Biochemie Praktikum Wintersemester 2023/2024
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Questions and Answers

Wie werden Proteine bei der Gelfiltrationschromatographie aufgetrennt?

  • Nach ihrem Molekulargewicht
  • Nach ihrer Größe (correct)
  • Nach ihrer elektrischen Ladung
  • Nach ihrer chemischen Struktur

    • Was passiert mit kleinen Molekülen während der Gelfiltrationschromatographie?

  • Sie können nicht innerhalb der Lösung verteilt werden.
  • Sie bleiben außerhalb der porösen Kügelchen.
  • Sie dringen in die Kügelchen ein. (correct)
  • Sie bewegen sich schneller als große Moleküle.

    • Wie beeinflusst die Länge der Säule die Trennung der Proteine?

  • Die Trennung wird schlechter je länger die Säule ist.
  • Die Auflösung der Trennung erhöht sich mit der Säulenlänge. (correct)
  • Längere Säulen verhindern die Diffusion.
  • Die Trennung bleibt konstant, unabhängig von der Säulenlänge.

    • Welche Moleküle verlassen die Gelfiltrationssäule zuerst?

    <p>Die großen Moleküle, da ihr verfügbarer Raum begrenzt ist.</p> Signup and view all the answers

    Welche Rolle spielen die porösen Partikel in der Gelfiltrationschromatographie?

    <p>Sie ermöglichen das Eindringen von kleinen Molekülen.</p> Signup and view all the answers

    Welche Faktoren beeinflussen die Diffusionsrate durch die Membran?

    <p>Der Konzentrationsgradient der Teilchen</p> Signup and view all the answers

    Welches Element ist kein Teil der chromatographischen Trennmethode?

    <p>Die chemische Reinigung</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt die isokratische Trennung in der Chromatographie?

    <p>Eine konstante Lösungsmittelzusammensetzung</p> Signup and view all the answers

    In der Säulenchromatographie ergeben sich Unterschiede in der Wanderung der Proteine aufgrund von:

    <p>Unterschiedlichen Wechselwirkungen mit dem Füllmaterial</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Aussagen zur mobilen Phase ist falsch?

    <p>Sie enthält immer einen festen Anteil an Feststoffen.</p> Signup and view all the answers

    Was passiert mit dem Eluat in der Säulenchromatographie?

    <p>Es wird kontinuierlich ersetzt durch neue Lösung.</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Eigenschaften ist kein Kriterium für die Trennung in der Chromatographie?

    <p>Farbe der Komponenten</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt die Gradiententrennung in der Chromatographie am besten?

    <p>Eine Veränderung der Lösungsmittelzusammensetzung während der Elution</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Methoden wird zur Entsalzung einer Proteinlösung verwendet?

    <p>Dialyse</p> Signup and view all the answers

    Wie wird die Leitfähigkeit zur Bestimmung der Salzkonzentration in einer Probe genutzt?

    <p>Durch direkten Vergleich mit einem Standard</p> Signup and view all the answers

    Was ist das Molekulargewicht von Ammoniumsulfat?

    <p>132.14 g/mol</p> Signup and view all the answers

    Welche Größe hat die Dialysemembran im Vergleich zur Gelchromatographie?

    <p>10 kD</p> Signup and view all the answers

    Wie erfolgt die Bestimmung der Proteinkonzentration nach der Dialyse?

    <p>Mit Hilfe des Bradford-Assays</p> Signup and view all the answers

    Wie wird die Entsalzung der Proteinlösung während der Dialyse durchgeführt?

    <p>Mit einem Magnetrührer</p> Signup and view all the answers

    Was passiert mit der entsalzten Probe nach der Dialyse?

    <p>Sie wird eingefroren</p> Signup and view all the answers

    Was ist das Ziel der Bradford-Färbereaktion in diesem Kontext?

    <p>Bestimmung der Proteinkonzentration</p> Signup and view all the answers

    Was ist der Hauptgrund für das Entsalzen von Proteinlösungen im Reinigungsschritt?

    <p>Um unerwünschte Ionen und Verunreinigungen zu entfernen.</p> Signup and view all the answers

    Welche Methode wird verwendet, um Proteine aufgrund ihrer Größe zu trennen?

    <p>Gelchromatographie</p> Signup and view all the answers

    Welches dieser Eigenschaften ist nicht Teil der Proteinreinigung?

    <p>Farbe</p> Signup and view all the answers

    Was ist das Ziel der Dialyse in der Proteinaufreinigung?

    <p>Die Proteine von kleineren Molekülen zu trennen.</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Aussagen über Ionenaustauschchromatographie ist falsch?

    <p>Sie ist eine Methode zur Entsalzung von Proteinen.</p> Signup and view all the answers

    Wie viele grundlegende Schritte umfasst der Prozess zur Isolation von Proteinen laut dem gegebenen Inhalt?

    <p>Mehrere</p> Signup and view all the answers

    Was erfordert die Charakterisierung eines Proteins?

    <p>Eine kleine Menge gereinigtes Protein.</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Methoden wird nicht zur Trennung von Proteinen nach ihrer spezifischen Bindungsaktivität genutzt?

    <p>SDS-PAGE</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt das Größenausschlussprinzip in Bezug auf semipermeable Membranen?

    <p>Nur kleine Moleküle können die Membran passieren.</p> Signup and view all the answers

    Wie wird der Molekulargewichtsgrenzwert (MWCO) definiert?

    <p>Das Molekulargewicht der Proteine, die zu 90% von der Membran ausgeschlossen werden.</p> Signup and view all the answers

    Welches Gesetz beschreibt den Diffusionsfluss der gelösten Teilchen?

    <p>Das 1. Ficksche Gesetz.</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Aussagen über Osmose ist korrekt?

    <p>Osmose ist der Transport von Lösungsmittelteilchen durch eine semipermeable Membran.</p> Signup and view all the answers

    Was passiert während des Dialyseprozesses?

    <p>Es gibt einen Austausch von Puffersubstanzen an der Membran.</p> Signup and view all the answers

    Was ist eine wichtige Eigenschaft von semipermeablen Membranen?

    <p>Sie haben Poren unterschiedlicher Größen.</p> Signup and view all the answers

    Was ist der Effekt eines höheren Reibungskoeffizienten (f) auf den Diffusionsprozess?

    <p>Die Diffusion wird langsamer.</p> Signup and view all the answers

    Welche Rolle spielt die Viskosität (η) im Diffusionsprozess?

    <p>Sie bestimmt die Bewegungsgeschwindigkeit der gelösten Teilchen.</p> Signup and view all the answers

    Was beschreibt das Ausschlussvolumen (V0) in der Größenausschlusschromatographie?

    <p>Das Volumen des Raums zwischen den Partikeln</p> Signup and view all the answers

    Wie beeinflusst der Partikeldurchmesser die Auflösung in der Chromatographie?

    <p>Ein kleinerer Durchmesser führt zu einer besseren Auflösung, aber einem höheren Druck.</p> Signup and view all the answers

    Welche Rolle spielen große Moleküle in der Gelfiltrationschromatographie?

    <p>Sie verlassen das Trennmedium früher als kleine Moleküle.</p> Signup and view all the answers

    Was ist ein optimales Ergebnis einer effektiven Größenausschlusschromatographie?

    <p>Schlanke, symmetrische Proteinpeaks.</p> Signup and view all the answers

    Welches Material ist kein Trägermaterial in der Chromatographie?

    <p>Kohlenstoffdioxid</p> Signup and view all the answers

    Was passiert mit kleinen Molekülen in den Kügelchen während der Chromatographie?

    <p>Sie dringen in die wässrigen Hohlräume ein.</p> Signup and view all the answers

    Welche der folgenden Aussagen trifft auf das Innere der Kügelchen zu?

    <p>Es ist das Volumen, das durch die Poren in den Partikeln bestimmt wird.</p> Signup and view all the answers

    Was stellt das Gesamtvolumen (Vt) in der Chromatographie dar?

    <p>Die Summe aus Ausschlussvolumen und innerem Volumen.</p> Signup and view all the answers

    Study Notes

    Biochemie Praktikum - Wintersemester 2023/2024

    • Kurs: 485.049 Biochemie Lab Course / 630.110 / 665.055 Molekulare Biologie und Biochemie
    • Semester: Wintersemester 2023/2024
    • Dozentin: Dr. Martina Sonego
    • E-Mail: [email protected]

    Praktikumsaufbau

    • Tag 1:
      • Konzentrieren
      • Denaturierende und native Fällung
      • Protein Konzentrationsbestimmung
    • Tag 2:
      • Entsalzen
      • Gelchromatographie
      • Dialyse
    • Tag 3:
      • Elektrophorese
      • SDS-PAGE

    Warum Entsalzen?

    • Bei der Proteinreinigung entstehen oft Lösungen, die in ihrer Ionenstärke oder Pufferzusammensetzung für den nächsten Reinigungsschritt ungeeignet sind.
    • Daher ist die Abtrennung von Salzen und hydrophilen Verunreinigungen nötig.

    Isolierung von Proteinen

    • Es gibt über 25.000 Proteine in höheren Organismen.
    • Eigenschaften wie Größe, Löslichkeit, Ladung und Bindungsaktivität werden zur Reinigung benutzt.
    • Für die Charakterisierung von Proteinen werden einige mg gereinigtes Protein benötigt.
    • Dialyse: Trennung von Proteinen und kleineren Molekülen (Lösungsaustausch).
    • Gelchromatographie: Trennung basierend auf der Größe der Proteine.
    • lonenaustauschchromatographie: Trennung nach der Nettoladung der Proteine.
    • Affinitätschromatographie: Trennung basierend auf der Affinität der Proteine zu bestimmten chemischen Gruppen oder Liganden.

    Isolierung von Protein – Reinigungsschritte

    • Protein Rohextrakt wird zuerst vorfraktioniert (partielle Fällung, Solubilisierung, Organelle-Isolierung)
    • Protein Fraktion 1 wird durch Pufferaustausch aufbereitet.
    • Protein Fraktion 2 durch verschiedene Reinigungsschritte aufbereitet (Ausschluss-, lonenaustausch-, Affinitätschromatographie.
    • Reinigungsschritt n führt zum gereinigten Protein.

    Dialyse

    • Am weitesten verbreitete Entsalzungsmethode.
    • Prinzip basiert auf dem Größenausschlussprinzip.
    • Semipermeable Membranen, kleine Moleküle und Ionen können passieren, größere Moleküle werden zurückgehalten.
    • Semipermeable Membranen haben unterschiedliche Porengrößen (MWCO).
    • MWCO ist das Molekulargewicht der Proteine, die zu 90% von der Membran ausgeschlossen werden.

    Dialyse – Biophysikalische Prozesse bei der Dialyse

    • Diffusion: Diffusionsfluss der gelösten Teilchen.
    • Osmose: Diffusion der Lösungsmittelteilchen durch eine semipermeable Membran.

    Dialyse – Wahl des richtigen Molekulargewichtsgrenzwerts (MWCO)

    • MWCO ist ein Maß für die Retentionsleistung der Membran.
    • Mindestens 90% der Partikel mit dem MWCO sollten zurückgehalten werden.

    Dialyse - Wahl des richtigen Membranmaterials

    • Dialysemembranen aus verschiedenen Materialien.
    • Material sollte inert sein (keine Bindung an Proteine oder andere Substanzen).
    • Berücksichtigung von pH-Wert, Lösungsmittelresistenz und Temperaturbereich.
    • Beispiele für Materialien: Celluloseacetat, Cellulosenitrat, Polyamid, Polycarbonat, Polytetrafluorethylen (PTFE), Regenerierte Cellulose.

    Dialyse - Biophysikalische Parameter der Proteine

    • pH-Wert und Ionenkonzentration beeinflussen die Oberflächenladung von Proteinen.
    • Ungünstige Bedingungen können zu Ausfällung von Proteinen führen (hydrophobe oder hydrophiler Wechselwirkungen).

    Dialyse in der Praxis

    • Puffer wird gerührt und gewechselt, um einen großen Konzentrationsgradienten an der Membranoberfläche zu erzeugen.
    • Fortschritt der Entsalzung wird mittels Leitfähigkeitsmessung des Puffers überwacht.
    • Bei weitgehender Entsalzung (Dialyse gegen Wasser) können Proteine wegen der niedrigen Ionenstärke ausfallen.

    Dialyse in der Praxis - Vorgehensweise

    • Proteinlösung in Dialysebeutel füllen, mit einer semipermeablen Membran.
    • Dialysebeutel in ein Becherglas mit Pufferlösung geben.
    • Bei Bedarf durch ständige Rührmethode den Konzentrationsgradienten erhöhen..

    Chromotographie

    • Trennmethode, um Komponenten einer Molekülmischung aufgrund ihrer Eigenschaften (Löslichkeit, Größe, Ladung, oder Funktion) zu trennen.
      • Mobile Phase: Gase oder Flüssigkeiten (Gaschromatographie (GC), Flüssigkeitschromatographie (LC)).
      • Stationäre Phase: Flüssigkeiten oder Festkörper.

    Säulenchromatographie

    • Stationäre Phase in einer Säule verpackt.
    • Probenlösung (Mobile Phase) fließt durch die Säule.
    • Moleküle in der Probe haben unterschiedliche Wechselwirkungen mit dem Füllmaterial, wodurch sie unterschiedlich lange in der Säule zurückgehalten werden.
    • Trennung in Fraktionen.

    Chromatographie - Theorie (Prinzip der Größenausschlusschromatographie)

    • Nach Probenauftrag wandern unterschiedliche Komponenten mit unterschiedlicher Geschwindigkeit durch die Säule.
    • Durch das Ausschlussvolumen (Vo) wird das Volumen zwischen den Partikeln beschrieben.
    • Durch das innere Volumen (V1) wird das Volumen innerhalb der Poren der Partikel beschrieben.
    • Das Gesamtvolumen (Vt) entspricht Vo + Vi.
    • Detektion der eluierten Komponenten, wie Peaks im Chromatogramm.

    Gelfiltrationchromatographie

    • Auftrennung der Proteine nach Größe.
    • Probe wird auf eine Säule aus porösen Kügelchen aufgetragen.
    • Kleine Moleküle dringen in die Kügelchen ein, große nicht.
    • Große Moleküle verlassen die Säule zuerst.

    Chromatographie - Stationäre Phase

    • Gepackte Trennsäulen (Metall, Kunststoff oder Glas) mit Füllmaterial (mit einheitlicher Größe).
    • Poröse Partikel ermöglichen das Eindringen von Molekülen (vergrößern das Volumen für kleinere Moleküle).
    • Vorteile der unterschiedlichen Oberflächen der Partikel, sorgen für unterschiedliche Wechselwirkungen der Analyten mit der stationären Phase.

    lonenaustauschchromatographie

    • Trennung nach der Nettoladung von Proteinen.
    • Anionenaustauscher: Negativ geladene Proteine werden in Säulen mit positiv geladenen funktionellen Gruppen getrennt.
    • Kationenaustauscher: Positiv geladene Proteine werden in Säulen mit negativ geladenen funktionellen Gruppen getrennt.
    • Start mit einer ionengebundenen Matrix, die Proteinbindung auslöst.
    • Elution der Proteine mittels Steigerung der Salzkonzentration.

    Affinitätschromatographie

    • Trennung basierend auf der hohen Affinität von Proteinen zu bestimmten chemischen Gruppen oder Liganden.
    • Beispiel: Verwendung von Concanavalin A, welches eine Affinität zu Glucose besitzt.
    • Elution der Proteine mittels Zugabe einer konzentrierten Lösung von Glucose.

    Leitfähigkeit

    • Messung der elektrischen Leitfähigkeit (µS) zur Bestimmung der lonenkonzentration in Lösungen.
    • Die Leitfähigkeit ist abhängig von der Konzentration, der lonenladung und der Beweglichkeit der lonen.

    Praktikum (Probe von Proteine-Teil I)

    • a. Entsalzen einer Proteinlösung (Pellet) mittels Dialyse
    • b. Entsalzen einer Proteinlösung (Überstand) mittels Gelchromatographie.
    • c. Messung der Leitfähigkeit (Salzkonzentration) vor und nach Entsalzung.
    • d. Bestimmung der Proteinkonzentration der Fraktionen mittels Bradford-Färbereaktion.

    A. Dialyse

    • 200 µl Probe (Pellet) in Dialysekapseln pipettieren.
    • Dialysekapsel in Becherglas mit Wasser.
    • Dialyse unter ständigem Rühren.
    • Protein- und Salzkonzentration nach der Dialyse messen.
    • Dialysekapsel wird für das nächste Praktikum eingefroren.

    B. Gelchromatographie

    • Fertig gepackte NAP-5 Säulchen (mit Sephadex G-25)
    • Ausschlussgröße von 10 kDa.
    • 100 µl Proteinlösung (Überstand) auf die Säule.
    • Eluat in Mikrotiterplatte auffangen.
    • Protein- und Salzkonzentration der Fraktionen bestimmen.
    • Fraktionen mit hoher Proteinkonzentration für späteres Praktikum einfrieren.

    C. Leitfähigkeitmessung

    • Eichgerade für Ammoniumsulfat erstellen.
    • Messung der Leitfähigkeit von Pellet, Überstand, 24 Fraktionen und Dialysat.

    D. Proteinbestimmung

    • Eichgerade für BSA erstellen, um die Absorption in mg/ml umzurechnen.
    • Proteinkonzentration der Fraktionen mittels Bradford-Assay bestimmen.

    Salzgehalt berechnen

    • Proteinkonzentration und Salzkonzentration (in mM) der Proben sind bekannt.
    • Ammoniumsulfat hat ein Molekulargewicht von 132,14 g/mol.
    • Salzgehalt der Proben in µg Salz pro mg Protein berechnen

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