Ejercicio 7 Cuantificación de proteínas totales- Método BCA.pdf

UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO RECINTO DE ARECIBO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Ejercicio 7. Cuantificación de proteínas totales por el método de ácido bicinconínico OBJETIVOS 1. Conocer la técnica de cuantificación de proteínas por ácid...

UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO RECINTO DE ARECIBO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Ejercicio 7. Cuantificación de proteínas totales por el método de ácido bicinconínico OBJETIVOS 1. Conocer la técnica de cuantificación de proteínas por ácido bicinconínico 2. Realizar una curva de calibración para determinar la concentración de proteínas en una muestra desconocida INTRODUCCIÓN La línea celular PANC-1 fue obtenida de un hombre de 56 años caucásico. Provino de un adenocarcinoma de células del conducto pancreático. En este laboratorio se estará determinado la concentración de las proteínas totales que se extrajeron del citoplasma de las células PANC-1. El método que se estará utilizando para determinar la concentración es el Método Ácido Bicinconínico (BCA). El método Ácido Bicinconínico se utiliza debido a que es altamente sensitivo ya que permite determinar bajas concentraciones de proteínas. Además, el color se mantiene estable en condiciones alcalinas. El método BCA consiste en dos reacciones. En la primera reacción, el sulfato de cobre (Cu2+ ion cúprico) actúa sobre los enlaces peptídicos de la proteína contribuyendo a la formación del complejo proteína-ion cuproso (Cu1+). Esto se realiza bajo condiciones alcalinas. En la segunda reacción, el complejo proteína-Cu1+ reacciona con el BCA, generando un color púrpura que se lee a un máximo de largo de onda de 562nm. Los aminoácidos tirosina, triptófano y cisteína contribuyen al color. Se observa un color verde si las proteínas se encuentran en bajas concentraciones. Se estará leyendo, utilizando el Microplate Reader iMARK (Bio-Rad) a 570 nm. 1 A medida que aumenta la concentración, la intensidad del color púrpura aumenta. Para determinar la concentración de las proteínas totales en las muestras desconocidas: 1. se utiliza espectrofotometría para obtener la absorbancia 2. se construye una curva de calibración utilizando proteínas estándares como Bovine Serum Albumin (BSA) o Inmunoglobulina G (IgG) 3. se aplica la ecuación de regresión (y=mx+b) 0.3 Absorbancia (570nm) 0.25 0.2 0.15 y = 0.0006x + 0.1357 R² = 0.9881 0.1 0.05 0 0 50 100 150 200 250 Concentración (ug/mL) MATERIALES Proteínas totales del citoplasma de las células PANC-1 Albumina de suero bovino (2mg/mL) BCA Working Reagents (WR) (Pierce Thermo Scientific 23225): Reactivo A (sodium carbonate, sodium bicarbonate, bicinchoninic acid and sodium tartrate in 0.1 M sodium hydroxide) Reactivo B (4% cupric sulfate) Microplatos de 96 pozos Puntas estériles de 10, 100, 1000µL Pipetas serológicas de 1 y 10 mL Aspirador de vacío rápido de 2 y 10 mL Beaker de 25 mL Saran wrap Microtubos estériles 1.5 mL Agua ultrapura Hielo Water Bath 37oC Microplate Reader iMARK (Bio-Rad) 2 PROCEDIMIENTO Preparación del BCA Working Reagent 1. En un “beaker”, sirva el volumen de 10 mL del reactivo A (primero) y luego añada el volumen del reactivo B (0.2 mL). Al principio observará cierta turbidez en el “beaker”, pero a medida que se mezclan suavemente los reactivos la solución se aclarará y se observará un color verde. Dejar a temperatura ambiente (Room Temperature-RT) hasta que se vaya a utilizar. El técnico de laboratorio se encargará de descartar la mezcla. (estos volúmenes pueden cambiar según el volumen que requiera el grupo). Dilución del estándar de BSA (Albumina de suero bovino) 1. Dos estudiantes prepararán el BSA estándar de 500 µg/mL 2. Diluya el BSA (2000 µg/mL o 2mg/mL) (stock solution) a una concentración de 500 µg/mL (working solution). El volumen final para preparar es de 500 µL. 3. En un microtubo añada 125µL de BSA (2mg/mL) y 375µL de dH2O estéril. 4. Mezcle aspirando y expulsando con su micropipeta. Esta solución será utilizada para preparar cada una de las diluciones de BSA. Mantener la misma en hielo. 5. Dos estudiantes realizarán la dilución del BSA estándar de 0 µg/mL a 200 µg/mL a partir del BSA de 500 µg/mL previamente preparado. 6. Rotule 10 microtubos con la concentración final de BSA según indicado en la tabla a continuación. 7. Cada tubo debe mantenerse en hielo. Tubo Concentración final BSA (µg/ml) 1 0 2 5 3 10 4 20 5 40 6 80 7 100 8 140 9 180 10 200 * Working solution (500µg/ml) Volumen de BSA* (µl) 0 2 4 8 16 32 40 56 72 80 Volumen de agua (µl) 200 198 196 192 184 168 160 144 128 120 Volumen final (µl) 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 Dilución del extracto del citoplasma (proteínas de las células PANC) 1. Descongelar su muestra de extracto del citoplasma con proteínas totales de las células PANC-1. 2. Preparar una dilución 1:10 de la muestra. El volumen total para preparar es de 40µL. 3 Volumen total para preparar (µL)/ dilución = 40 µL/10 = 4 µL 3. En un microtubo añada 36µL de dH2O estéril y 4µL de su muestra. Mezcle la misma aspirando y expulsando con su micropipeta. Mantener el microtubo en hielo. Preparación del microplato de 96 pozos 1. Añada 10 µL de la muestra de BSA estándar y la muestra experimental a cada uno de los pozos asignados. 2. Añada a cada pozo 200µL del BCA Working Buffer (Mezcla A y B) previamente preparado. 3. Cubra el plato con el Saran Wrap e incube a 37°C en un water bath (baño de agua) durante 30 minutos. 4. Luego de los 30 minutos de incubación, retire el plato y permita que este llegue a temperatura ambiente (Room Temperature-RT). 5. Coloque el plato en el Microplate Reader iMARK (Bio-Rad) y lea la absorbancia a 570nm. 4 RESULTADOS Complete las tablas a continuación con la información obtenida del instrumento. Tabla 1. Título Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Concentración final BSA (µg/ml) 0 5 10 20 40 80 100 140 180 200 Absorbancia (570 nm) 1 Absorbancia (570 nm) 2 Promedio Absorbancia Ejemplo de datos obtenidos de absorbancia del Microplate Reader iMARK (Bio Rad) Construya la curva de calibración de BSA estándar (Figura ___.) usando la Concentración y la Absorbancia Promedia en Excel. Debe incluir la ecuación de regresión (y= mx+b) y el coeficiente de correlación (R2). Complete la siguiente tabla: Tabla 2. Título Para obtener la absorbancia promedio se suman las dos absorbancias (de las réplicas) y se divide entre dos. Determine la concentración de proteínas totales de su muestra del citoplasma de células trabajadas con la ecuación de regresión (y= mx +b). Recuerde que deben despejar la ecuación para determinar la concentración de proteínas totales (x). 5 La concentración final es la concentración obtenida multiplicada por 10 ya que se realizó una dilución 1:10 de la muestra del extracto del citoplasma de las células PANC1. PROCEDIMENTO PARA EL USO DEL MICROPLATE ABSORBANCE READER (imark BIORAD) 1. Encienda la computadora (Laptop) 2. Encienda el instrumento e ingrese el “password” en el instrumento (00000). Oprima ENTER. (Para encender el instrumento debe dejar presionado el botón power por 2 segundos). 3. Marque BIORAD en la computadora. 4. En el desktop de la computadora abra el software MPM 6 (Microplate Manager 6). 5. Seleccione New Experiment. 6. Verifique que se encuentre en Raw Data. (Por default debes estar en Raw Data). 7. Seleccione Template (localizado en el toolbar de la parte superior) (verifique que la página indique Template). 8. Ingrese en el template la información que corresponde al experimento diseñado. A. Las réplicas deben identificarse con el mismo código. (Puede marcar copy presionando el botón del teclado (Ctrl+C) y para paste (Ctrl+V) o se puede hacer en forma individual. 9. Presione el icono Reader Set Up (el símbolo se encuentra localizado en la parte superior/ aparece una computadora con un destornillador y una llave). 10. El Sistema le presentará el menú en el que podrá realizar lo siguiente: a. Read mode: Endpoint b. Read speed: Fast c. Seleccione el largo de onda (Wavelength) del filtro de acuerdo con su protocolo. En el caso de que solo se trabajara con un largo de onda seleccione single. Se puede cambiar el largo de onda en single measurement. Ej 570 o 405 nm. (Los largos de onda van de 405 a 750 nm). Si fuese a trabajar con dos largos de onda distintas puede seleccione Dual. Cuando se trabaja con dos largos de ondas hay que 6 seleccionar el dual wavelength operation que puede ser Ratio o Substraction de acuerdo a su protocolo. d. Ingresar el Mix time (0). e. Ingresar el Mix Speed (M) (Puede ser High, Medium o Low de acuerdo a su protocolo). f. Marque OK una vez ingrese los valores. 11. Seleccione Read plate (localizado en la parte superior, flecha hacia arriba). 12. Para colocar el plato, presione Open y Close en la misma página o en el instrumento. Seleccione Start Read en la parte inferior de la página. 13. Marque Done. 14. Cuando el instrumento complete la lectura, oprima File y Export/Import. 15. Presione la opción Export Data 16. Coloque el título del experimento. 17. En Files of type, verifique que indique csv (permite guardar los datos en Excel). Marque Save. 18. Seleccione en Export set up: Matrix, Both (permite guardar todos los resultados) 19. Volver a marcar Read Plate. 20. Presionar Open Door, remover el plato y presionar Close Door. 21. Apague la computadora. 22. Apague el instrumento con el botón verde. Lo tiene que dejar oprimido por 5 segundos. 23. En Power Off (del instrument), oprimir Enter. 24. Colocar el forro al instrumento. Preparado por Dra. Karen Woolcock (2017) Revisado y editado por Prof. Arlyn Pérez (2018) Revisado y editado por Dra. Lizbeth Romero (2024) 7