Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos
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Questions and Answers

¿Qué tipo de moléculas eluyen primero de una columna de intercambio aniónico cargada con un lisado celular?

  • ARN con carga negativa.
  • Proteínas con carga negativa.
  • ADN con carga positiva.
  • Proteínas con carga positiva. (correct)

¿Cuál es el propósito de usar tampones de concentración salina creciente en la cromatografía de intercambio iónico después de cargar el lisado?

  • Para separar el ADN del intercambiador. (correct)
  • Para modificar la carga de las proteínas.
  • Para precipitar las proteínas contaminantes.
  • Para degradar el ARN presente en la muestra.

En la cromatografía de adsorción con membranas de sílice, ¿qué función cumplen las sales caotrópicas?

  • Favorecer la adsorción de ácidos nucleicos a la membrana de sílice. (correct)
  • Desnaturalizar los ácidos nucleicos para facilitar su unión a la sílice.
  • Aumentar la afinidad de las proteínas por la membrana de sílice.
  • Prevenir la unión no específica de polisacáridos a la membrana.

¿Por qué se utiliza etanol en el lavado de los ácidos nucleicos unidos a la membrana de sílice?

<p>Para eliminar restos de sales caotrópicas y otros contaminantes. (B)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de incubar los ácidos nucleicos con agua desionizada o tampón TE después del lavado con etanol en la cromatografía de adsorción?

<p>Para permitir que los ácidos nucleicos recuperen su capa de hidratación y se separen de la columna de sílice. (A)</p> Signup and view all the answers

En la purificación de ácidos nucleicos mediante esferas magnéticas, ¿qué propiedad permite la unión selectiva de ARNm con cola poli-A a las esferas?

<p>La afinidad de la cola poli-A por los oligonucleótidos poli-T. (D)</p> Signup and view all the answers

¿Qué paso es crucial para separar los ácidos nucleicos de las esferas magnéticas después de la adsorción o unión por afinidad?

<p>Modificación del tampón para reducir la afinidad entre los ácidos nucleicos y las esferas. (C)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál de los siguientes NO es un componente típico utilizado en la purificación de ácidos nucleicos mediante cromatografía de adsorción con membranas de sílice?

<p>Oligonucleótidos poli-T. (D)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de añadir un tampón durante la purificación de ARNm con microesferas y oligo-T?

<p>Facilitar la hibridación entre los oligo-T y la cola poli-A del ARNm. (A)</p> Signup and view all the answers

Durante la purificación de ARNm usando microesferas magnéticas, ¿qué paso sigue inmediatamente después de aplicar el separador magnético?

<p>Lavado con etanol al 70% para eliminar contaminantes. (C)</p> Signup and view all the answers

¿Por qué se utiliza la incubación a 55°C en la purificación de ARNm con microesferas?

<p>Para separar el ARNm del oligo-T por desnaturalización térmica. (A)</p> Signup and view all the answers

En la purificación de ácidos nucleicos por ultrafiltración, ¿qué principio permite la separación de los contaminantes?

<p>Retención selectiva de los ácidos nucleicos según su tamaño a través de los poros de la membrana. (A)</p> Signup and view all the answers

¿Qué tamaño mínimo aproximado deben tener los productos de PCR para ser purificados eficientemente mediante ultrafiltración?

<p>Superior a 150 pb. (B)</p> Signup and view all the answers

En la purificación de plásmidos, ¿cuál es el principal reto que se debe superar?

<p>Separar el plásmido del ADN cromosómico bacteriano y el ARN. (B)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes técnicas se basa en las diferencias de desnaturalización y renaturalización del ADN para la purificación de plásmidos?

<p>Lisis alcalina. (D)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál de los siguientes NO es un componente que se elimina durante la ultrafiltración en la purificación de ácidos nucleicos?

<p>ADN Plasmídico (A)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes opciones describe mejor el propósito de la homogeneización en el pretratamiento de tejidos animales o vegetales frescos?

<p>Liberar las células que integran el tejido para facilitar la extracción de ácidos nucleicos. (A)</p> Signup and view all the answers

En el contexto del pretratamiento de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE), ¿cuál es el objetivo principal del proceso de desparafinización?

<p>Eliminar la parafina para permitir el acceso a los componentes celulares. (B)</p> Signup and view all the answers

Si tienes un cultivo celular en suspensión, ¿cuál es el orden correcto de los pasos iniciales para el pretratamiento antes de la extracción de ácidos nucleicos?

<p>Recolectar en un tubo, eliminar el medio de cultivo por centrifugación, lavar las células con tampón. (C)</p> Signup and view all the answers

¿Qué tipo de tratamiento se utiliza comúnmente para disgregar las células en la homogeneización química de tejidos?

<p>Proteasas y detergentes. (C)</p> Signup and view all the answers

En el pretratamiento de cultivos de bacterias y levaduras, ¿por qué es esencial resuspender el sedimento celular en tampón después de la centrifugación?

<p>Para estabilizar el pH y la osmolaridad durante la extracción posterior. (D)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál de los siguientes métodos de homogeneización es más adecuado para procesar una gran cantidad de muestras de tejido de manera rápida y eficiente?

<p>Homogeneización automatizada con molino. (C)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es la razón principal para lavar las células con tampón o suero fisiológico después de la centrifugación en el pretratamiento de cultivos celulares en suspensión?

<p>Para remover los restos del medio de cultivo que podrían interferir con la extracción de ácidos nucleicos. (B)</p> Signup and view all the answers

En el proceso de desparafinización de tejidos FFPE, ¿por qué se utilizan etanoles de concentración decreciente?

<p>Para facilitar la rehidratación gradual del tejido y evitar daños celulares. (B)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito principal de la lisis alcalina en la purificación de plásmidos?

<p>Desnaturalizar tanto el ADN plasmídico como el ADN cromosómico para su posterior separación. (D)</p> Signup and view all the answers

¿Qué rol cumple la neutralización rápida después de la lisis alcalina en la purificación de plásmidos?

<p>Permite la renaturalización selectiva del ADN plasmídico mientras precipita el ADN cromosómico. (B)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de usar ARNasa A en la purificación de ADN antes de la lisis celular?

<p>Degradar el ARN para obtener una muestra de ADN más pura. (B)</p> Signup and view all the answers

¿Qué compuestos se utilizan en la purificación con solventes orgánicos para separar los componentes celulares según su solubilidad?

<p>Fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. (D)</p> Signup and view all the answers

¿Por qué es crucial utilizar materiales y reactivos libres de ARNasas en la purificación de ARN?

<p>Porque las ARNasas pueden degradar el ARN, disminuyendo la cantidad y calidad del ARN purificado. (B)</p> Signup and view all the answers

Durante la purificación con solventes orgánicos, ¿en qué fase se encuentran los ácidos nucleicos después de la centrifugación inicial?

<p>En la fase acuosa superior. (D)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de tratar el agua destilada con dietilpirocarbonato (DEPC) en la purificación de ARN?

<p>Inactivar permanentemente las ARNasas, asegurando que el agua esté libre de estas enzimas. (B)</p> Signup and view all the answers

¿Por qué es necesario autoclavar el agua tratada con DEPC antes de utilizarla en experimentos de biología molecular?

<p>Para degradar el DEPC en componentes que no inhiban reacciones enzimáticas. (A)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es la función del etanol en la precipitación del ADN durante la purificación con solventes orgánicos?

<p>Eliminar la capa de hidratación alrededor del ADN. (B)</p> Signup and view all the answers

¿Qué papel juega el acetato de sodio en la precipitación del ADN?

<p>Neutraliza la carga negativa del ADN. (C)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes NO es una ventaja de la automatización en la extracción y purificación de ácidos nucleicos?

<p>Mayor rendimiento en la obtención de ácidos nucleicos. (C)</p> Signup and view all the answers

Durante la fase de lavado del ADN precipitado, ¿por qué se utiliza etanol al 70-95%?

<p>Para eliminar las sales y otros contaminantes solubles en etanol, mientras el ADN permanece insoluble. (B)</p> Signup and view all the answers

Si una muestra de ADN genómico se somete a electroforesis en gel de agarosa y se observa una banda borrosa en lugar de una banda definida de alto peso molecular, ¿qué indica este resultado?

<p>El ADN está degradado o fragmentado. (B)</p> Signup and view all the answers

¿Qué tipo de instrumento automático para la purificación de ácidos nucleicos utiliza la afinidad de estos por una matriz sólida en condiciones específicas?

<p>Instrumentos basados en cromatografía de adsorción. (B)</p> Signup and view all the answers

Después de la precipitación y el lavado, ¿cuál es el siguiente paso en la purificación de ADN con solventes orgánicos?

<p>Resuspensión del ADN en un buffer adecuado. (D)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes opciones describe mejor cómo el cloroformo contribuye a la purificación de ácidos nucleicos con solventes orgánicos?

<p>Desnaturaliza y disuelve las proteínas. (A)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito principal de lavar el pellet de ADN con etanol al 70-95% después de la precipitación con isopropanol?

<p>Eliminar las sales y otros contaminantes que pueden interferir con reacciones posteriores. (A)</p> Signup and view all the answers

En la purificación de ácidos nucleicos mediante precipitación con sales (salting-out), ¿qué sucede con las proteínas después de añadir una solución salina concentrada?

<p>Las proteínas precipitan, separándose de los ácidos nucleicos que quedan en el sobrenadante. (D)</p> Signup and view all the answers

¿Por qué es importante eliminar los restos de etanol del pellet de ADN después del lavado?

<p>El etanol puede interferir en técnicas posteriores de biología molecular. (B)</p> Signup and view all the answers

En la cromatografía de intercambio iónico, ¿qué tipo de grupos funcionales se utilizan en la fase estacionaria para unirse a los ácidos nucleicos?

<p>Grupos funcionales cargados positivamente. (A)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál de los siguientes elementos NO se espera encontrar en el lisado celular que se aplica a una columna de cromatografía de intercambio iónico?

<p>ADN polimerasa activa durante la PCR (B)</p> Signup and view all the answers

Durante la precipitación con sales (salting-out), ¿qué concentración alcohólica de isopropanol es óptima para precipitar el ADN del sobrenadante?

<p>Se requiere un volumen igual de isopropanol al volumen del sobrenadante. (D)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál de los siguientes tampones es más adecuado para resuspender el ADN después de la purificación y por qué?

<p>Agua destilada o tampón TE (Tris-EDTA), ya que proporcionan baja fuerza iónica y protegen el ADN. (C)</p> Signup and view all the answers

En la cromatografía de intercambio iónico, ¿cómo se eluyen los ácidos nucleicos que están unidos a la columna de intercambio aniónico?

<p>Aumentando la concentración de sal en el tampón de elución. (D)</p> Signup and view all the answers

Flashcards

Cultivos celulares

Métodos para obtener células in vitro en medios adecuados.

Cultivos en suspensión

Células que crecen en un medio de cultivo en suspensión.

Centrifugación

Técnica para separar células del medio de cultivo.

Homogeneización

Proceso para liberar células de tejidos mediante tratamiento mecánico o químico.

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Homogeneización mecánica

Tratamiento que desmenuza el tejido usando acción trituradora.

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Homogeneización química

Uso de proteasas y detergentes para descomponer fibras celulares.

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Desparafinización

Eliminación de parafina en tejidos FFPE para extracción.

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Cultivos de bacterias y levaduras

Requieren centrifugación para separar el sedimento del medio.

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Eliminación de ARN

Proceso de eliminar ARN para obtener ADN puro antes de la purificación.

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ARNasas A

Enzimas que degradan ARN para facilitar la obtención de ADN.

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Purificación de Ácidos Nucleicos

Proceso que separa los ácidos nucleicos de otros componentes celulares.

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Técnicas de purificación

Métodos para separar ácidos nucleicos basados en características fisicoquímicas.

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Purificación con solventes orgánicos

Método que utiliza solventes para eliminar compuestos solubles y precipitar ADN.

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Fase acuosa

Parte superior tras centrifugación que contiene ADN, ARN y sales tras purificación.

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Precipitación del ADN

Proceso en que se añade acetato sódico y etanol para coagular ADN.

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Lavado del ADN

Fase donde el pellet de ADN se limpia con etanol para eliminar contaminantes.

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Efecto del etanol en biología molecular

El etanol interfiere en técnicas de biología molecular y debe ser eliminado.

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Resuspensión del ADN

El ADN se resuspende en agua destilada o tampón de baja fuerza iónica.

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Precipitación de proteínas

Método donde se añade solución salina que precipita proteínas dejando ácidos nucleicos en el sobrenadante.

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Cromatografía de intercambio iónico

Método que utiliza uniones electrostáticas reversibles para separar ácidos nucleicos de otros componentes.

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Intercambiador aniónico

Dispositivo que une grupos funcionales cargados positivamente para atrapar ácidos nucleicos cargados negativamente.

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Microesferas en el lisado

Se añaden microesferas y un tampón para hibridación del ARNm.

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Separador magnético

Permite eliminar los componentes del lisado al mantener el ARN unido a las esferas.

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Lavado con Etanol 70%

Proceso de limpieza para eliminar contaminantes del ARN después de la hibridación.

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Ultrafiltración

Método que basa en la retención por tamaño de ácidos nucleicos usando membranas.

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Purificación de plásmidos

Método para separar plásmidos del ADN cromosómico bacteriano y ARN.

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Lisis Alcalina

Método basado en diferencias de desnaturalización del ADN para purificar plásmidos.

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Gradiente de CsCl

Técnica para separar plásmidos del ADN cromosómico usando coeficientes de densidad.

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Intercambio iónico

Método de purificación donde moléculas con carga negativa son retenidas por grupos funcionales positivos en una columna.

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Eluir

Extraer una sustancia de un medio sólido mediante un líquido apropiado.

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Cargas de proteínas y ADN

Las proteínas tienen carga positiva y se eluyen, mientras que el ADN es retenido por cargas negativas.

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Sales caotrópicas

Sustancias que desorganizan la red tridimensional del agua, afectando interacciones moleculares.

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Cromatografía de adsorción

Técnica que utiliza vidrio y sílice para retener ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas.

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Purificación por esferas magnéticas

Método que se basa en la unión de ácidos nucleicos a microesferas magnéticas mediante un imán.

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Oligonucleótidos poli-T

Cadenas cortas de ADN que se utilizan para atraer ARNm con cola poli-A durante la purificación.

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Neutralización rápida

Proceso que reduce bruscamente el pH para precipitar el ADN cromosómico.

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Purificación de ADN plasmídico

Método para aislar ADN plasmídico de otros contaminantes.

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Contaminación por ARNasas

Presencia no deseada de enzimas que degradan ARN.

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DEPC

Sustancia que inactiva ARNasas al modificarlas irreversiblemente.

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Electroforesis en gel

Técnica para evaluar la integridad y tamaño del ADN.

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Automatización de extracción

Uso de tecnología para realizar extracción de ácidos nucleicos de forma eficiente.

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Instrumentos modulares

Equipos que pueden combinarse para mejorar la purificación de ácidos nucleicos.

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Study Notes

Unidad Didáctica 5: Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

  • La extracción y purificación de ácidos nucleicos (AN) es un proceso en dos etapas principales
  • La primera etapa es la extracción y purificación
  • La segunda etapa es el pretratamiento de las muestras biológicas

1. Extracción y Purificación: La Primera Etapa

  • La extracción es una técnica que facilita el acceso a los ácidos nucleicos usando reactivos y enzimas.
  • La purificación elimina elementos e impurezas que interfieren en la extracción.
  • El proceso tiene tres fases principales:
    • Pretratamiento de la muestra
    • Extracción de los ácidos nucleicos
    • Purificación de los ácidos nucleicos

2. Pretratamiento de las Muestras Biológicas

  • El pretratamiento prepara las muestras biológicas para la extracción de ácidos nucleicos.
  • Las muestras biológicas más comunes son:
    • Sangre
    • Cultivos celulares
    • Tejidos animales o vegetales frescos
    • Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina
    • Esputos
    • Células de la mucosa oral
    • Bacterias
    • Levaduras

2.1 Pretratamiento en Sangre

  • La sangre se usa para extraer AN a partir de los leucocitos.
  • La sangre debe ser anticoagulada (ej. EDTA)
  • Los hematíes se lisan para eliminar la hemoglobina, un inhibidor de la PCR
  • La muestra se centrifuga para separar los leucocitos del sobrenadante.
  • Los leucocitos se conservan a 4°C.

2.2 Pretratamiento de Cultivos Celulares

  • Las células se recolectan en un tubo.
  • El medio de cultivo se elimina por centrifugación.
  • Las células se lavan con tampón o suero fisiológico.
  • El tratamiento difiere con células en cultivo en suspensión o monocapa.
  • Las células en monocapa se desprenden de su adherencia a la pared mediante lavado y luego se recolectan en un tubo.

2.3 Pretratamiento de Tejidos Animales o Vegetales Frescos

  • La homogeneización es un proceso mecánico o químico para liberar las células.
  • La homogeneización mecánica se logra mediante trituración (manual o automatizada)
  • La homogeneización química utiliza proteasas y detergentes para disgregar las células.

2.4 Pretratamiento de Tejidos Fijados en Formaldehído e Incluidos en Parafina (FFPE)

  • La desparafinización es el proceso para eliminar la parafina.
  • El material se trata con xilol, etanol y agua desionizada para su homogenización.
  • El material es tratado con proteasas y detergentes en incubadora.

2.5 Pretratamiento de Cultivos de Bacterias y Levaduras

  • Las colonias aisladas de un medio sólido (agar) se resuspendan en tampón
  • Para cultivos en medio líquido se centrifuga para eliminar el medio de cultivo y luego se resuspende en tampón

2.6 Pretratamiento de Células de la Mucosa Oral

  • Las células se recogen mediante torunda
  • Se sumergen en solución conservante para desprender las células.
  • Se centrifuga y se elimina el sobrenadante.

3. Extracción de Ácidos Nucleicos

  • La lisis celular libera los ácidos nucleicos de las células.
  • La inactivación de nucleasas (ej. ADNasas y ARNasas) evita la degradación de los ácidos nucleicos.
  • Las variaciones del tratamiento (en células con pared celular) se adaptan para vencer la dificultad de lisis.

3.1 Solución de Lisis

  • Los detergentes (ej. SDS) desestructuran la bicapa lipídica
  • Las proteasas (ej. Proteinasa K) rompen enlaces peptídicos de las proteínas
  • Los agentes caotrópicos (ej. guanidinio) inactivan ARNasas

3.2 Tratamientos en Células con Pared Celular

  • Los tratamientos enzimáticos (ej. lisozimas, liticasas) digieren componentes de la pared celular.
  • Los tratamientos mecánicos (ej. Ebullición, mortero, molino de bolas) desmenuzan el tejido.
  • Los tratamientos con CTAB eliminan polisacáridos y derivados polifenólicos.

4. Purificación de los Ácidos Nucleicos

  • La purificación separa los ácidos nucleicos de los demás componentes del lisado.
  • Las técnicas de purificación se basan en las propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos
    • Solventes orgánicos
    • Precipitación con sales
    • Cromatografía (intercambio iónico, adsorción)
    • Esferas magnéticas
    • Ultrafiltración
    • Purificación de plásmidos
    • Purificación de ARN

4.1 Purificación con Solventes Orgánicos

  • La precipitación del ADN se basa en la solubilidad de los compuestos
  • Se añaden volumenes iguales de lisado y reactivos (fenol, cloroformo y alcohol isoamílico)
  • Se utilizan centrifugas para separar el ADN del sobrenadante
  • El ADN queda en la fase acuosa.
  • El sobrenadante contiene proteínas y lípidos.

4.2 Purificación con Sales (Salting-out)

  • Se añade un volumen igual de solución salina concentrada.
  • El sobrenadante contiene los ácidos nucleicos, sales y compuestos hidrosolubles.
  • Los ácidos nucleicos se precipitan con isopropanol.
  • Se lava el ADN con etanol 70-95% y se redisuelve en agua o tampón TE.

4.3 Purificación mediante Esferas Magnéticas

  • El ADN o ARN se unen a esferas magnéticas y se separan con un imán.
  • Luego se realiza un lavado con etanol
  • Se resuspende con H2O o tampón TE.

4.4 Purificación por Ultrafiltración

  • Se carga la muestra en la membrana de ultrafiltración.
  • Se elimina el material contaminante en el sobrenadante.
  • Se lava con etanol y se resuspende en agua o en un tampón TE.

4.5 Purificación de Plásmidos

  • Se usa gradientes de CsCl para separar el ADN plasmídico del cromosómico.
  • La lisis alcalina es una técnica para separar plásmidos de ADN cromosómico.

5. Automatización del Proceso de Extracción/Purificación

  • La automatización de los procesos garantiza ácidos nucleicos altamente purificados.
  • Minimiza la contaminación cruzada y aporta rapidez.
  • Usa instrumentos automatizados basados en partículas magnéticas o cromatografía de adsorción.

6. Calidad de los Ácidos Nucleicos Purificados

  • La integridad se valora con electroforesis en gel de agarosa.
  • El ADN genómico debería tener una sola banda, mientras que el ADN plasmídico una sola banda bien definida.
  • La pureza se mide por cocientes de absorbancia a diferentes longitudes de onda (ej. A260/A280, A260/A230).

7. Almacenamiento de los Ácidos Nucleicos Purificados

  • Los tubos o criotubos deben ser herméticos y libres de nucleasas.
  • El almacenamiento debe ser en temperaturas de refrigeración adecuada según el tiempo de conservación (ej. -80°C para periodos largos, 20-4°C para corto plazo).
  • Debe haber sistemas de seguridad para los congeladores.
  • La trazabilidad de las muestras es esencial.

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Tema 5 Extracción Y Purificación De Ácidos Nucleicos PDF

Description

Este texto explica el proceso de extracción y purificación de ácidos nucleicos, un procedimiento crucial en biología molecular. Describe las dos etapas principales: la extracción, que facilita el acceso a los ácidos nucleicos, y la purificación, que elimina impurezas. También detalla el pretratamiento de muestras biológicas comunes como sangre y tejidos.

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