopo aver eseguito un'elettroforesi su gel di agarosio, si osserva che il DNA genomico ad alto peso molecolare rimane intrappolato nei pozzetti, mentre i frammenti più piccoli migrano normalmente. Quale tra le seguenti cause è la più probabile responsabile di questo fenomeno?
In un'analisi comparativa di diversi protocolli di colorazione per la visualizzazione del DNA in gel di agarosio, quale caratteristica differenzia maggiormente l'uso di SYBR Green rispetto all'etidio bromuro in termini di impatto ambientale e sicurezza?
In un'analisi comparativa di diversi protocolli di colorazione per la visualizzazione del DNA in gel di agarosio, quale caratteristica differenzia maggiormente l'uso di SYBR Green rispetto all'etidio bromuro in termini di impatto ambientale e sicurezza?
Quale modifica al protocollo di Southern blot, che prevede l'utilizzo di HCl prima del trasferimento, massimizzerebbe la rimozione di basi puriniche preservando al contempo l'integrità del DNA a singolo filamento per l'ibridazione?
Quale modifica al protocollo di Southern blot, che prevede l'utilizzo di HCl prima del trasferimento, massimizzerebbe la rimozione di basi puriniche preservando al contempo l'integrità del DNA a singolo filamento per l'ibridazione?
In un Southern blot, quale caratteristica della membrana di nitrocellulosa o nylon determina primariamente l'efficienza di ibridazione e la risoluzione dei segnali, considerando che la membrana è stata pretrattata per bloccare i siti di legame non specifici?
In un Southern blot, quale caratteristica della membrana di nitrocellulosa o nylon determina primariamente l'efficienza di ibridazione e la risoluzione dei segnali, considerando che la membrana è stata pretrattata per bloccare i siti di legame non specifici?
Durante la preparazione del 'castelletto' per il trasferimento del DNA in un Southern blot, quale sarebbe l'impatto più significativo sull'efficienza del trasferimento se si utilizzasse una carta da filtro (wick) non satura di transfer buffer?
Durante la preparazione del 'castelletto' per il trasferimento del DNA in un Southern blot, quale sarebbe l'impatto più significativo sull'efficienza del trasferimento se si utilizzasse una carta da filtro (wick) non satura di transfer buffer?
Considerando l'uso di soluzioni bloccanti prima dell'ibridazione in un Southern blot, quale componente sarebbe più efficace nel prevenire il legame non specifico della sonda a sequenze ripetute presenti nella membrana, migliorando il rapporto segnale/rumore?
Considerando l'uso di soluzioni bloccanti prima dell'ibridazione in un Southern blot, quale componente sarebbe più efficace nel prevenire il legame non specifico della sonda a sequenze ripetute presenti nella membrana, migliorando il rapporto segnale/rumore?
Se, dopo l'elettroforesi e il trasferimento in un Southern blot, si osservasse una banda diffusa e sfocata anziché una banda nitida e definita, quale passaggio del protocollo sarebbe più critico da rivedere per risolvere il problema, assumendo che la sonda sia specifica e l'ibridazione sia stata eseguita correttamente?
Se, dopo l'elettroforesi e il trasferimento in un Southern blot, si osservasse una banda diffusa e sfocata anziché una banda nitida e definita, quale passaggio del protocollo sarebbe più critico da rivedere per risolvere il problema, assumendo che la sonda sia specifica e l'ibridazione sia stata eseguita correttamente?
In uno scenario in cui l'ibridazione di una sonda specifica in un Southern blot produce un segnale debole nonostante controlli positivi confermati, quale modifica alla composizione del transfer buffer migliorerebbe l'efficienza del trasferimento di DNA di grandi dimensioni (>10 kb) dal gel alla membrana?
In uno scenario in cui l'ibridazione di una sonda specifica in un Southern blot produce un segnale debole nonostante controlli positivi confermati, quale modifica alla composizione del transfer buffer migliorerebbe l'efficienza del trasferimento di DNA di grandi dimensioni (>10 kb) dal gel alla membrana?
Quale approccio, tra le seguenti modifiche al protocollo di Southern blotting, sarebbe più efficace per aumentare la sensibilità nella rilevazione di una singola copia di un gene specifico in un genoma eucariotico complesso, minimizzando al contempo il rumore di fondo?
Quale approccio, tra le seguenti modifiche al protocollo di Southern blotting, sarebbe più efficace per aumentare la sensibilità nella rilevazione di una singola copia di un gene specifico in un genoma eucariotico complesso, minimizzando al contempo il rumore di fondo?
Supponendo che, dopo aver eseguito un Southern blot, si riscontri che il DNA è stato trasferito in modo inefficiente dal gel alla membrana, rimanendo prevalentemente all'interno del gel, quale delle seguenti modifiche al setup del trasferimento sarebbe la più efficace per risolvere il problema, considerando che la membrana è appropriata e il buffer è stato preparato correttamente?
Supponendo che, dopo aver eseguito un Southern blot, si riscontri che il DNA è stato trasferito in modo inefficiente dal gel alla membrana, rimanendo prevalentemente all'interno del gel, quale delle seguenti modifiche al setup del trasferimento sarebbe la più efficace per risolvere il problema, considerando che la membrana è appropriata e il buffer è stato preparato correttamente?
Considerando l'uso combinato di endonucleasi di restrizione e ligasi T4 DNA in un protocollo di clonaggio avanzato, quale delle seguenti affermazioni descrive più accuratamente la strategia ottimale per massimizzare l'efficienza di ligazione post-digestione con enzimi che generano estremità coesive non compatibili?
Considerando l'uso combinato di endonucleasi di restrizione e ligasi T4 DNA in un protocollo di clonaggio avanzato, quale delle seguenti affermazioni descrive più accuratamente la strategia ottimale per massimizzare l'efficienza di ligazione post-digestione con enzimi che generano estremità coesive non compatibili?
In un esperimento di digestione del DNA genomico con una endonucleasi di restrizione che riconosce un sito esanucleotidico distribuito casualmente nel genoma, quale metodo supporterebbe l'analisi della completezza della digestione e l'assenza di attività star non specifica?
In un esperimento di digestione del DNA genomico con una endonucleasi di restrizione che riconosce un sito esanucleotidico distribuito casualmente nel genoma, quale metodo supporterebbe l'analisi della completezza della digestione e l'assenza di attività star non specifica?
Quale delle seguenti modifiche o metodologie implementate durante una reazione di ligazione con T4 DNA ligasi non incrementerebbe significativamente l'efficienza di formazione di concatameri lineari a partire da frammenti di DNA con estremità coesive?
Quale delle seguenti modifiche o metodologie implementate durante una reazione di ligazione con T4 DNA ligasi non incrementerebbe significativamente l'efficienza di formazione di concatameri lineari a partire da frammenti di DNA con estremità coesive?
In una strategia di mutagenesi sito-specifica basata sull'utilizzo di PCR con primer contenenti la mutazione desiderata, quale approccio minimizzerebbe la formazione di artefatti dovuti all'incorporazione errata di nucleotidi da parte della DNA polimerasi?
In una strategia di mutagenesi sito-specifica basata sull'utilizzo di PCR con primer contenenti la mutazione desiderata, quale approccio minimizzerebbe la formazione di artefatti dovuti all'incorporazione errata di nucleotidi da parte della DNA polimerasi?
Durante la preparazione di una libreria di cDNA per RNA-Seq, quale delle seguenti strategie implementate durante la sintesi del primo filamento di cDNA non contribuirebbe significativamente a ridurre la formazione di artefatti derivanti dalla trascrizione inversa non specifica e dalla formazione di hairpin?
Durante la preparazione di una libreria di cDNA per RNA-Seq, quale delle seguenti strategie implementate durante la sintesi del primo filamento di cDNA non contribuirebbe significativamente a ridurre la formazione di artefatti derivanti dalla trascrizione inversa non specifica e dalla formazione di hairpin?
In un protocollo di DNA footprinting per identificare i siti di legame di una proteina su una specifica sequenza di DNA, quale delle seguenti modifiche al protocollo aumenterebbe significativamente la risoluzione della mappa di protezione e rivelerebbe interazioni proteina-DNA deboli o transitorie?
In un protocollo di DNA footprinting per identificare i siti di legame di una proteina su una specifica sequenza di DNA, quale delle seguenti modifiche al protocollo aumenterebbe significativamente la risoluzione della mappa di protezione e rivelerebbe interazioni proteina-DNA deboli o transitorie?
Quale delle seguenti modifiche apporterebbe il miglioramento più significativo alla specificità di amplificazione in una reazione di PCR multiplex volta ad identificare diverse varianti alleliche in un campione di DNA genomico complesso?
Quale delle seguenti modifiche apporterebbe il miglioramento più significativo alla specificità di amplificazione in una reazione di PCR multiplex volta ad identificare diverse varianti alleliche in un campione di DNA genomico complesso?
Durante un esperimento di ChIP-Seq (Chromatin Immunoprecipitation sequencing) per mappare le regioni del genoma a cui si lega una specifica proteina, quale delle seguenti strategie non contribuirebbe a migliorare la risoluzione e la specificità della mappatura dei siti di legame?
Durante un esperimento di ChIP-Seq (Chromatin Immunoprecipitation sequencing) per mappare le regioni del genoma a cui si lega una specifica proteina, quale delle seguenti strategie non contribuirebbe a migliorare la risoluzione e la specificità della mappatura dei siti di legame?
Flashcards
Precipitazione del DNA
Precipitazione del DNA
Processo per separare il DNA dalla soluzione aggiungendo etanolo o isopropanolo.
Isopropanolo (nella precipitazione)
Isopropanolo (nella precipitazione)
Utilizzato principalmente con RNA per massimizzare il volume della soluzione acquosa.
Tris-EDTA
Tris-EDTA
Soluzione usata per risospendere il DNA precipitato.
Ioni magnesio (Mg2+)
Ioni magnesio (Mg2+)
Signup and view all the flashcards
DNAsi
DNAsi
Signup and view all the flashcards
Etanolo al 75%
Etanolo al 75%
Signup and view all the flashcards
CTAB
CTAB
Signup and view all the flashcards
Polisaccaridi
Polisaccaridi
Signup and view all the flashcards
Sferoplasto
Sferoplasto
Signup and view all the flashcards
Triton
Triton
Signup and view all the flashcards
Denaturazione Alcalina
Denaturazione Alcalina
Signup and view all the flashcards
DNA genomico lineare
DNA genomico lineare
Signup and view all the flashcards
Plasmidi
Plasmidi
Signup and view all the flashcards
Deproteinizzazione
Deproteinizzazione
Signup and view all the flashcards
Cromatografia a scambio ionico
Cromatografia a scambio ionico
Signup and view all the flashcards
Corsa Elettroforetica
Corsa Elettroforetica
Signup and view all the flashcards
Elettroforesi di acidi nucleici
Elettroforesi di acidi nucleici
Signup and view all the flashcards
Agarosio
Agarosio
Signup and view all the flashcards
Acrilammide
Acrilammide
Signup and view all the flashcards
Nucleasi
Nucleasi
Signup and view all the flashcards
Elettroforesi in campo pulsato
Elettroforesi in campo pulsato
Signup and view all the flashcards
Loading buffer e glicerolo
Loading buffer e glicerolo
Signup and view all the flashcards
Esonucleasi
Esonucleasi
Signup and view all the flashcards
Coloranti intercalanti
Coloranti intercalanti
Signup and view all the flashcards
Endonucleasi
Endonucleasi
Signup and view all the flashcards
Endonucleasi di restrizione
Endonucleasi di restrizione
Signup and view all the flashcards
Transilluminatore o gelDOC
Transilluminatore o gelDOC
Signup and view all the flashcards
Marcatore di pesi molecolari
Marcatore di pesi molecolari
Signup and view all the flashcards
Ligasi
Ligasi
Signup and view all the flashcards
T4 DNA ligasi
T4 DNA ligasi
Signup and view all the flashcards
Polimerasi
Polimerasi
Signup and view all the flashcards
DNA polimerasi I
DNA polimerasi I
Signup and view all the flashcards
Enzimi di restrizione
Enzimi di restrizione
Signup and view all the flashcards
Elettroforesi su gel
Elettroforesi su gel
Signup and view all the flashcards
Soluzione denaturante
Soluzione denaturante
Signup and view all the flashcards
Depurinazione
Depurinazione
Signup and view all the flashcards
Soluzione neutralizzante
Soluzione neutralizzante
Signup and view all the flashcards
Castelletto di trasferimento
Castelletto di trasferimento
Signup and view all the flashcards
Wick (Blotting paper)
Wick (Blotting paper)
Signup and view all the flashcards
Membrana di nitrocellulosa/nylon
Membrana di nitrocellulosa/nylon
Signup and view all the flashcards
Cos'è il trasferimento DNA?
Cos'è il trasferimento DNA?
Signup and view all the flashcards
Come si fissa il DNA alla membrana?
Come si fissa il DNA alla membrana?
Signup and view all the flashcards
Cos'è l'incubazione con probe radioattivi?
Cos'è l'incubazione con probe radioattivi?
Signup and view all the flashcards
Caratteristiche della nitrocellulosa?
Caratteristiche della nitrocellulosa?
Signup and view all the flashcards
Caratteristiche del Nylon?
Caratteristiche del Nylon?
Signup and view all the flashcards
Effetto delle membrane cariche positivamente?
Effetto delle membrane cariche positivamente?
Signup and view all the flashcards
Cos'è la preibridazione?
Cos'è la preibridazione?
Signup and view all the flashcards
Dove avviene l'ibridazione?
Dove avviene l'ibridazione?
Signup and view all the flashcards
Study Notes
Ecco le note di studio dettagliate del testo fornito:
- DNA è una molecola a doppia elica soggetta a rotture durante la manipolazione.
- I nucleotidi sono l'unita ripetitiva del DNA, comprendono tre gruppi distinti.
Tipi di DNA da purificare
- DNA cellulare totale: include DNA genomico e qualsiasi altro DNA nella cellula.
- DNA plasmidico: contiene solo DNA plasmidico, escludendo quello genomico.
- DNA fagico: include esclusivamente il DNA virale da particelle virali o cellule batteriche infette, ad esempio M13.
Isolamento del DNA cellulare totale
Processo di estrazione
- Processo fondamentale suddiviso in 4 passaggi
- I primi tre passaggi, a partire dalla matrice, dipendono dalla estrazione del DNA di cellula batterica
- Colture batteriche cresciute e raccolte mediante centrifugazione rappresentano il passo iniziale.
- Le cellule raccolte vengono lisate per ottenere un estratto cellulare.
- La purificazione rimuove componenti indesiderati come zuccheri e proteine.
- La concentrazione del DNA è aumentata in soluzione per una più efficace manipolazione.
Coltura Batterica
- L'inoculazione di batteri nel brodo di coltura LB medio avviene in modo che crescano sufficientemente.
- I mezzi di coltura possono essere definiti (quantificazione degli elementi) o complessi (elementi non specifici).
- Il pH è portato a 7.5 con NaOH, la sterilizzazione si ottiene con autoclave e la coltura cresce overnight a 37° a 150-250 rpm, incrementando il numero di cellule.
- La densità ottica (OD600) viene usata per stimare il numero di cellule batteriche e per valutare l'avvenuta crescita
- L'OD aumenta in base alla concentrazione cellulare
- La relazione tra OD e numero di cellule viene definita curva standard.
- Per E.coli, una unità di densità ottica corrisponde a 0.8 x 10^9 cellule/ml.
- Le cellule cresciute si raccolgono per centrifugazione in forma di pellet per l'estrazione del DNA.
Produzione dell'estratto cellulare
- Il processo consiste nell'attivazione della lisi per rompere gli involucri cellulari e rilasciare il contenuto nella soluzione.
- La lisi può avvenire attraverso metodi fisici, chimici o enzimatici.
- Metodi fisici comprendono, la rottura della parete per pressione o sonicazione, utili per le cellule vegetali.
- Metodi chimici ed enzimatici prevedono l'uso di lisozima ed EDTA per degradare la parete cellulare di E.coli o detergenti per solubilizzare le membrane.
- Spesso si combinano i metodi, pre-trattamento enzimatico e chimico.
Buffer e contaminanti
- Si ottiene così un estratto con frazioni di membrana e parete che possono essere separate mediante centrifugazione.
- Un buffer di lisi facilita la degradazione e rimozione dei contaminanti.
- Si utilizzano inattivatori delle nucleasi come EDTA, RNasi e betamercaptoetanolo.
- Il buffer di lisi va ottimizzato in base alle matrici utilizzate.
- Le matrici si dividono in semplici (colture batteriche, cellule animali e vegetali) e complesse (molteplici componenti cellulari).
Estrazione da cellule vegetali
- La rottura meccanica tramite congelamento in azoto liquido e pestatura nel mortaio è essenziale.
- L'aggiunta di buffer di lisi con EDTA serve a prevenire l'attivazione delle nucleasi.
Considerazioni sulla temperatura
- E importante lavorare a bassa temperatura per non attivare le DNasi ed evitare che attacchino il DNA.
- Oltre alla pestatura, si possono usare dei mulini con biglie di silice refrigerate.
Purificazione del DNA
- La fase successiva separa DNA dalle proteine e dall'RNA.
Liberazione
- Liberare DNA da proteine e/o zuccheri e altri contaminanti.
- Sono di solito presenti due opzioni:
- A. Digestione enzimatica con proteinasi K.
- B. Separazione fisica del DNA tramite solventi organici o resine/cromatografia.
Uso di solventi organici
-
Mescola di fenolo aggiunta all'estratto cellulare, le proteine passano al solvente organico, tramite centrifugazione si separano le fasi acquosa (DNA) e organica (solvente e proteine).
-
L'interfaccia è dove si trovano le proteine coagulate.
-
Il recupero dello strato acquoso deve essere effettuato con attenzione per non prelevare anche l'interfaccia proteica.
-
Solitamente, è necessario ripetere i lavaggi, però si rischia che in questo modo il DNA venga perso e danneggiato.
-
La pre-digestione con proteinasi K può precedere il passaggio con solvente organico per facilitare l'estrazione delle proteine.
-
La cromatografia a scambio ionico si basa sull'uso di particelle cariche positivamente.
-
L'estratto cellulare viene caricato sulla colonna cromatografica.
-
Aumentando il sale, si eluisce il DNA.
-
Il guanidio tiocianato favorisce l'attacco del DNA alle particelle di silice e poi l'acqua lo stacca.
-
Il sistema può essere sia in soluzione che su colonna e richiede RNasi per rimuovere l'RNA.
DNA Extraction
- Le particelle di silice sono fissate a microsfere magnetiche per catturare il DNA in soluzione.
- Al buffer di lisi vengono aggiunte le particelle magnetiche che si legano al DNA
- Il DNA viene trattenuto dai lavaggi tramite magnete esterno
Vantaggi e svantaggi dei metodi cromatografici
- Il metodo cromatografico elimina gli inibitori, è veloce, non usa fenolo e permette lo scale-up, ma la taglia e resa del DNA sono minori.
- L'uso di solventi organici assicura una resa maggiore anche se meno pulito.
Concentrazione del DNA
- Si mira a concentrare il DNA e ridurre il contenuto di acqua.
- La precipitazione avviene con etanolo o isopropanolo in diverse quantità
- Preferibile isopropanolo con RNA e etanolo con DNA.
- Alcol e sale in soluzione.
- Durante la lavorazione bisogna fare attenzione.
Altre considerazioni
- La soluzione viene poi centrifugata e il DNA si raccoglie sul fondo, lavato con etanolo al 75% per eliminare i sali, e poi sciolto in acqua.
Osservazioni sui vari reagenti
- CTAB: detergente in presenza di polisaccaridi, previene attacco di polisaccaridi ed il dna resta in soluzione
- EDTA: chela gli ioni magnesio e blocca l'attività delle nucleasi, ideale per conservare il DNA.
- Betamercaptoetanolo: rompe i ponti disolfuro proteici, tossico
- Guanidinio: favorisce il legame silice-DNA e denatura le proteine.
Altre considerazioni
- Evitare vortex e puntali stretti per prevenire la rottura del DNA
- Per aumentare il DNA genomico ed eliminare mitocondri e cloroplasti, si procede alla purificazione dei nuclei
- I kit commerciali sono spesso la soluzione migliore, anche se hanno una resa minore, mentre le migliori sono veloci e facili da usare.
Isolamento del DNA plasmidico
- I passaggi sono analoghi all'isolamento del DNA cellulare totale, ma sfruttano le differenze chimico-fisiche, come dimensione e conformazione.
- Il DNA plasmidico è più piccolo del genomico e spesso superavvolto.
Diversa dimensione
- La rottura della parete cellulare avviene con lisozima + EDTA, con saccarosio al 25% per proteggere la cellula.
- Si forma uno sferoplasto che ha una rottura parziale della parete
- Un detergente (Triton) causa la rottura della membrana plasmatica, rilasciando DNA genomico legato a pezzi di membrana.
- La centrifugazione rimuove i detriti cellulari, lasciando i plasmidi in soluzione.
- Esiste la possibilità di avere pezzi di DNA genomico che contaminano la soluzione.
Conformazione
- Il DNA plasmidico batterico è circolare e si può presentare in forma superavvolta e rilassata tramite nick
Denaturazione alcalina
- Questo processo viene sfruttatato
- Se il DNA rilassato è sottoposto a un pH alcalino si denatura e va a singolo filamento a differenza di quello superavvolto e non trattato.
- acidificando a pH 7 il DNA a singolo filamento precipita, mentre i plasmidi rimangono in soluzione. Questo metodo pare sia il più efficiente tra quelli precedenti.
Isolamento del DNA fagico
- Le cellule batteria che sono state infettate da fagi rilasciano le proprie particelle fagiche dall'esterno delle cellule, nella coltura extracellulare.
- Il DNA viene in seguito recuperato dal mezzo extracellulare
Procedura
- Centrifugazione per sedimentare i batteri.
- Deproteinizzazione con proteasi per rimuovere capside virale.
- Cromatografia a scambio ionico per recuperare il DNA
- Condurre l'infezione in modo tale da avere un livello di produzione di particelle virali molto alto è difficoltoso dal momento che, - Se l'infezione e troppo violenta le cellule batteriche muoiono, - Mentre se e troppo blanda il quantitativo di particelle virali sarebbe insufficiente
Valutazione
- è possibile valutare la quantita e la qualità del DNA mediante corsa elettroforetica.
- Infatti gli acidi nucleici sono caricati e possono essere separati tramite -campo elettrico in presenza di una matrice porosa in una cameretta con 2 elettrodi con tampone(TAE 1x0 e TBE 1/0,5x) con EDTA.
- La velocità di migrazione dipende sia dalle dimensioni che in parte dalla forma del complesso
La matrice
- La matrice può essere: - AGAROSIO Consente la fase di separazione di elementi con differenza superiore a 20/30 bp ed e formato da un polisaccaride che crea una matrice porosa(per frammenti compresi tra i 50 bp-25kbp) - Per frammenti piccolo e frammenti grandi la corsa viene effettuata a voltaggio costante - Vi sono anche versioni modificate per taglie più piccole o più grandi - ACRILAMMIDE ha una maggiore risoluzione e permette di separare elementi molto simili tra loro
Considerazioni
- e quindi molto importante effettuare correzioni e adatte in base a ciò che si vuole separare.
- al fine di separare segmenti molto grandi di dimensioni si utilizza elettroforesi in campo pulsato: campo che varia in modo alternato in quanto gli elettrodi sono posti a 45 gradi.
Per la separazione
- Vengono utilizzati un loading buffer contente colorante e glicerolo assieme ai campioni. -Storicamente si utilizzava etidio bromuro (ormai mutageno) mentre ad oggi si utilizzano altre sostanze intercalanti del DNA.
- Viene quindi visualizzato con transluminatore o gelDOC o con metodi radioattivi come il silver staining
- Al termine della corsa sarà possibile osservare le bande:DNA genomico(alto) prodotti di PCRT(basso).
- è possibile stimare la dimensione dei frammenti utilizzando un marcatore di pesi molecolari.
- Confronta il fago lambda tra la scala con la scala, si vede quale intensità di banda ha il nostro campione e dove collocarlo.
- si ottiene anche una stima qualitativa: DNA integro= unica banda, altrimenti strisciata di diversi pesi molecolari
- Al termine della corsa sarà possibile osservare le bande:DNA genomico(alto) prodotti di PCRT(basso).
Microfluidica
- Si posso anche utilizzare per visualizzare frammenti - Chip con diversi pozzetti e canali con una matrice
Analisi spettrofotometrica
-
Il picco assorbanza si ha a 260nm e si utilizza per misurare la concentrazione. - E necessario fare alcune considerazione tra cui tra 0, ed 1 OD. Poi si utilizza cuvette trasparenti a UV
-
Si utilizza poi tale trasformazione 1 OD=50 ng/ul (dsDNA) / 40 ng/ul (ssDNA)
-
Si possono misurare anche assorbanze delle proteine(rapporto 1,8-2), guanidio, fenolo e polisaccaridi
-
il nanodrop serve per non sprecare campione - si carica anche per 1,5-2 ul.
Manipolazione enzimatica del DNA purificato
- E possibile manipolare tramite enzimi purificati esternamente o prodotti in maniera ricombinante e che svolgono diversi ruoli
Nucleasi
- Sono i più importanti e tagliano il DNA solitamente nel legame fosfodiesterico. - Esonucleasi - Endonucleasi - Restrizione= taglia in corrispondenza di sequenza specifiche. - Prodotti= estremità appiccicose/ estremità piatte - Si stimano quante volte taglia
Restrizione
- Restrizione= DNA+ buffer.
- Si incuba a 37 gradi con enzimi di restrizione. Purificare solo per clonaggio.(ore di digestione in base a clonaggio)
- Controllo buffer enzimi per utilizzare più di un enzima.
Ligasi
-
Unire molecole di acidi
-
Utilizza sia estremità piatta /coesive
-
PCR utilizando primer con aggiunti i siti di restrizione
-
Polimerasi= enzimi che copiano
-
dna polimero e riparazione
-
Frammento kiemow
-
Taq DNA (alta T)
-
Trascrittati inversi(rna per cdna)
Enzimi di modificazione
-
Rimuovono o aggiungono gruppi chimici
-
Fosfatasi alaina
-
Aggiungendo un fosfato (posizione 5):POLINUCLEOTIDE CHAIN Queste due funzioni risultano utili per sostituire un fosfato presente (radioattivo o marcato)
IBRIDAZIONE MOLECOLARE
- La temperatura elevata permette la denaturalizzazione tramite cui il dna passa da doppia elica a singola elica. e possibile riformare il dna.
- Dipendente dalla composizione=> Maggiore contenuto di GC= maggiore calore per la denaturazione.
- E possibile stimare la temperatura di melting tramite la sequenza. A tale temp il 50 % del dna e denaturato.
- Due frammenti snigli filamento e eabbassando la T per e farli ibridare.
- e necessario un legame sufficientemente forte tramite cui competere le forze di "staccaggio".
Possibilità (DNA/DNA).
- Studiare organizzazione dei GENI nel GENOMA TRAMITE southren BLOoting e librerie.
Diverse applicazioni
- Definisci il numero dei geni che si possono trovare -( SOouthren)
- Verificano organismo transgenici (quante copie).
- Isolano e identificano il geni. In transgenici
- Analisi macro array Concludendo, le note coprono un vasto numero di argomenti, dalle tecniche di base di manipolazione del DNA agli approcci più avanzati come l'ibridazione molecolare.
Studying That Suits You
Use AI to generate personalized quizzes and flashcards to suit your learning preferences.
Related Documents
Description
Appunti sulla purificazione del DNA, inclusi i tipi (cellulare totale, plasmidico, fagico) e il processo di estrazione. Il processo di estrazione prevede la crescita di colture batteriche, la lisi cellulare e la purificazione.
