Biologia Molecolare - Tecnica RNAi

Biologia Molecolare - Appunti di Lezione

• Ridurre l'espressione proteica: Si utilizza la tecnologia RNA interference (RNAi) con small interfering RNA (siRNA). Questi siRNA sono complementari al mRNA della proteina bersaglio. All'interno della cellula, il siRNA lega il suo mRNA complementare, causando la sua degradazione e impedendo la traduzione della proteina.

• Meccanismo d'azione: Il siRNA si lega a proteine argonauta e altre componenti necessarie per formare il RNA-induced silencing complex (RISC). Il RISC dirige il siRNA verso il mRNA bersaglio, dove l'appaiamento siRNA-mRNA porta alla degradazione del mRNA.

• Durata dell'effetto di silenziamento: L'effetto del siRNA è temporaneo, raggiungendo il picco in genere entro 48-72 ore dall'introduzione. La durata è limitata dalla degradazione naturale del siRNA e dall'esaurimento del suo rifornimento intracellulare.

• Mantenere l'effetto di silenziamento: Per prolungare l'effetto, si possono impiegare strategie come ripetute trascrizioni o iniezioni di siRNA, oppure si possono utilizzare vettori virali per produrre in modo continuativo siRNA all'interno delle cellule.

Divisione Cellulare dei Cardiomiociti usando miRNA

• Analisi della divisione cellulare: Lo studio analizza la divisione cellulare dei cardiomiociti, focalizzandosi sul miRNA-590 e il suo impatto sulla proliferazione.

• Screening della proliferazione: Si trasferisce ciascun miRNA in un pozzetto contenente cardiomiociti. Dopo 72 ore, si aggiunge EdU (5-etil-2'-deossiuridina) per identificare le cellule in fase di proliferazione. Le cellule vengono poi fissate e colorate per l'analisi al microscopio, utilizzando marcatori come a-actinina (verde) per i cardiomiociti, Hoechst (blu) per i nuclei e EdU (rosso) per la sintesi del DNA.

• Risultati dell'analisi microscopica: Lo studio ha evidenziato che il miRNA-590 è efficace nel promuovere la proliferazione cellulare, con circa il 50% delle cellule positive al marcatore EdU.

Applicazioni terapeutiche e problematiche

• Obiettivo: L'esperimento ha valutato se la riacquisita capacità di proliferare potesse essere utile nel trattamento di infarti miocardici, invertendo il tessuto cicatriziale post-infarto. Gli esperimenti sono stati condotti su animali da laboratorio (fino ai maiali, per la maggiore somiglianza fisiologica all'uomo).

• Risultati: I miRNA selezionati hanno mostrato una riduzione del tessuto cicatriziale post-infarto, dimostrando un possibile effetto terapeutico.

• Problematiche: L'espressione continua e sostenuta di miRNA-590, mediata dai vettori virali, ha portato a potenziali complicazioni, come iperplasia del tessuto muscolare e aritmie, causando la morte dei maiali dopo 60 giorni dal trattamento.

Soluzione

• Strategie alternative: Per un uso umano, si propone di ridurre la somministrazione continua di miRNA tramite una consegna intermittente (micelle).

• Tempo di rilascio: Le micelle rilasciano il siRNA o il miRNA in un intervallo temporale ben definito (72-96 ore), riducendo il rischio di effetti collaterali.

• Approccio promettente: L'uso controllato di miRNA/siRNA nell'uomo si presenta come un approccio promettente ma complesso, necessitando di una profonda comprensione della biologia molecolare e un'attenta gestione del rapporto tra efficacia e sicurezza.

Scopri come funziona la tecnologia RNA interference (RNAi) e il suo utilizzo nel silenziamento genico. In questo quiz, esplorerai i meccanismi d'azione dei piccoli RNA interferenti (siRNA) e l'effetto temporaneo della loro introduzione nelle cellule. Metti alla prova la tua conoscenza della biologia molecolare!