Cellular and Molecular Biology Lab: Protein Quantification

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Questions and Answers

¿Cuál es el objetivo principal del método de ácido bicinconínico en este laboratorio?

Analizar la efectividad del sulfato de cobre en reacciones químicas

Investigar la relación entre el adenocarcinoma y la concentración de proteínas

Estudiar la estructura de las células PANC-1

Determinar la concentración de proteínas en una muestra desconocida (correct)

¿Qué es lo que se mantiene estable en condiciones alcalinas según el método Ácido Bicinconínico?

La concentración de sulfato de cobre

El color púrpura generado en la reacción (correct)

La temperatura de la reacción

La concentración de proteínas en la muestra

¿Cuál es el ion que se forma en la primera reacción del método BCA?

Cu3+

Cu2+

Cu4+

Cu1+ (correct)

¿Qué es lo que se utiliza para determinar la concentración de proteínas en la muestra?

La curva de calibración Signup and view all the answers

¿Cuál es la longitud de onda a la que se lee el color púrpura generado en la reacción?

562nm Signup and view all the answers

¿Por qué se utiliza el método Ácido Bicinconínico en este laboratorio?

Porque es altamente sensitivo y permite determinar bajas concentraciones de proteínas Signup and view all the answers

¿Qué es lo que se obtuvo del adenocarcinoma de células del conducto pancreático?

La línea celular PANC-1 Signup and view all the answers

¿Qué es lo que se utiliza en la primera reacción del método BCA?

El sulfato de cobre Signup and view all the answers

¿Cuál es el volumen del reactivo A que se debe servir en el 'beaker'?

10 mL Signup and view all the answers

¿Qué sucederá cuando se mezclan los reactivos A y B?

La solución se aclara y adquiere un color verde Signup and view all the answers

¿Cuál es la concentración final del BSA en la 'working solution'?

500 µg/mL Signup and view all the answers

¿Cuánto dH2O estéril se necesita para preparar la solución de BSA?

375 µL Signup and view all the answers

¿Cuántos microtubos se deben rotular con la concentración final de BSA?

10 microtubos Signup and view all the answers

¿Qué debe hacerse con la mezcla reactiva una vez preparada?

Dejarla a temperatura ambiente Signup and view all the answers

¿Quién se encargará de descartar la mezcla reactiva?

El técnico de laboratorio Signup and view all the answers

¿Cuál es la concentración inicial del BSA en la 'stock solution'?

2000 µg/mL Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de utilizar la ecuación de regresión en este experimento?

Establecer la relación entre la absorbancia y la concentración de proteínas Signup and view all the answers

¿Cuál es el papel de la cisteína en este experimento?

Es un aminoácido que contribuye al color de las proteínas Signup and view all the answers

¿Qué es lo que se utiliza para obtener la absorbancia en este experimento?

Un Microplate Reader iMARK (Bio-Rad) Signup and view all the answers

¿Cuál es la función del Reactivo B en el experimento?

Reacciona con las proteínas para producir un compuesto coloreado Signup and view all the answers

¿Cuál es el paso clave para determinar la concentración de proteínas totales en las muestras desconocidas?

Calcular la concentración de proteínas utilizando la ecuación de regresión Signup and view all the answers

¿Qué es lo que se utiliza como proteínas estándares en este experimento?

Albúmina de suero bovino (BSA) y Inmunoglobulina G (IgG) Signup and view all the answers

¿Cuál es la longitud de onda a la que se midi la absorbancia en este experimento?

570 nm Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito del agua ultrapura en este experimento?

Preparar el BCA Working Reagent Signup and view all the answers

¿Cuál es el volumen de agua que se necesita para preparar la solución de BSA al 20 µg/ml?

192 µL Signup and view all the answers

¿Cuál es el paso adecuado para preparar la dilución 1:10 de la muestra de extracto del citoplasma?

Añadir 4 µL de muestra a 36 µL de agua estéril Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de incubar el plato a 37°C durante 30 minutos?

Permitir que la reacción química ocurra Signup and view all the answers

¿Cuál es el volumen total de la solución de BSA que se necesita para preparar una solución al 100 µg/ml?

200 µL Signup and view all the answers

¿Cuál es la temperatura a la que se debe incubar el plato?

37°C Signup and view all the answers

¿Cuál es el paso siguiente después de incubar el plato durante 30 minutos?

Leer la absorbancia a 570nm Signup and view all the answers

¿Cuál es el volumen de la muestra de BSA estándar que se añade a cada pozo?

10 µL Signup and view all the answers

¿Cuál es el instrumento que se utiliza para leer la absorbancia a 570nm?

Microplate Reader iMARK Signup and view all the answers

¿Qué debe hacerse después de seleccionar 'Start Read' en la página?

Espere a que el instrumento complete la lectura Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de seleccionar 'Matrix' en el paso 18?

Guardar todos los resultados Signup and view all the answers

¿Qué debe hacerse después de presionar 'Export Data'?

Colocar el título del experimento Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de presionar el botón verde en el instrumento?

Apagar el instrumento Signup and view all the answers

¿Qué debe hacerse después de presionar 'Close Door'?

Apague la computadora Signup and view all the answers

¿Cuántos segundos debe mantenerse presionado el botón de apagado del instrumento?

5 segundos Signup and view all the answers

¿Qué debe hacerse después de apagar el instrumento?

Coloque el forro al instrumento Signup and view all the answers

¿Quién preparó originalmente este procedimiento?

Dra. Karen Woolcock Signup and view all the answers

Study Notes

Objetivos del Laboratorio

Conocer la técnica de cuantificación de proteínas por ácido bicinconínico
Realizar una curva de calibración para determinar la concentración de proteínas en una muestra desconocida

Introducción

La línea celular PANC-1 se obtuvo de un hombre de 56 años caucásico con adenocarcinoma de células del conducto pancreático
El método de ácido bicinconínico (BCA) se utiliza para determinar la concentración de proteínas totales en el citoplasma de las células PANC-1
El método BCA es altamente sensible y permite determinar bajas concentraciones de proteínas

Principio del método BCA

La primera reacción implica la formación del complejo proteína-ion cuproso (Cu1+) a partir de la proteína y el sulfato de cobre (Cu2+ ion cúprico)
La segunda reacción implica la formación de un color púrpura establo en condiciones alcalinas al reaccionar el complejo proteína-Cu1+ con el BCA

Preparación del Reactivo BCA

Se mezclan 10 mL del reactivo A y 0.2 mL del reactivo B
La mezcla se deja a temperatura ambiente hasta que se vaya a utilizar
El técnico de laboratorio se encargará de descartar la mezcla

Preparación del Estándar de BSA

Dos estudiantes prepararán el BSA estándar de 500 µg/mL
Se diluye el BSA (2mg/mL) a una concentración de 500 µg/mL (working solution)
Se prepara una solución trabajadora (working solution) de 500 µL

Dilución del Estándar de BSA

Se rotulan 10 microtubos con concentraciones de BSA que van desde 0 µg/mL hasta 200 µg/mL
Cada tubo se mantiene en hielo

Determinación de la Concentración de Proteínas Totales

Se utiliza espectrofotometría para obtener la absorbancia a 570 nm
Se construye una curva de calibración utilizando proteínas estándares como BSA o Inmunoglobulina G (IgG)
Se aplica la ecuación de regresión (y=mx+b)

Materiales

Proteínas totales del citoplasma de las células PANC-1
Albumina de suero bovino (2mg/mL)
BCA Working Reagents (WR)
Microplatos de 96 pozos
Punta estéril de 10, 100, 1000µL
Pipetas serológicas de 1 y 10 mL
Aspirador de vacío rápido de 2 y 10 mL
Beaker de 25 mL
Saran wrap
Microtubos estériles de 1.5 mL
Agua ultrapura
Hielo
Water Bath 37°C
Microplate Reader iMARK (Bio-Rad)

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Description

Este ejercicio de laboratorio te permite aprender y practicar la técnica de cuantificación de proteínas por ácido bicinconínico. Conoce los objetivos y pasos para determinar la concentración de proteínas en una muestra desconocida. Aprende a realizar una curva de calibración y más.