Cuantificación de Proteínas totales por Método de Ácido Bicinconínico
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Questions and Answers

¿Cuál es el objetivo principal de la técnica de cuantificación de proteínas por ácido bicinconínico?

Determinar la concentración de proteínas en una muestra desconocida

¿De dónde se obtuvo la línea celular PANC-1?

De un hombre de 56 años caucásico con adenocarcinoma de células del conducto pancreático

¿Por qué se utiliza el método de ácido bicinconínico para determinar la concentración de proteínas?

Porque es altamente sensible y permite determinar bajas concentraciones de proteínas

¿Cuál es el ion que actúa sobre los enlaces peptídicos de la proteína en la primera reacción del método BCA?

<p>El sulfato de cobre (Cu2+ ion cúprico)</p> Signup and view all the answers

¿Qué se forma en la primera reacción del método BCA?

<p>El complejo proteína-ion cuproso (Cu1+)</p> Signup and view all the answers

¿Qué se lee en la segunda reacción del método BCA?

<p>Un color púrpura que se lee a un máximo de largo de onda de 562nm</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el nombre del método que se utiliza para determinar la concentración de proteínas?

<p>Método Ácido Bicinconínico (BCA)</p> Signup and view all the answers

¿Qué tipo de adenocarcinoma se encontró en la persona de donde se obtuvo la línea celular PANC-1?

<p>Adenocarcinoma de células del conducto pancreático</p> Signup and view all the answers

¿Qué es lo que se determinará en este laboratorio?

<p>La concentración de proteínas totales que se extrajeron del citoplasma de las células PANC-1</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el volumen de BSA necesario para preparar una dilución de 1:10 de la muestra de extracto del citoplasma con proteínas totales de las células PANC-1?

<p>4 µL</p> Signup and view all the answers

¿Qué es lo que se añade a cada pozo en la preparación del microplato de 96 pozos?

<p>10 µL de la muestra de BSA estándar y la muestra experimental, y 200 µL del BCA Working Buffer</p> Signup and view all the answers

¿Cuáles aminoácidos contribuyen al color en la determinación de proteínas totales?

<p>Tirosina, triptófano y cisteína</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es la temperatura a la que se incuba el microplato durante 30 minutos?

<p>37°C</p> Signup and view all the answers

¿Qué es lo que se coloca en el microtubo cuando se prepara la dilución del extracto del citoplasma?

<p>36 µL de dH2O estéril y 4 µL de la muestra</p> Signup and view all the answers

¿A qué longitud de onda se lee la absorbancia en el Microplate Reader iMARK?

<p>570 nm</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el color que se observa cuando las proteínas se encuentran en bajas concentraciones?

<p>Verde</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el objetivo de mantener el microtubo en hielo después de preparar la dilución?

<p>Para mantener la integridad de la muestra</p> Signup and view all the answers

¿Qué se utiliza para cubrir el plato después de agregar el BCA Working Buffer?

<p>Saran Wrap</p> Signup and view all the answers

¿Qué tipo de espectrometría se utiliza para determinar la concentración de proteínas totales?

<p>Espectrofotometría</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es la longitud de onda a la que se lee la absorbancia en el Microplate Reader iMARK?

<p>570 nm</p> Signup and view all the answers

¿Qué ecuación se aplica para determinar la concentración de proteínas?

<p>y = 0.0006x + 0.1357</p> Signup and view all the answers

¿Qué es el R² en la ecuación de regresión?

<p>0.9881</p> Signup and view all the answers

¿Qué es lo que se completa después de obtener los resultados del Microplate Reader?

<p>La tabla 1 con la información obtenida del instrumento</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el reactivo A del kit BCA Working Reagents?

<p>Sodium carbonate, sodium bicarbonate, bicinchoninic acid and sodium tartrate in 0.1 M sodium hydroxide</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el objetivo de incubar el microplato durante 30 minutos?

<p>Para permitir que la reacción del BCA Working Buffer ocurra</p> Signup and view all the answers

¿Qué equipo se utiliza para leer la absorbancia?

<p>Microplate Reader iMARK (Bio-Rad)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de la curva de calibración en la determinación de proteínas totales?

<p>Relacionar la absorbancia con la concentración de proteínas</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de construir la curva de calibración de BSA estándar?

<p>Determinar la concentración de proteínas totales en una muestra desconocida.</p> Signup and view all the answers

¿Cómo se obtiene la absorbancia promedio?

<p>Sumando las dos absorbancias medidas y dividiéndolas entre dos.</p> Signup and view all the answers

¿Por qué se realizó una dilución 1:10 de la muestra del extracto del citoplasma de las células PANC1?

<p>Para ajustar la concentración de proteínas a un rango adecuado para la medición de absorbancia.</p> Signup and view all the answers

¿Qué ecuación de regresión se utiliza para describir la relación entre la concentración de proteínas y la absorbancia?

<p>y = mx + b</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el coeficiente que se utiliza para medir la correlación entre la concentración de proteínas y la absorbancia?

<p>R²</p> Signup and view all the answers

¿Qué es necesario hacer con la ecuación de regresión para determinar la concentración de proteínas totales?

<p>Despejar la ecuación para x</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el paso 2 para utilizar el Microplate Absorbance Reader (iMARK, BioRad)?

<p>Encender el instrumento y ingresar el 'password' (00000)</p> Signup and view all the answers

¿Qué software se utiliza para analizar los datos obtenidos del Microplate Absorbance Reader?

<p>Microplate Manager 6 (MPM 6)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito del paso 5 en el procedimiento para usar el Microplate Absorbance Reader?

<p>Seleccionar 'New Experiment' en el software MPM 6</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito del botón 'Reader Set Up' en el proceso de diseño del experimento?

<p>Permite realizar ajustes en el sistema, como configurar el modo de lectura, velocidad de lectura, longitud de onda del filtro, entre otros.</p> Signup and view all the answers

¿Qué opciones de velocidad de lectura se ofrecen en el menú de configuración del sistema?

<p>Fast</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el rango de longitudes de onda disponibles para seleccionar en el sistema?

<p>De 405 a 750 nm</p> Signup and view all the answers

¿Qué sucede cuando se trabaja con dos longitudes de onda distintas?

<p>Se selecciona la opción de 'Dual Wavelength Operation', que puede ser 'Ratio' o 'Subtraction', según el protocolo.</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de los campos 'Mix Time' y 'Mix Speed' en la configuración del sistema?

<p>Ingresar el tiempo de mezcla y la velocidad de mezcla según el protocolo</p> Signup and view all the answers

¿Qué sucede después de que se ingresan los valores en el menú de configuración del sistema?

<p>Se presiona el botón 'OK' para guardar los cambios.</p> Signup and view all the answers

¿Qué debe hacerse después de configurar el sistema?

<p>Seleccione 'Read Plate' para iniciar el proceso de lectura</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito del botón 'Template' en el proceso de diseño del experimento?

<p>Ingresar la información del experimento diseñado</p> Signup and view all the answers

¿Cómo se pueden copiar y pegar réplicas en el template?

<p>Presionando Ctrl+C para copiar y Ctrl+V para pegar</p> Signup and view all the answers

¿Qué se puede cambiar en el sistema después de seleccionar una longitud de onda?

<p>Se puede cambiar la longitud de onda en single measurement</p> Signup and view all the answers

Study Notes

Objetivos y Introducción

  • Conocer la técnica de cuantificación de proteínas por ácido bicinconínico
  • Realizar una curva de calibración para determinar la concentración de proteínas en una muestra desconocida
  • La línea celular PANC-1 se obtuvo de un hombre de 56 años caucásico y provino de un adenocarcinoma de células del conducto pancreático

Método Ácido Bicinconínico (BCA)

  • El método BCA se utiliza porque es altamente sensitivo y permite determinar bajas concentraciones de proteínas
  • El método BCA consiste en dos reacciones
  • En la primera reacción, el sulfato de cobre (Cu2+ ion cúprico) actúa sobre los enlaces peptídicos de la proteína contribuyendo a la formación del complejo proteína-ion cuproso (Cu1+)
  • En la segunda reacción, el complejo proteína-Cu1+ reacciona con el BCA, generando un color púrpura que se lee a un máximo de largo de onda de 562nm

Preparación de la Muestra

  • Descongelar la muestra de extracto del citoplasma con proteínas totales de las células PANC-1
  • Preparar una dilución 1:10 de la muestra
  • Volumen total para preparar: 40µL
  • Añadir 36µL de dH2O estéril y 4µL de la muestra a un microtubo

Preparación del Microplato de 96 Pozos

  • Añadir 10 µL de la muestra de BSA estándar y la muestra experimental a cada uno de los pozos asignados
  • Añadir 200µL del BCA Working Buffer (Mezcla A y B) previamente preparado
  • Cubrir el plato con el Saran Wrap e incubar a 37°C en un water bath durante 30 minutos

Resultados y Análisis

  • La absorbancia se lee a 570nm utilizando el Microplate Reader iMARK (Bio-Rad)
  • Se construye una curva de calibración utilizando proteínas estándares como Bovine Serum Albumin (BSA) o Inmunoglobulina G (IgG)
  • Se aplica la ecuación de regresión (y=mx+b) para determinar la concentración de proteínas totales en las muestras desconocidas

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Cuantificación de Proteínas Totales - Método BCA (Ejercicio 7) PDF

Description

Aprende a cuantificar proteínas totales utilizando el método de ácido bicinconínico en un laboratorio de biología celular y molecular. Conoce los objetivos y pasos para realizar una curva de calibración para determinar la concentración de proteínas en una muestra desconocida.

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