Tema 5 Extracción Y Purificación De Ácidos Nucleicos PDF

UNIDAD DIDÁCTICA 5  EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 1. Extracción y purificación: la primera etapa. 2. Pretratamiento de las muestras biológicas. 3. Extracción de ácidos nucleícos. 4. Purificación de los ácidos nucleícos. 5. Automatización del proceso de extracción/purificación. 6....

UNIDAD DIDÁCTICA 5  EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 1. Extracción y purificación: la primera etapa. 2. Pretratamiento de las muestras biológicas. 3. Extracción de ácidos nucleícos. 4. Purificación de los ácidos nucleícos. 5. Automatización del proceso de extracción/purificación. 6. Calidad de los ácidos nucleícos purificados. 7. Almacenamiento de los ácidos nucleícos purificados. 1. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN: LA PRIMERA ETAPA Estructura célula procariota y eucariota. Membrana plasmática nucle ar Pared Celular 1 EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN: LA PRIMERA ETAPA EXTRACCIÓN: técnica que facilita el acceso a los ácidos nucleicos mediante la utilización de reactivos y enzimas. PURIFICACIÓN: eliminación de las sustancias y elementos que pueden interferir en ellas. PARA OBTENER ÁCIDOS NUCLEICOS PURIFICADOS se lleva a cabo un Único protocolo técnico continuado que se divide en tres fases: I.- Pretratamiento de la muestra. II.- Extracción de los ácidos nucleicos. III.- Purificación de los ácidos nucleicos. 4 2 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS Los AN se pueden obtener de cualquier muestra biológica pero dada la diversidad, sangre, tejidos, biopsias, etc., se requiere un pretratamiento específico de la muestra concreta que permita obtener las SUSPENSIONES CELULARES formadas por células libres y agregados celulares que flotan dispersos en el seno de un medio líquido. Pretratamiento de las muestras más habituales con que se trabaja en Biología Molecular son: ⮚ Sangre. ⮚ Cultivos celulares. ⮚ Tejidos animales o vegetales frescos. ⮚ Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. ⮚ Otras muestras como esputos, células de la mucosa oral, bacterias y levaduras.  2.1 Pretratamiento en Sangre La sangre es una de las muestras biológicas más habituales para estudiar los AN, purificándolos a partir de los leucocitos, (ya que el grupo hemo de los hematíes es un potente Inhibidor de la PCR, por ello eliminamos la hemoglobina por medio de la lisis de los hematíes.) Los hematíes son células sin núcleo, su función ppal. es transporte de los gases :Tampón de lisis 1:3 (1 de sangre, 3 de tampón de lisis) Este pretratamiento tb se utiliza para muestras de médula ósea. EDTA: ácido etilenodiaminatetraacético: es el mejor anticoagulante de las células sanguíneas. También se usa para evitar que las bacterias formen biopelículas (capa delgada que se adhiere a la superficie). Es un tipo de quelante (secuestra metales pesados) 2 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS LOS CULTIVOS CELULARES son métodos de obtención de células in vitro mediante siembras controladas en medios adecuados. El pretratamiento de estas muestras consiste en la recolección de las células antes de seguir con la extracción de los ácidos nucleícos. SE DAN DOS SITUACIONES: ▪ Cultivos en suspensión: las células crecen en suspensión en un medio de cultivo. 1.Recolectar en un tubo. 2.Eliminar el medio de cultivo mediante centrifugación. 3.Lavar las células con tampón o suero fisiológico antes de la extracción. ▪ Cultivos en monocapa: las células crecen adheridas a la pared del frasco. – Utilizar el propio frasco para continuar la extracción. – 1. Retirar el medio de cultivo – 2. Lavar con tampón. – 3. Iniciar la extracción in situ. – Pasar la monocapa a un tubo. – 1. Despegar las células de la pared del frasco. – 2. Recolectar en un tubo y 3. lavar las células antes de la extracción. 2 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS TEJIDOS ANIMALES O VEGETALES FRESCOS: la obtención de ácidos nucleicos a partir de tejidos frescos animales o vegetales requiere un pretratamiento previo de homogeneización. HOMOGENEIZACIÓN es el tratamiento mecánico o químico al que se somete un tejido para liberar las células que lo integran. ▪ Homogeneización mecánica: consiste en someter al tejido a una acción trituradora para desmenuzarlo. o Puede ser automatizada, molino https://www.youtube.com/watch?v=n4xTmaGQYJg o o manual con mortero: ▪ Homogeneización Química: Mediante proteasas y detergentes que degradan los componentes tisulares, disgregando las células. ▪ 1. Se añade a la muestra una mezcla de proteasas y detergentes para la digestión del tejido. ▪ 2. Se incuba en estufa a 37-56ºC durante 12-24 horas. ▪ 3. Se retira la muestra y se sigue con la extracción. 2. PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS TEJIDOS FIJADOS EN FORMOL E INCLUIDOS EN PARAFINA FFPE (formaline fixed paraffin embedded). Desparafinización: consiste en la eliminación de la parafina en los tejidos FFPE. ⮚ Se transfieren 5-10 mg de cortes a tubos eppendorf. ⮚ Se incuba secuencialmente con xilol, etanoles de concentración decreciente y agua destilada ⮚ Homogenización química con proteasas y detergentes en incubadora. Otras muestras: CULTIVOS DE BACTERIAS Y LEVADURAS: Se centrifuga para eliminar el medio de cultivo. ⮚ Cultivos en medio líquido. El sedimento se resuspende en tampón. Solucion tampón GTE GLUCOSA TRIS EDTA 9 2 PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS Cultivos de bacterias y levaduras, COLONIAS AISLADAS Se recoge con un asa de siembra Una colonia aislada de una placa de petri con medio sólido (agar). Posteriormente se resuspende en una solución tampón CELÚLAS DE LA MUCOSA ORAL Se recoge mediante torunda y se sumerge en una solución conservante para que las células se desprendan. Centrifugamos la suspensión celular y se elimina el Sobrenadante. 3. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Una vez realizado el pretratamiento de la muestra de partida obtenemos la SUSPENSIÓN CELULAR, procariota o eucariota ( animal o vegetal ) a partir de la cual procedemos a extraer los ácidos nucleicos. El proceso de EXTRACCIÓN implica: - LISIS DE LA CÉLULA para liberar los ácidos nucleicos - INACTIVACIÓN DE NUCLEASAS CELULARES (ADNasas y ARNasas). ⮚Ambos procesos, lisis celular e inactivación de las nucleasas, se consiguen mediante la incubación de la suspensión celular con una solución de lisis. ⮚En células con pared celular – bacterias, levaduras, hongos y células vegetales – será necesario aplicar algunas variaciones del tratamiento para vencer la dificultad de lisis que presentan. En el proceso de EXTRACCIÓN obtenemos un lisado celular en el que los ácidos nucleicos se encuentran libres de las estructuras celulares en las que se mantenían aislados. https://www.youtube.com/watch?v=a8d8ZNSX880 https://www.youtube.com/watch?v=nXeB1Ib13P8 11 3. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: SOLUCIÓN DE LISIS ⮚DETERGENTES: componente principal de ⮚EDTA (ácido etilen-diamino-tetraacético). la solución de lisis. Quelante o secuestrante de cationes SDS: dodecil-sulfato-sódico divalentes (Ca+2Mg+2) Su función es desestructurar la bicapa lipídica Al atrapar los cationes de magnesio, de las membranas y desnaturalizar las proteínas inhibe la actividad de las ADNasas. que se insertan en ella. ⮚PROTEASAS (Ej. Proteinasa K) enzimas* que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas, tanto de la membranas celulares. como las citoplasmáticas, facilitando la rotura de las membranas y eliminando las nucleasas. *Enzimas https://www.youtube.com/watch?v=WOAcp15VLJ0 ⮚AGENTES CAOTRÓPICOS Isotiacianato de guanidinio, potente inactivador de ARNasas) Sustancia que desorganiza la red tridimensional del H2O y la interacción de esta con otros solutos como, proteínas, ADN o ARN, tendiendo a desnaturalizarlas o disolverlas. Bicapa lipídica de una membrana celular 3. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. 3.2 Tratamientos en células con pared celular La presencia de pared celular en bacterias, levaduras, hongos y células vegetales dificulta la lisis celular. Para degradar esta pared se hacen necesarios otros tratamientos como los enzimáticos, mecánicos o CTAB (bromuro de cetil- trimetil-amonio). Tratamiento enzimático: Tratamiento mecánico: Tratamiento con CTAB: para digerir los componentes por acción mecánica de: Detergente iónico que facilita de la pared se usan enzimas Ebullición H2O d/tampón La eliminación de polisacaridos específicas. Mortero Y derivados polifenólicos ⮚Lisozimas: bacterias Gram + Congelación/descongelac (presentes en la pared celular) ⮚Liticasas: cs. Vegetales, Molino de bolas. Frecuente utilizarlo en vez de levaduras y hongos. Ultrasonido SDS para facilitar la eliminación Antes o simultaneamente con Homogenización de estos compuestos en la Purificación. la solución de Lisis. etc RESULTADO: LISADO CELULAR: POLISACARIDOS +LÍPIDOS+PROTEÍNAS+SALES MINERALES+ COMP.CEL.SOLUBLES+REACTIVOS DE LA EXTRACCIÓN+ ARN+ADN 3. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. 3.1 LA SOLUCIÓN DE LISIS ⮚ La solución de lisis: La composición de la solución de lisis depende del tipo de célula ⮚ Detergentes. (SDS, dodecil sulfato sódico) A por la membrana plasmática. ⮚ Proteasas. (digieren proteínas) ⮚ EDTA acido etilendiaminotetraacético secuestra el Mg e inhibe a las ADNasas ⮚ CÉLULAS CON PARED CELULAR: Además necesitan otros Tratamientos ⮚ Tratamiento enzimático. ⮚ Tratamiento mecánico. ⮚ Tratamiento con CTAB.(bromuro de cetil-trimetil-amonio) detergente. Verificación del resultado de la lisis. Se deberá añadir más solución de lisis y reincubar incluso a temperaturas elevadas (37-65ºC) Consideraciones en la extracción del ADN. Si solo quiero ADN tengo que eliminar el ARN, (saliva, tejidos y raspados celulares) antes de iniciar la purificación. Para ello incubar con ARNasas A e incubar a 37ºC drte. 15-45 min. 4. PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. Una vez finalizada la lisis, los Ácidos Nucleícos se encuentran inmersos en un extracto Celular con proteínas, sales minerales, componentes celulares solubles y los propios reactivos empleados en la extracción. PURIFICACIÓN: consiste en separar los ácidos nucleícos de los demás componentes del lisado. TECNICAS DE PURIFICACIÓN que se basan en características fisicoquímicas de los Ac. Nucleícos. ⮚Purificación con solventes orgánicos. ⮚Precipitación con sales. ⮚Cromatografía de intercambio iónico. ⮚Cromatografía de adsorción. ⮚Purificación mediante esferas magnéticas. ⮚Ultrafiltración. ⮚Purificación de plásmidos. ⮚Purificación de ARN. 15 Soluble en agua 4. PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. 4.1 Purificación con solventes orgánicos. Fundamentación. Se basa en la distinta solubilidad de los compuestos que integran el lisado celular en solventes orgánicos. Procedimiento: I. Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos. II. Precipitación del ADN. III. Lavado del ADN. IV. Resuspensión del ADN. FASE I: Se mezclan volúmenes iguales de lisado y reactivos.(Fenol ,cloroformo y Alcohol isoamílico)25:24:1). CLOROFORMO disuelve LÍPIDOS FENOL disuelve PROTEÍNAS Vortex Centrifugación: Fase acuosa (parte superior) ácidos nucleícos ADN +ARN +sales,+contam.hidrosolubles Fase orgánica (inferior) proteínas y lípidos. 4. PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. 4.1 Purificación con solventes orgánicos. Fundamentación. Se basa en la distinta solubilidad de los compuestos que integran el lisado celular en solventes orgánicos. Procedimiento: I. Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos. II. Precipitación del ADN. III. Lavado del ADN. IV. Resuspensión del ADN. FASE II: fase acuosa a un tubo limpio donde se precipita el ADN con acetato sódico y etanol al 100%. El ETANOL (deshidratante) elimina la capa hidratante que rodea al ADN. cationes Na (del acetato sodico) neutralizan carga negativa del ADN, se pierde la capa hidratante, y el adn no se repele formando maraña hebras blanquecinas ADN CENTRIFUGACIÓN 1. Sobrenadante contaminantes hidrosolubles 2. ADN precipitado 4. PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. FASE III: LAVADO DEL ADN El pellet de ADN se lava con etanol 70-95%, Las sales y posibles contaminantes son solubles en etanol EL ADN ES INSOLUBLE EN ETANOL. CENTRIFUGACIÓN. sobrenadante donde están las sales y otros(se elimina) ADN sigue en el pellet FASE IV: el ETANOL interfiere en todas las técnicas de biología molecular por lo que hay que eliminarlo. los restos de las paredes se eliminan invirtiendo el tubo. El pellet de ADN se deja secar a temp. ambiente con el tubo abierto. Se resuspende en agua destilada/tampón de baja fuerza iónica/tampón TE (Tris-EDTA). 4. PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. 4.1 Purificación con solventes orgánicos 20 4. PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. Precipitación con sales (salting-out) Fundamentación: se basa en la precipitación de proteínas en presencia de altas concentraciones salinas Procedimiento: I. Precipitación de proteínas. Se añade un volumen igual de solución salina concentrada que precipita las proteinas, en el sobrenadante quedan los ácidos nucleicos, sales y compts hidrosolubles. II. Precipitación del ADN. El sobrenadante se transfiere a un tubo limpio y se añade un volumen igual de isopropanol. El ADN precipita en forma de maraña de hebras blanquecinas. III. Lavado y resuspensión del ADN. Se elimina el sobrenadante y el ADN se lava co Etanol 70-95% y se resuspende en agua destilada o tampon TE. 21 4. PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. Precipitación con sales (salting-out) 22 4. PURIFICACIÓN: Cromatografía de intercambio iónico Fundamentación: se basa en la unión electroestática reversible de iones en solución(lisado) a grupos funcionales cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria (matriz o columna de cromatografía). LISADO CELULAR(resultado de la extracción) FASE ESTACIONARIA: ADN Columna Cromatográfica: ARN matriz de sílice o celulosa proteínas empaquetada en Sales minerales polipropileno Componentes celulares solubles Reactivos de la extracción. IMPORTANTE: VER FIG. 3,14 DEL LIBRO INTERCAMBIADOR ANIONICO grupos funcionales cargados positivamente: MAE Y DEAE unido covalentemente a la columna, se le unen los ác. nucleicos (carga negativa) 23 4. PURIFICACIÓN: Cromatografía de intercambio iónico https://www.youtube.com/watch ?v=ZAWUX-8wPsA 4. PURIFICACIÓN:Cromatrografía de intercambio iónico 1. La columna se carga con el lisado, las moléculas con carga negativa son retenidas en la columna,(donde están los grupos funcionales del intercambiador con carga positiva). 2. Mientras las proteínas, con carga positiva eluyen* de la misma. 3. La columna se lava con tampones de concentración salina creciente. 4. El ADN se separa del intercambiador y eluye*. * Eluir: extraer una sustancia del medio sólido que la ha absorbido mediante un líquido apropiado. Con carga + : Proteínas ADN Contaminantes Polisacáridos carga Negativa Metabolitos débil (ARN) 25  4. PURIFICACIÓN. Cromatografía de adsorción Fundamento: se basa en la capacidad de adsorción de los ácidos nucleicos al vidrio y a la sílice en presencia de sales caotrópicas* Procedimiento: 1. La columna se carga con lisado diluido en un tampón + ag. Caotrópico. Se CENTRIFUGA: los Ac. nucleicos se quedan unidos a la membrana de sílice de la columna y las proteínas se eliminan. 2. Los Ac nucleicos se lavan con Etanol para eliminar restos de contaminantes se centrifuga. 3. Se añade H2Od /tampón TE los ac. nucleicos recuperan su capa hidratante y se separan de la columna de sílice. INCUBACIÓN 3-5 min, CENTRIFUGACIÓN y recogemos AC nucleicos purificados en eppendorf. Membrana vidrio(SiO4) / + tampón con perlas de sílice Ag. caotrópico Proteínas + Contaminantes Ac. nucleicos contaminantes + etanol *Sales caotrópicas: sustancia que desorganiza la red tridimensional del H2O y la interacción de estas con otros solutos como proteínas, ADN,ARN tendiendo a desnaturalizarlas o disolverlas. 26 4. PURIFICACIÓN. mediante esferas magnéticas Fundamentación: se basa en la unión de los ac. Nucleicos (por adsorción o afinidad) a microesferas magnéticas retenidas mediante un imán. Adsorción de ácidos nucleicos a esferas magnéticas. Por afinidad de ácidos nucleicos con polímeros (oligonucleótidos) 27 4. PURIFICACIÓN mediante esferas magnéticas Ejemplo: Las esferas se recubren con oligonucleótidos poli-T para purificar ARNm con cola poli-A. 1. Se añaden las microesferas al lisado junto con un tampón que facilita la hibridación entre los oligo-T con la cola poli-A del ARNm. 2. Se aplica el separador magnético para poder eliminar el resto de componentes del lisado, mientras que el ARN está unido a las esferas. 3. Lavado con ETANOL 70% y se elimina el resto de contaminantes por pipeteo. 4. Resuspensión con H2O destilada o tampón TE y se incuba (55ºC) para que se produzca la separación del ARN del oligo-T por desnaturalización térmica. 5. Se trasfiere el ARN a un tubo limpio. https://www.thermofisher.com/es/es/home/brands/product-brand/dynal/dynabeads-types-and-uses.reg.vn.html 28  4. PURIFICACIÓN Ac. Nucleicos: ULTRAFILTRACIÓN Fundamentación: se basa en la retención por tamaño de las moléculas de ácidos nucleicos mediante membranas con un tamaño de poro determinado. Usado para purificar productos de PCR con un tamaño superior a 150 pb. 1.La muestra se carga directamente sobre la membrana de ultrafiltración y mediante vacío o centrifugación, se eliminan todos los contaminantes mientras que la muestra con los ácidos nucleicos permanecen retenidos en la superficie de la membrana. 2. El filtro se lava con Etanol 70% para eliminar restos de contaminantes. 3. Resuspensión con H2O destilada o tampón TE y se incuba a temp. amb. y se transfiere a un tubo limpio mediante pipeteo. Primers Nucleótidos Sales 29 4. PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS El problema que se plantea en la purificación de plásmidos es que hay que separarlos del ADN cromosómico bacteriano y del ARN bacteriano. Existen 2 técnicas: Gradiente de CsCl y la Lisis Alcalína. ADN plasmídico El ADN plasmídico tiene una densidad mucho menor que el ADN cromosómico 30 4. PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS. Lisis alcalina Fundamento: se basa en diferencias en el proceso de desnaturalización/renaturalización del ADN cromosómico y el ADN plasmídico. Es el método más usado. 1. Bacterias resuspendidas. FASES: Solución muy alcalina 2. Lisis alcalina. pH= 11 3.Neutralización rápida. 4. Purificación del ADN plasmídico: por algún método como cromatografía pH ácido =4,5 de adsorción para eliminar el ARN La brusca neutralización del pH hace que el ADN cromosómico precipite, junto con las proteínas y el detergente. El ADN plasmidico se renaturaliza y mantiene en solución. 4. PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS Lisis alcalina SDS+NaOH Neutralización Rápida con Kac  4. PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. Consideraciones especiales para la purificación de ARN ▪ Trabajar con guantes en cabina de flujo laminar para evitar contaminaciones. ▪ Limpiar superficies con soluciones inactivadoras de ARNasas. ▪ Certificar que el material esté libre de ARNasas. ▪ La solución de lisis debe contener un agente caotrópico que inactive ARNasas. ▪ Todos los reactivos y el agua destilada deben estar libres de ARNasas. Para obtener agua destilada libre de ARNasas se trata con dietilpirocarbonato DEPC, El DEPC modifica los AA por lo que inactiva permanentemente las ARNasas. Antes de usarla el agua tratada tiene que autoclavarse a 120ºC drte 20 min., para ser degradado a CO2 y etanol y no inhibir reacciones enzimáticas posteriores. 33 5. AUTOMATIZACIÓN PROCESO EXTRACCIÓN/PURIFICACIÓN ⮚ Ventajas de la automatización: ⮚ Garantiza la obtención de los ácidos nucleicos altamente purificados. ⮚ Minimiza la contaminación de proteínas. ⮚ Evita la contaminación cruzada entre muestras. ⮚ Aporta rapidez, en una hora obtenemos ácido purificado. Tipos de instrumentos automáticos: ✔ Basados en el uso de partículas magnéticas ✔ Basados en cromatografía de adsorción ✔ Instrumentos. modulares ✔ https://www.medicalexpo.es/prod/ads-biotec-limited/product- 116783-902763.html 34  6 CALIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS PURIFICADOS Integridad de los ácidos nucleicos: es el parámetro que determina si un ácido nucleíco conserva su tamaño original. No es aplicable a las muestras de tejido FFPE La mejor manera de valorar la integridad es la Electroforesis en gel de agarosa: ⮚ ADN genómico. (1) en las muestras integras se obtiene una única banda perfectamente definida. Si el ADN se fragmenta o degrada, aparecerá una estela fluorescente o smear a lo largo de la calle de electroforesis. ⮚ ADN plasmídico. (2): 1 única banda (3 ⮚ ARN. (3): es normal que aparezca un ligero smear debido) al ARNm, con 2 bandas nítidas ARNr (1) (2) 35 6 Calidad de los ácidos nucleicos purificados Pureza de los ácidos nucleicos: es el parámetro que determina la ausencia de posibles contaminantes. ⮚La medida del grado de pureza se basa en una de las propiedades de los ácidos nucleicos: su máxima absorbancia a una longitud de onda de 260nm. ⮚Las proteínas y derivados fenólicos tienen su máximo de absorbancia a 280nm ⮚Carbohidratos y sales tienen su máxima absorbancia a 230nm.. ⮚Cuando el Cociente A260/A280 en el ADN. valor entre 1,7 y 2, tiene un grado de pureza adecuado. por debajo de 1,6 indica la existencia de contaminación. superiores a 2 indican una concentración elevada de ARN. la absorbancia del ARN a 260nm es mayor que la del ADN. ⮚Valores del cociente A260/A280 en el ARN adecuado valor entre 1,8 y 2,1 ⮚Cociente A260/A230 adecuado entre 1.5 y 2.2 por debajo indica presencia de contaminantes ⮚Absorbancia a 320 nm mide la turbidez de la solución (partículas en suspensión). 6 Calidad de los ácidos nucleicos purificados Concentración de los ácidos nucleicos: la cantidad de ácido nucleico usada en una reacción es un factor importante en la mayor parte de las técnicas de biología molecular. Uno de los métodos más usados para medir la concentración de una solución de AN es la Absorbancia a 260 nm. ⮚ La absorbancia de una disolución es directamente proporcional a la concentración del soluto en la disolución y al paso óptico de la cubeta en la que se realiza la medición. Los ácidos nucleicos tienen una Absorbancia máxima a 260 nm Fórmula de la concentración: (A260 – A320) × factor de dilución × factor de conversión 37 7 Almacenamiento de los ácidos nucleicos purificados El sistema de almacenamiento de ácidos nucleícos debe cumplir con dos objetivos fundamentales: garantizar su integridad y asegurar su trazabilidad. Condiciones para la integridad de las muestras: ⮚Tubos eppendorf o criotubos con cierre hermético y libres de nucleasas. (ADNasas/ARNasa ⮚Almacenamiento en frío: 4-5 días a -4ºC +de 5 días -20ºC Periodos largos -80ºC ⮚Congeladores con diversos sistemas de seguridad, en caso de que deje de funcionar: Sistema de alarma para avisar Sistema de seguridad de CO2 que permita conservar la temperatura. Sistema de monitorización de temperatura para comprobarla en todo momento. Trazabilidad de las muestras: Sistema de identificación adecuado de cada muestra. La mejor opción es codificación 2D grabada en el propio tubo., y cajas /racks perfectamente identificados. 38