Metodologie per l'analisi e la manipolazione del DNA - PDF

-Costituito da : zucchero desossiribosio+ fosfato + base azotata. La porzione 3’ terminale si lega con il fosfato a 5’ della base azotata successiva. Lez 1 mod 2 - 21/10/24 -CG = 3 legami H -A T = 2 legami H...

-Costituito da : zucchero desossiribosio+ fosfato + base azotata. La porzione 3’ terminale si lega con il fosfato a 5’ della base azotata successiva. Lez 1 mod 2 - 21/10/24 -CG = 3 legami H -A T = 2 legami H chimicamente inerte e stabile Soggetto a rotture della doppia elica METODI PER L’ANALISI DEL DNA E DEI GENOMI Il DNA è una molecola lunga double strand che spesso è soggetta a rotture nella lunghezza durante la manipolazione. I nucleotidi sono costituiti da tre diversi gruppi e rappresentano l’unità ripetitiva alla base del DNA. Si estrae da colture batteriche, vegetale o animale complessa. Non si ha distinzione nell’estrazione dei dna. Es. Per una cellula si fa estrazione e si Ci sono diverse tipologie di DNA da purificare: ottiene dna di organuli - DNA cellulare totale: include DNA genomico e il qualsiasi altro DNA presente nella cellula - DNA plasmidico: solo DNA plasmidico, senza genomico - DNA fagico: solo DNA virale da particelle virali o cellule batteriche infette con virus (es M13) Isolamento del DNA cellulare totale Sono presenti 4 passaggi fondamentali. I punti in comune sono gli ultimi 3 mentre il primo dipende dalla matrice di partenza. Esempio: estrazione di DNA da cellula batterica Questi passaggi sono quelli fondamentali. si usa matrice solo per colture. Se uso sangue non processo iis So serve usare matrice. -- p 1. Otteniamo la coltura batterica che viene fatta crescere e raccolta per centrifugazione 2. Le cellule vengono prelevate e lisate per generare un estratto cellulare I ATTRAVERSO LIS 3. Purificazione per la rimozione di tutto ciò che non è DNA CZuccher ! protec.800ml H2o 5 g yeast extract 4. Concentrazione del DNA per averne una maggiore concentrazione in soluzione 10g Nacl Autoclava LB LUCH BERTAN = Aggiusta ph a 7.5 NaOH MEDIUM Melt agar Aggiusta volume Sterilizza autoclave 1. OTTENERE LA COLTURA # È necessario inoculare i batteri nel brodo di coltura (LB) ovvero un mezzo contenente le sostanze necessarie per la crescita. I mezzi di coltura possono essere: - definiti: si ha una quantificazione dei diversi elementi - complessi: la composizione dei diversi elementi non è specifica ma contengono sostanze che possono essere leggermente variabili Non si hanno quantativi definiti e precisi di composti che permetttano la crescita. Si aggiusta poi il pH a 7.5 con NaOH, la soluzione viene autoclavata per garantire la sterilità e la coltura viene cresciuta overnight a 37º a 150-250 rpm e si verifica un aumento esponenziale del numero di cellule. Prima però bisogna effettuare una curva standard. Le Per vedere se la crescita batterica è avvenuta o meno si possono fare analisi di densità ottica (OD600) per avere una stima del numero di cellule batteriche. L’OD cresce a seconda del quantitativo di cellule che abbiamo in concentrazione ed è 40 possibile plottare (retta di taratura) l’OD contro il numero di cellule in coltura. ! 1 unità di densità ottica corrisponde a 0,8 x 109 cell/ml → specifico per E.coli Una volta che sappiamo che le cellule sono cresciute si raccolgono per centrifugazione sotto forma di pellet in modo da poter estrarre il DNA. F 2. PRODUZIONE DELL’ESTRATTO CELLULARE Consiste nell’attivazione di un processo di lisi per rompere i diversi involucri affinché il contenuto cellulare venga rilasciato nella soluzione in cui stiamo lavorando. La lisi può procedere con diversi approcci: - metodi fisici: rottura della parete per pressione con il metodo della sonicazione, macinazione in azoto con sairercie liquido mine Utilizzato spesso quando si lavora con cellule vegetali in modo da rompere la parete. e - metodi chimici ed enzimatici: lisozima + EDTA per la degradazione della parete cellulare di E.coli, oppure utilizzo di detergenti che solubilizzano le membrane (con SDS si verifica anche la rottura dei nuclei) Impiegati quando si lavora con membrane e non pareti. I passaggi possono essere combinati → si può verificare un pre-trattamento enzimatico seguito da metodi chimici oppure da altri metodi di tipo fisico. · Si ottiene quindi un estratto con frazioni di membrana e parete che essendo più pesanti possono essere · - separate tramite centrifugazione. CROME) Le cellule batteriche vengono solubilizzate in un buffer di lisi per facilitare la degradazione e la rimozione dei contaminanti: - inattivatori delle nucleasi: quando vengono rilasciate vengono attivate e degradano il DNA. Es EDTA che chela ioni magnesio che sono i cofattori delle nucleasi. PUB , CTAB , RNASI , BETALTERCAPAETANOLO - RNasi per la degradazione dell’RNA - betamercaptoetanolo per la degradazione delle proteine - CTAB o PVP per l’eliminazione dei polisaccaridi ll si Parti da [ - ‼ Il buffer di lisi varia in base alle diverse matrici nu ed è un passaggio che deve essere ottimizzato incluso ORCAMSITI CIE quello della rottura della parete. STAL4OLISANOC Le matrici sono diverse e possono essere classificate come: - Matrici semplici come colture batteriche oppure di cellule animali e vegetali Tutto il materiale è di una sola tipologia. - Matrici complesse come matrici che contengono diverse componenti cellulari Diversi componenti come ad esempio un alimento lavorato. In base al tipo di matrice si applicano tecniche con ottimizzazioni diverse. Nella raccolta e lisi Estrazione da cellule vegetali Nelle cellule vegetali è presente la parete che comporta un passaggio di rottura meccanica: si congela in azoto liquido il tessuto e si pesta nel mortaio. Producendo una polvere fine si verifica la rottura delle membrane. Quando la temperatura scende u si attivano le nucleasi e per questo viene aggiunto il buffer di SALE lisi con EDTA. CONASI) ‼ è quindi importante lavorare a basse temperature. È importante lavorare a basse temp in modo da non permettere attivazione delle dnasi che attaccno il dna. La rottura può avvenire anche grazie a dei mulini che causano rotazione di eppendorf nella quale sono contenute insieme al campione delle biglie di silice. 41 Il campione deve essere mantenuto al freddo., subito dopo la macinazione si deve mettere in azoto. Nel caso in cui vi sia un elevato numero di campioni da analizzare si utilizzano dei mulini meccanici che lavorano in eppendorf dove all’interno si trova il tessuto congelato e biglie di tungsteno o silice. Il macchinario muove le piastre e le palline nelle eppendorf macinano il tessuto e producono la polvere. Può lavorare in piastre da 96, utilizzando due piastre o con un rotore con 24 posizioni per eppendorf. È possibile anche utilizzare un micropestello e lo si fa in eppendorf. Estrazione da cellule animali In questo caso non è necessaria la rottura meccanica in azoto liquido ma si vanno a rompere le cellule e vengono utilizzati i detergenti. In quanto manca la parete cellulare Estrazione da matrici complesse In caso di matrici complesse bisogna fare un’ottimizzazione e comprendere quali sono le sostanze chimiche presenti all’interno. Ci si serve della letteratura per indicazioni precise su come procedere. 42 3. PURIFICAZIONE DEL DNA Il passaggio successivo è quello della separazione dei diversi componenti dal DNA tra cui proteine e RNA. Liberazione del DNA da proteine e/o zuccheri ed altri contaminanti Sono presenti 2 diverse opzioni: A. Digestione enzimatica delle proteine con proteinasi K B. Presenza di altri componenti oltre alle proteine: separazione fisica del DNA rispetto ad altri contaminanti Non si distruggono i contaminanti ma vengono separati dal dna. SCAPPA B1. Utilizzo di solventi organici quali fenolo o una miscela di cloroformio+fenolo che consentono di sequestrate le proteine nel solvente organico I solventi portano via tutto ciò che non è dna in quanto dna è solubile in parte acquosa e rimane solubilizzato. B2. Cattura di DNA con resine di silice o cromatografia a scambio ionico Uso di solvente organico All’estratto cellulare viene aggiunta la miscela di fenolo. Si mescola bene e le proteine vanno in soluzione nel solvente organico. Tramite centrifugazione si verifica la separazione della fase acquosa e quella del solvente organico. Lo strato acquoso si trova nella parte superiore e contiene il DNA mentre nella parte inferiore si trova il solvente organico. Le proteine coagulate invece sono all’interfaccia tra il solvente organico e la fase acquosa. Non è detto che un singola applicazione di solvente organico sia sufficiente. E quindi si fa più volte, ma più òavaggi = più perdita di DNA. Quindi si utilizza un approccio ibrido in cui si applicano anche proteine K per distruggere buona. Parte delle prot. È possibile recuperare lo strato acquoso facendo attenzione a non prelevare anche l’interfaccia di proteine e trasferirlo all’interno di un’altra eppendorf. - I OPERAZIONE DA FARE N soru cart ChCApe Le proteine possono essere molte e un’unico lavaggio potrebbe non essere sufficiente per questo il passaggio deve essere ripetuto più volte ma queso determina perdita e rottura di parte del DNA. In alcuni casi quando ci sono molte proteine si precede il passaggio del solvente organico con quello dell’utilizzo della proteinasi K per tagliare le proteine complesse affinché possano essere facilmente estratte dal solvente organico. Metodo cromatografico Si basa sull’utilizzo di particelle cariche positivamente per effettuare una cromatografia a scambio ionico. 43  Viene caricato l’estratto cellulare sulla colonna cromatografica. Il DNA si lega alle particelle cariche positivamente per questioni elettriche e quello che non serve passa attraverso la colonna. Aumentando la concentrazione di sale che maschera le cariche elettriche si favorisce il rilascio del DNA. ! La quantità di sale può essere aggiunta in diverse concentrazioni per ottenere un gradiente in modo da differenziare l’eluizione: in primis proteine e RNA e successivamente aumentano la concentrazione di sale il DNA. Il guanidio tiocianato va a sfavorire il legame tra dna e acqua favorendo quello delle particelle di silice. COLONME MINIPRED : In alternativa è possibile utilizzare particelle di silice che in presenza di guanidio tiocianato legano in maniera specifica il DNA. La sostituzione viene poi sostituita con acqua e il DNA si stacca. Può essere effettuato sia in soluzione che in colonna. NB:In questo caso per la rimozione dell’RNA è necessario aggiungere RNasi Magnetic beads based DNA extraction È un sistema evoluto che consente di utilizzare particelle di silice fissate a microsfere magnetiche per catturare in soluzione direttamente il DNA. Al buffer di lisci m vengono aggiunte le particelle magnetiche di silice che catturano il DNA. L’utilizzo di un magnete esterno consente di trattenere il DNA durante i lavaggi. Ci si trova poi nelle condizioni di eluizione e si ricatteranno le biglie da cui è stato rimosso il DNA e in soluzione sarà presente quindi DNA e RNA. ↑ Durante il washing le sferette magnetiche legano il dna impedendo di andarsene con il resto dei composti durante l’eluizione. Vantaggi e svantaggi dei metodi cromatografici Vantaggi: consente l’eliminazione di potenziali inibitori di successive reazioni a differenza dalla tecnica che sfrutta il solvente organico, è molto veloce, non si utilizza il fenolo che è una sostanza tossica e le biglie magnetiche consentono lo scale up ovvero di poter estrarre un numero maggiore di campioni. Non Se Svantaggi: il DNA recuperato ha taglia minore e minor resa. Questo perché la resina può saturarsi e non A essere più in grado di legare DNA e le diverse manipolazioni per caricare il DNA in colonna potrebbero causarne la rottura. ~ A volte è necessario ottenere dna perfettamente intatto e quindi conviene usare solventi. Se invece serve poco dna e può avere anche rotture usa il KIT con colonina cromatografica. ! ottengo più DNA con l’utilizzo di solventi organici, anche se meno pulito. 4. CONCENTRAZIONE DEL DNA Abbiamo ora una soluzione acquosa con all’interno del DNA ma la sua concentrazione è bassa. Il nostro obiettivo è quello di concentrarlo e quindi ridurre il contenuto di acqua. 44  · 0 G Volt VOLTE IL X0 6. :. XI = I di ena orenut. il vollite di estratto volte OTTENU TO ↑ E Si procede quindi la precipitazione del DNA con etanolo (X2) o isopropanolo (0,6X). Si utilizza una diversa quantità in base all’alcol che si utilizza: l’isopropanolo si utilizza principalmente con l’RNA in modo da massimizzare il quantitativo di soluzione acquosa e lavorare in eppendorf. L’etanolo viene preferibilmente usato con DNA. Si lavora a freddo e in presenza di sali. Questo determina la precipitazione del DNA che da origine a maglie di DNA in forma precipitata. È possibile inserire una bacchetta di vetro e la maglia si lega ad essa. Normalmente però si centrifuga e si raccoglie il DNA sul fondo. Il pellet vine lavato e risospeso in H2o o tris- EDTA che chela ioni magnesio che sono cofattori di molti enzimi quali DNAsi che rompono il dna. Chelando gli ioni si tolgono i cofattori. Il dna può essere così conservato a 4° Viene poi rimosso l’etanolo ed è possibile scogliere il DNA in un quantitativo di acqua molto più basso. Spesso prima il pellet viene lavato con etanolo al 75%, che contiene quindi una percentuale di acqua, per eliminare la concentrazione dei sali. In questo passaggio si può perdere del DNA. Osservazioni sui vari reagenti NEL BOFFER Ol s CTAB: è un detergente che viene utilizzato per l’estrazione del DNA da cellule vegetali in presenza di numerose quantità di polisaccaridi. Questo si lega al DNA e previene l’attacco dei polisaccaridi. Il DNA può rimanere in soluzione se ci troviamo in presenza di sale a una concentrazione superiore a 0,7 M e se CTAB viene aggiunto prima che il campione si scongeli oppure in assenza di sale il DNA precipita e si parla di protocollo CTAB invertito. EDTA: chela ioni magnesio e blocca l’attività delle nucleasi. Per conservare il DNA è meglio che ci sia una soluzione bufferata TRIS- EDTA → conservazione in frigorifero a 4℃ senza degradazione. Betamercaptoetanolo: si aggiunge nel buffer di lisi e rompe i ponti disolfuro contribuendo così alla denaturazione delle proteine. È tossico. -I da Accuncere SOTTO CAPPA Guanidinio tiocianato: è un agente cautropico che interferisce con i legami idrogeno dell’H₂0 denaturando proteine ed altre molecole. Favorisce il legame tra silice e DNA. Importante: evitare l’utilizzo del vortex o puntali troppo stretti e pipettare. Si potrebbe verifica la rottura del DNA. Per questo vengono utilizzati puntali blu tagliati affinché il buco sia più grande. DIMINISTE PRESSIONE Se si vuole aumentare la proporzione di DNA genomico e liberarsi di mitocondri e cloroplasti si procede con la purificazione dei nuclei. È necessario utilizzare condizioni di lisi più mild per evitare la rottura ONA serle perché ena hitoconerali e claroplasi è poco dell’involucro nucleare. per oremere Il tocatente Non I MCE L Si Isolano. KIT COMMERCIALI: esempio DNeasy blood mini kit per l’estrazione di DNA direttamente dal sangue I kit sono la soluzione migliore e si basano spesso su resine di silice o altre matrici cromatografiche. Non utilizzano composti tossici, sono veloci e facili da usare. Hanno però una scarsa utilità per recuperare frammenti integri di grandi dimensioni ed alte concentrazioni. Si ha quindi una minore resa. 45 ISOLAMENTO DEL DNA PLASMIDICO Segue passaggi analoghi a quelli per l’isolamento del DNA cellulare totale in quanto possiedono le stesse caratteristiche. Avviene poi la separazione del DNA plasmidico da quello genomico sfruttando le loro differenze di tipo chimico-fisico quali: - diversa dimensione: plasmidico più piccolo - diversa conformazione: si trova spesso nella forma superavvolta a differenza di quello genomico Sfruttando la diversa dimensione Si procede con la rottura della parete cellulare con lisozima + EDTA. Viene però effettuata in maniera più mild e in presenza di saccarosio al 25% che agisce sulla situazione di tonicità della cellula affinché non si rompa. Si ottiene così uno sferoplasto dove la membrana è intatta e la parete cellulare è in parte rotta. Il DNA genomico è legato alla membrana mentre in soluzione si trovano i plasmidi. Si aggiunge il Triton, un detergente che causa la rottura della membrana plasmatica e si ottengono così pezzi di membrana e parate a cui sarà attaccato il DNA genomico. In questo modo si procede con una centrifugazione e in soluzione rimangono i plasmidi. ‼ Può avvenire comunque una rottura di pezzi di DNA genomico e può esserci quindi una contaminazione in soluzione. Sfruttando la diversa conformazione Il DNA genomico batterico è circolare. I plasmidi invece posso presentarsi in forma superavvolta, linearizzata se è presente un nick su entrambi i filamenti oppure in forma circolare aperte se il nick si trova su un solo filamento. 46 Si sfrutta il processo di denaturazione alcalina: Il DNA nella forma rilassata se sottoposto a un pH alcalino tra 12 e 12.5 si denatura e va a singolo filamento a differenza di quello superavvolto. Di conseguenza l’estratto viene trattato a pH 12 e il DNA lineare del genomico si denatura mentre il super avvolto rimane tale. Si acidifica portando a pH7 e il DNA a singolo filamento si aggroviglia e precipita. La massa aggrovigliata per centrifugazione finisce nel pellet e i plasmidi rimangono in soluzione. Presenta una maggiore efficienza rispetto al protocollo precedente. ISOLAMENTO DEL DNA FAGICO Le cellule batteriche infette da fagi rilasciano nella coltura extracellulare le particelle fagiche. Il DNA verrà quindi recuperato dal mezzo extracellulare. Mediante centrifugazione i batteri si sedimentano lasciando le particelle virali in soluzione. Si procede con la deproteinizzazione con proteasi per rimuovere il capside virale e si recupera il DNA con una cromatografia a scambio ionico. ⚠ La difficoltà è condurre un’infezione tale da avere un titolo di produzione di particelle virali estremamente elevato. Se faccio un’infezione troppo forte muoiono subito le cellule batteriche mentre se è troppo debole non ho un sufficiente quantitativo di particelle virali. 47  VALUTAZIONE DELLA QUALITÀ E QUANT ITÀ DEL DNA CORSA ELETTROFORETICA È possibile effettuare una valutazione della quantità e della qualità del DNA mediante CORSA ELETTROFORETICA. Infatti gli acidi nucleici sono carichi e possono essere separati in un campo elettrico in presenza di una matrice porosa in una cameretta con 2 elettrodi ed in presenza di un tampone (TAE 1X o TBE1 o 0,5X) con EDTA (per evitare degradazione). La velocità di migrazione dipende dalla dimensione e in parte anche dalla forma. Le matrici possono essere di diverso tipi: - AGAROSIO: polisaccaride che crea una matrice porosa con pori di dimensione variabile in base alla quantità presente. Consente di separare frammenti che differiscono di almeno 20/30 bp e non di pochi nucleotidi. È utilizzato per separare frammenti di dimensioni comprese tra 50bp fino a 25kbp andando a variare la concentrazione di agarosio → + agarosio per frammenti piccoli, - per frammenti grandi. La corsa viene effettuata a a voltaggio costante e 3 V/cm. ! Esistono versioni di agarosio modificate per lavorare con frammenti più grandi o per taglie più piccole. - ACRILAMMIDE: ha una maggiore risoluzione e consente la separazione frammenti molto simili tra di loro. La concentrazione minima utilizzata è il 3% ed è utilizzata per frammenti che hanno un massimo di 500bp. ‼ Risulta quindi importante effettuare una scelta corretta e adeguata in base a quello che vogliamo separare. Per la separazione di frammenti molto grandi di DNA si utilizza l’elettroforesi in campo pulsato. Gli elettrodi sono posti a 45 gradi e il campo elettrico varia continuamente. Questo consente a frammenti più grandi di passare attraverso le maglie della matrice più facilmente. Viene solitamente utilizzato ad esempio per i cromosomi di lievito. Per la separazione elettroforetica i campioni vengo caricati in pozzetti assieme a colorate, loading buffer e glicerolo che consente di aumentarne la densità. La corsa viene effettuata in presenza di coloranti: storicamente veniva utilizzato l’etidio bromuro che è però un mutageno. Oggi vengono utilizzate altre sostanze, intercalanti del DNA che danno un segnale visivo che può essere fluorescente in seguito ad eccitazione con UV oppure con luce blu. La visualizzazione avviene grazie a un transluminatore o gelDOC. SYBYR GREEN In alternativa possono essere utilizzati metodi radioattivi come il silver staining. Alla fine della corsa elettroforetica sul gel sarà possibile osservare le diverse bande di DNA: in alto troveremo sempre il DNA genomico mentre i prodotti di PCRT si troveranno nella parte bassa del gel. 48 È possibile STIMARE LA DIMENSIONE DEI FRAMMENTI utilizzando un marcatore di pesi molecolari che viene caricato e fatto correre insieme al nostro campione. Sono una collezione di frammenti di peso molecolare noto che consente di stimare il peso dei nostri frammenti in base alla loro migrazione. È possibile anche STIMARE LA CONCENTRAZIONE DEL DNA a livello occhiometrico in gel. Si procede mediante l’utilizzo di DNA genomico ad esempio di fago lambda a concentrazioni note e si produce una scala di diverse concentrazioni. Tale scala viene confrontata con il nostro campione → si osserva a quale intensità di banda in nostro campione assomiglia maggiormente o dove si colloca. Si ottiene anche un’informazione sulla QUALITÀ: se il DNA è integro osservo un’unica banda altrimenti uno smear ovvero una strisciata di diversi pesi molecolari. Dal gel è inoltre possibile recuperare un particolare frammento frammento di interesse → altro metodo per purificare il DNA. Per visualizzare il DNA esistono inoltre sistemi di microfluidica →si basa sulla presenza di chip con diversi pozzetti dove caricare i campioni e dei canali con una matrice dove i campioni corrono. Al di sotto del chip si trova un sistema di detezione che visualizza grazie a coloranti la corsa del DNA dando un’immagine digitale. 49 ANALISI SPETTROFOTOMETRICA Il DNA in soluzione acquosa ha un picco assorbanza a 260nm. Tale assonanza può essere utilizzata per dedurne la concentrazione. Affinché si ottengano risultati attendibili il DNA deve essere in soluzione con assorbanza compresa tra 0,1 ed 1 OD. La misurazione va effettuata allo spettrofotometro dopo averlo azzerato con il bianco e si utilizzano cuvette trasparenti a UV di quarzo. Per ottenere dall’assorbanza un valore di concentrazione si utilizza tale trasformazione → 1OD = 50ng/𝛃L. ‼ Questo vale per dsDNA mentre per ssDNA è pari a 40ng/𝛃L. In un campione di DNA si misurano altri valori di assorbanza: - a 280nm: assorbanza delle proteine. Rapporto OD260/OD280 deve essere compreso tra 1,8 e 2 - a 230nm: dovuta a contaminazione da guanidinio, fenolo o polisaccaridi 2 0/1 1.. - a 320nm dovrebbe esserci assorbanza molto bassa → controllo che tutto sia corretto NANODROP È uno spettrofotometro che consente di lavorare con volumi molto ridotti in modo da evitare uno spreco di campione. Viene caricata una goccia di DNA, solitamente 1,5-2𝛃L, si abbassa il braccio e si crea una colonna di liquido dove passa il raggio UV e avviene la misurazione dell’assorbanza. 50  MANIPOLAZIONE ENZIMAT ICA DEL DNA PURIFICATO È possibile manipolare il DNA utilizzando enzimi tipicamente purificati o prodotti in maniera ricombinante che sono disponibili in commercio. Sono enzimi che tipicamente troviamo all’interno della cellula e svolgono ruoli importante per le sue diverse funzioni. NUCLEASI Le nucleasi tagliano il DNA tipicamente nel legame fosfodiesterico. Possono essere classificate come: - esonucleasi: accorciano e degradano gli acidi nucleici a partire dalle estremità. Possono agire su una sola estremità (5’ o 3’) o su entrambe a seconda dell’enzima specifico usato - endonucleasi: rompono il legame fosfodiesterico tra nucleotidi posizionati internamente. Possono agire su filamento singolo o doppio o entrambi - endonucleasi di restrizione: il taglio del DNA avviene in corrispondenza di sequenze specifiche. Sono diverse tra di loro, possono riconoscere sequenze di 4-6 bp o anche più lunghe, possono tagliare più a monte o più a valle. Possono produrre estremità piatte oppure coesive. Vengono utilizzate per il clonaggio classico ! È possibile fare una stima di quante volte taglia l’enzima di restrizione andando a vedere quante volte ricorre il sito di restrizione nel genoma o nel frammento. Come si allestisce una reazione di restrizione→ DNA e poi si aggiunge il buffer tipico per ogni enzima di restrizione. Si aggiunge l’enzima di restrizione, si fa l’incubazione a 37℃ per un determinato numero di ore (in base a digestione analitica o preparativa): per un clonaggio durata di 3 ore affinché tutto sia digerito, se invece vogliamo solamente vedere se c’è un sito di restrizione è necessaria un’ora. Se vogliamo solo vedere la presenza di un sito si carica in gel senza purificare mentre se si deve fare un clonaggio è necessario fare una purificazione per togliere l’enzima di restrizione. Se si utilizzano più enzimi di restrizione contemporaneamente si devono controllare le specifiche dei buffer. LIGASI Le ligasi consento di unire molecole di acidi nucleici riparando la discontinuità tra nucleotidi dovute ad assenza di legame fosfodiesterico, sia su singola che su doppia elica. Può funzionare sia con estremità piatta che con estremità coesive. L’efficienza è maggiore per le estremità coesive. Viene usato l’enzima T4 DNA ligasi di E.coli. È possibile fare una PCR utilizzando primer a cui vengono aggiunti siti di restrizione, al 5’, nel momento in cui, dopo una amplificazione, il nostro obiettivo è quello di inserire il frammento all’intento di un vettore. POLIMERASI Le polimerasi sono enzimi che copiano gli acidi nucleici usando uno stampo. Necessitano di un innesco a doppio filamento per l’inizio della reazione ovvero di un primer. 51 DNA polimerasi I ha sia attività polimerasica che esonucleasica in direzione 5’-3’. Ovvero nel momento in cui ripara un nick il filamento integro presente accanto, anche se corretto e integro viene sostituito. Sostituisce anche i nucletidi che sono vicini al nick in quanto ha anche abilità esonucleasica. Porzione della DNA polimerasi di E. Coli che è stato ottenuto per mantenere solo l’attività polimerasica della pol 1 senza mantenere l’attività esonucleasica. Frammento di Klenow: deriva dalla DNA polimerasi I ma ha sola attività di sintesi. I nucleotidi esistenti non vengono quindi sostituiti. Taq DNA polimerasi I di Thermus aquaticus, un batterio che vive ad alte temperature. Viene usata per la PCR in quanto termostabile. Trascrittasi inversa: deriva dal virus e utilizza come stampo l’RNA per sintetizzare un cDNA. ENZIMI DI MODIFICAZIONE Sono enzimi che rimuovono o aggiungono gruppi chimici. Fosfatasi alcalina: rimuove il fosfato in 5’ dalle molecole di DNA. Polinucleotide kinasi (PNK): aggiunge il gruppo fosfato in posizione 5’ terminale. Viene usata per le ligazione che necessitano il fosfato. Questi due enzimi risultano utili per sostituire il fosfato presente con un fosfato radioattivo o marcato. 52  IBRIDAZIONE MOLECOLARE Il processo di ibridazione molecolare si basa sulla denaturazione e rinaturazione del DNA. Un amento della temperatura causa la denaturazione del DNA, ovvero da ds passa a ss. Questo processo è però reversibile: in seguito a raffreddamento può avvenire la rinaturazione. Il processo è strettamente dipendente dalla composizione del DNA → maggiore è il numero di GC maggiore è il calore necessario per la denaturazione. Data la sequenza è possibile stimare la temperatura di Melting ovvero la temperatura alla quale il 50% delle molecole di DNA sono denaturate. Processo Due filamenti di DNA a singolo filamento, abbassando la temperatura, tendono a ibridarsi. Inizialmente si ha la formazione di un ibrido instabile perché i legami idrogeno che tengono uniti i filamenti devono competere con le forze che tendono a staccare i due filamenti. Solo quando l’ibridazione è sufficientemente completare da avere un determinato numero di legami a idrogeno l’ibrido è stabile. Maggiore è la complementarietà tra le basi maggiore è la stabilità dell’ibrido. Di conseguenza il processo dipende sia dalla sequenza che dalla temperatura. L’ibridazione DNA/DNA consente di studiare l’organizzazione dei geni nel genoma, ad esempio mediante Southern blotting oppure consente di effettuare screening di librerie genomiche o di cDNA. Le diverse applicazioni dell’ibridazione molecolare: - Definire quanti membri di una famiglia genica si possono trovare in un genoma (Southern blotting) - Verificare in organismi transgenici quante copie di transgene sono state inserite (Southern blotting) - Arricchire in geni presenti solo in determinati tessuti - Isolare cloni genomici che portano il gene di interesse in librerie genomiche o di cDNA - Analisi microarray 53  Serve per identificare in che punto di un dna è presente un gene di interesse SOUTHERN BLOTTING Il Southern blotting rappresenta il primo protocollo che ha sfruttato l’ibridazione molecolare del DNA. Sfrutta l’utilizzo del DNA genomico trasferito su di una membrana che può poi essere testata con delle sonde1 per l’ibridazione. RADIOAMVE Il DNA genomico deve essere digerito e ne servono almeno 10𝛃g. La separazione viene effettuata in gel e successivamente il gel viene poi usato per il trasferimento su membrana. Per il trasferimento si ha la costruzione del castelletto. In una vaschetta si trova il tampone di trasferimento e un supporto di vetro. Si immerge della carta assorbente nel tampone, si posiziona sopra il gel poi la membrana di nitrocellulosa e al di sopra la carta assorbente che farà da driving force per il trasferimento. Il liquido risale per capillarità e dal passaggio dal gel alla membrana si porta dietro il DNA. Il tutto agisce overnight. ! In alcuni casi il DNA può essere trattato con HCl per indurre la depurinazione che facilita il trasferimento alla membrana e con una soluzione denaturante. Segue poi un trattamento con soluzione neutralizzante. Nadt Il giorni successivo si recupera la membrana e il DNA viene saldato con UV o cottura a 80℃. La membrana può essere ora ibridata con sonde marcate per i geni che si stanno studiando. L’ibridazione della sonda ai siti complementari sul genoma digerito della membrana è effettuata, dopo aver saturato la membrana, in tubo da ibridazione/vaschette e lasciata overnight alla temperatura di ibridazione. La membrana viene quindi lavata ed esposta per rilevare l’appaiamento della sonda → se la sonda è marcata ad esempio con radioattivo uso l’autoradiografia. 1. Dna viene digerito con enzimi di restrizione 2. Si effettua elettroforesi su gel per separare i vari frammenti di dimensioni diverse che si sono ottenuti. 3. si immerge il gel in una soluzione denaturante. Si può anche aggiungere HCl per indurre depurinazione che facilita trasferiemnto su membrana. Metti su piatto rotante. 4. Si neutralizza on soluzione neutralizzante 5. Si prepara il castelletto : vaschetta ricca di transfer buffer il wick (Blotting paper) viene appoggiata su un supporto che sta sopra la vascehtta con le estremità che sono immerse nle buffer. Si ricopre il wick con soluzione. pezzi di blotting paper sopra wicha anch’essi bagnati da buffer Sopra la blotting paper appena aggiunta si mette il gel ( ormai denaturato e neutralizzato) Sopra il gel si mette la membrana di nitrocellulosa o nylon il quale è stato già trattato con soluzioni che bloccano altri siti di legame sulla membrana per le sonde. sopra la nitrocell si mettono altri pezzi di carta blot + vetro + pesi che tangano fermo Lascio overnight.—>per azione capillarità e carica positiva membrana il dna si trasferisce da gel a membrana. 6. Tolgo la membrana 7.. fisso il dna in mmebrana. Tramite trattamento uv o cottura 80° 8. Metto la membrana in incubazione con soluzione contenente i probe radioattivi specifici per il mio gene di interesse. 9.. i probe raioattivi si legano e tramite autoradiazione posso vedere dove il mio gene è presente. MEMBRANE UTILIZZATE Nitrocellulosa - bassa capacità di legame (specie per frammenti piccoli) - legame del DNA idrofobico e non covalente - poco robusta (tende a sbriciolarsi) e quindi difficilmente riutilizzabile problemi di conservazione - basso background (bassa presenza di legami aspecifici) 54 Nylon - maggior capacità di legame - legame covalente del DNA - più robusta e riutilizzabile più volte - diverse tipologie: neutre o cariche positivamente (cariche hanno ancor maggior capacità di legame ma danno background aspecifico; richiedono specifici protocolli di trasferimento e blocking) CONDIZIONI DI IBRIDAZIONE ✷ Prima dell’ibridazione la membrana viene preibridata con la stessa soluzione di ibridazione e saturata per evitare legami aspecifici e background nelle stesse condizioni per l’ibridazione in tubi in rotazione in fornetti, bustine di plastica o vaschette. ✷L’ibridazione è condotta in tubi in rotazione in fornetti, bustine di plastica o vaschette a 65°C o 42°C a seconda della tipologia di buffer di ibridazione (NB: la presenza di formammide consente di abbassare la temperatura di ibridazione). ✷Dopo l’ibridazione le membrane vengono lavate con buffer che contengono concentrazioni decrescenti di sali per favorire solo il legame dell’ibridazione specifica. ✷Dopo la rilevazione autoradiografica la sonda ibridata può essere rimossa e la membrana eventualmente usata per altre ibridazioni. OLIGONUCLEOTIDI DA USARE COME SONDE Si sceglie il gene di interessa da studiare. Si amplificano e purificano oligo con temperatura di Melting almeno 10℃ superiore a quella dell’ibridazione. Maggiore è la lunghezza maggiore sarà la specificità. Posso utilizzare sonde eterologhe: voglio vedere geni condivisi in due organismi diversi. Posso inoltre creare sonde degenerate ovvero con nucleotidi che possono essere variabili tra di loro. Si ha ibridazione fino a un 70% di complementarietà ma poi dipende dalle condizioni. La sonda deve essere resa visibile ovvero marcarla incorporando un nucleotide tracciabile, per radioattività o non. Sono presenti diversi metodi di incorporazione. Dopo la marcatura è importante purificare la sonda per rimuovere i nucleotidi marcati non incorporati con l’utilizzo di una colonna cromatografica. METODI DI MARCATURA DELLE SONDE Marcatura terminale Marcatura della sonda in posizione terminale con l’uso della polinucleotide chinasi. Si verifica la sostituzione del gruppo OH con un fosfato marcato in posizione 5’ terminale. Produce bassi livelli di marcatura. 55