Biologia Molecolare Past Paper 2023 PDF

13.2 Biologia Molecolare 28.11.2023 La Professoressa risponde ad alcune domande prima di riprendere l’argomento dell’ora precedente: "Come si può ridurre l'espressione di una proteina specifica usando la tecnologia a RNA e qual è la...

13.2 Biologia Molecolare 28.11.2023 La Professoressa risponde ad alcune domande prima di riprendere l’argomento dell’ora precedente: "Come si può ridurre l'espressione di una proteina specifica usando la tecnologia a RNA e qual è la durata dell'effetto?" 1. Riduzione dell’Espressione Proteica: Per ridurre l’espressione di una proteina specifica si utilizza la tecnologia di RNA interference (RNAi). Questo processo impiega molecole di small interfering RNA (siRNA) che sono progettate per essere complementari al mRNA della proteina target. Una volta all’interno della cellula, queste molecole di siRNA si legano al loro mRNA complementare. 2. Meccanismo di Azione: Il siRNA forma un complesso con le proteine argonauta e altre componenti necessarie per formare il RNA-induced silencing complex (RISC). Il RISC guida il siRNA verso il mRNA target, dove l’abbinamento tra siRNA e mRNA porta alla degradazione del mRNA. Questo impedisce la traduzione del mRNA in proteina, riducendo così l’espressione della proteina target. 3. Durata dell’Effetto: La durata dell’effetto di silenziamento del siRNA è temporanea. In generale, il picco di attività si verifica entro 48-72 ore dall’introduzione del siRNA nella cellula. Tuttavia, l’effetto può diminuire nel tempo a causa della degradazione naturale del siRNA e dell’esaurimento del suo rifornimento all’interno della cellula. 4. Sostenere l’Effetto: Per mantenere l’effetto di silenziamento, si possono adottare strategie come ripetute trascrizioni o iniezioni del siRNA. Un’altra possibilità è l’utilizzo di vettori virali per produrre siRNA direttamente all’interno delle cellule, creandone una fonte continua che prolunga l’effetto di silenziamento. DIVISIONE CELLULARE DEI CARDIOMICITI USANDO miRNA Viene analizzata la divisione cellulare dei cardiomiociti attraverso l'uso dei miRNA, con un focus specifico sul miRNA-590 e il suo impatto sulla proliferazione cellulare. 1 Sbobinatore: Massimo Ianderca Revisore: Karim Hasan 13.2 Biologia Molecolare 28.11.2023 Partendo da una vasta biblioteca di miRNA, si esplora la possibilità di stimolare la proliferazione dei cardiomiociti, cellule normalmente non proliferanti, con dei vettori virali per evitare la catastrofe mitotica e generare una popolazione di cellule in grado di dividersi. SCREENING DELLA PROLIFERAZIONE Durante lo screening, ciascun miRNA viene trasferito in un pozzetto contenente cardiomiociti. Dopo 72 ore, necessarie per osservare gli effetti, si aggiunge un analogo della Timina chiamato EdU (5-etinil-2'-deossiuridina) per identificare le cellule in fase di proliferazione. Le cellule vengono poi fissate e colorate con dei marcatori specifici per l'analisi al microscopio: α-actinina, in verde, per i cardiomiociti; Hoechst, in blu, che si lega al DNA dei nuclei di tutte le cellule fornendo una mappa visiva completa di tutti i nuclei presenti nel campione; EdU, in rosso, per segnalare la sintesi del DNA, identificando le cellule nella fase attiva della divisione cellulare. Inoltre, sono visibili dei puntini gialli, risultanti dalla fusione dei segnali verde e rosso, e indicano i cardiomiociti in fase di replicazione del DNA. RISULTATI DELL’ANALISI MICROSCOPICA Il miRNA-590 si è distinto per la sua efficacia nel promuovere la proliferazione cellulare, come evidenziato dalla presenza di marcature rosse e confermato da un grafico a dispersione che mostra il 50% di cellule positive al marcatore EdU. 2 Sbobinatore: Massimo Ianderca Revisore: Karim Hasan 13.2 Biologia Molecolare 28.11.2023 Inoltre, visto che si è notato un altro miRNA che cambia completamente la forma del cardiomiocita, si deduce che i bersagli non sono legati solamente alla proliferazione ma anche al cambiamento della forma (e probabilmente anche della forza contrattile di queste cellule). Questo a dimostrazione che esistono molti miRNA dai diversi tipi di effetto e che ne sono stati testati circa 1000 durante questo test sperimentale. APPLICAZIONI TERAPEUTICHE E PROBLEMATICHE L'esperimento è stato intrapreso per valutare se la capacità riacquistata di proliferare potesse essere utile nel trattamento di infarti miocardici. Perciò, partendo con l’idea di revertire il tessuto cicatriziale post-infarto nel cuore, è stata osservata la coltura delle cellule in vitro da cui, una volta ricevuti riscontri favorevoli, si è passati a una prima fase sperimentale su animali da laboratorio, per poi procedere con animali più simili fisiologicamente all’uomo, come il maiale. Infatti nei maiali è stata osservata una riduzione del tessuto cicatriziale post-infarto nei cuori trattati con i miRNA selezionati, dimostrando potenziale terapeutico. Tuttavia, sono emerse problematiche significative: l'espressione continua e sostenuta di miRNA-590, mediata da vettori virali, ha portato a complicazioni quali iperplasia del tessuto muscolare e aritmie, causando la morte dei maiali dopo 60 giorni dal trattamento. 3 Sbobinatore: Massimo Ianderca Revisore: Karim Hasan 13.2 Biologia Molecolare 28.11.2023 SOLUZIONE In considerazione delle informazioni riguardanti l’uso degli miRNA per indurre la proliferazione dei cardiomiociti, la soluzione proposta per applicare questa tecnica nell’uomo richiede un adeguamento nel metodo di somministrazione degli miRNA: invece di utilizzare un vettore virale che produce miRNA in modo continuativo, si propone l’uso di un sistema di consegna che limiti temporalmente l’effetto dei miRNA. Questo può essere ottenuto tramite l’utilizzo di micelle, che rilasciano miRNA o siRNA (small interfering RNA) in una finestra temporale specifica, generalmente compresa tra le 72 e le 96 ore. Tale approccio mira a sfruttare l’effetto terapeutico degli miRNA riducendo contemporaneamente il rischio di effetti collaterali. È importante notare che la scelta di miRNA o siRNA come target dipende dagli obiettivi specifici del trattamento. Mentre i miRNA possono regolare l’espressione di molti geni, i siRNA sono generalmente più specifici e infatti vengono utilizzati per il silenziamento di un singolo gene. In ogni caso, è fondamentale valutare attentamente sia gli effetti desiderati che quelli indesiderati di questi piccoli RNA nel contesto clinico. In conclusione, l’uso controllato di miRNA o siRNA nell’uomo rappresenta un approccio promettente ma complesso, che richiede una comprensione approfondita della biologia molecolare e un attento equilibrio tra efficacia terapeutica e sicurezza del paziente. 4 Sbobinatore: Massimo Ianderca Revisore: Karim Hasan