Folien VO Proteine II PDF - Biochemistry Lab Course 2023/2024

485.049 Biochemistry Lab Course 630.110/ 665.055 Molekulare Biologie und Biochemie Wintersemester 2023/2024 Teil Proteine II – Dialyse und Chromotographie Dr. Martina Sonego [email protected] Praktikumsaufbau  Tag 1: Konzentrieren Denaturierende und native Fällung...

485.049 Biochemistry Lab Course 630.110/ 665.055 Molekulare Biologie und Biochemie Wintersemester 2023/2024 Teil Proteine II – Dialyse und Chromotographie Dr. Martina Sonego [email protected] Praktikumsaufbau  Tag 1: Konzentrieren Denaturierende und native Fällung Protein Konzentrationsbestimmung  Tag 2: Entsalzen Gelchromatographie Dialyse  Tag 3: Elektrophorese SDS-PAGE Warum Entsalzen? Bei der Proteinreinigung entstehen oft Lösungen, die in ihrer Ionenstärke oder Pufferzusammensetzung für den nächsten Reinigungsschritt ungeeignet sind, daher ist Abtrennung von Salzen und hydrophilen Verunreinigungen nötig  Isolierung von Proteinen  > 25.000 Proteine in höheren Organismen, auch bei sequenzierten Organismen sind immer noch über ihre biologische Aktivität definiert  Eigenschaften wie Größe, Löslichkeit, (Oberflächen-)Ladung und spezifische Bindungsaktivität werden zur Reinigung eines Proteins in seiner aktiven Form benutzt  Für die Charakterisierung werden einige mg gereinigtes Protein benötigt  Dialyse: Trennung der Proteine von kleineren Molekülen (Lösungsaustausch)  Gelchromatographie: spezifische Trennung aufgrund der Größe - Die Ionenaustauschchromatographie trennt Proteine nach ihrer Nettoladung. - Die Affinitätschromatographie nutzt die Affinität von Proteinen zu bestimmten chemischen Gruppen oder Liganden für die Auftrennung. Isolierung von Protein – Reinigungsschritte Protein Rohextrakt Vorfraktionieren (partielle Fällung „Aussalzen“, Solubilisierung, Organelle-Isolierung) Protein Fraktion 1 Pufferaustausch (Dialyse,..) Protein Fraktion 2 Reinigungsschritt 1 (Ausschluss-, Ionenaustausch-, Affinitätschromatographie) Reinigungsschritt 2 Reinigungsschritt n gereinigtes Protein  Dialyse  Eine am weitesten verbreitete Entsalzungs- methode ist die Dialyse.  Das Prinzip beruht auf dem Größenausschlussprinzip (size exclusion) einer semipermeablen Membran: kleine Moleküle und Ionen diffundieren frei hindurch, größere Moleküle werden zurückgehalten  Semipermeable Membranen haben unterschiedliche Porengrößen (Molekulargewichtsgrenzwert oder molecular weight cut off value, MWCO). Molekulargewichtsgrenzwert = Molekulargewicht der Proteine, die zu 90% von der Membran ausgeschlossen werden. Dialyse – Biophysikalische Prozesse bei der Dialyse  Diffusion Diffusionsfluss der gelösten Teilchen 𝑥 =− ( / ) mit D als Diffusionskoeffizient (m2 s -1), A ist die Querschnittsfläche und 𝜕𝑐/𝜕𝑥 ist der Konzentrationsgradient in x-Richtung (1. Ficksche Gesetz) = / = /6 η mit f: Reibungskoeffizient, η: Viskosität, r: Radius, k: Boltzmannkonstante, T: Temperatur  Osmose Diffusion der Lösungsmittelteilchen (z.B. Wasser) durch eine semipermeable Membran entlang eines Konzentrationsgradienten des Lösungsmittels  Dialyse Austausch von Puffersubstanzen an einer semipermeablen Membran Dialyse – Biophysikalische Prozesse bei der Dialyse Dialyse – Wahl des richtigen Molekulargewichtsgrenzwerts (MWCO) Da die Dialysemembran aus einer schwammförmigen Matrix von vernetzten Polymeren bestehen, ist die Trenngrenze, die als Molekulargewichtsgrenzwert (MWCO) bezeichnet wird, ein indirektes Maß für die Retentionsleistung. Genauer gesagt, der Molekulargewichtsgrenzwert der Membran wird als Partikelgröße bestimmt, bei der noch mindestens 90 % der Partikel zurückgehalten werden. Da die Durchlässigkeit eines gelösten Stoffes jedoch auch von der Molekülform, dem Grad der Hydratation, der Ionenladung und der Polarität abhängt, ist es ratsam einen Molekulargewichtsgrenzwert zu wählen, der Beispiel einer Membran mit MWCO = 10 kDa die Hälfte des Molekulargewichts des zurückzuhaltenden Stoffes und/oder das Doppelte des Molekulargewichts des Stoffes beträgt, der die Membran passieren soll. Dialyse - Wahl des richtigen Membranmaterials Die Dialysemembran kann aus unterschiedlichen Materialien bestehen und sollte inert sein. D.h. die zu reinigen Proteine oder andere Substanzen dürfen nicht an die Membrane binden. Des weiteren muss der pH-Wert, die Lösungsmittelresistenz sowie der Temperaturbereich der Anwendung berücksichtigt werden. Merk - Millipore Dialyse - Biophysikalische Parameter der Proteine: Änderung des pH-Wertes und der Ionenkonzentration während der Dialyse beeinflusst die Oberflächenladung und die Reichweite der Ladung von Proteinen. Im ungünstigen Fall fallen Proteine aufgrund direkter hydrophober oder hydrophiler Wechselwirkung wieder aus!  Dialyse in der Praxis  Puffer wird gerührt und einige Male gewechselt, für möglichst großen Konzentrationsgradienten an der Membranoberfläche  Fortschritt der Entsalzung mittels Leitfähigkeitsmessung des Puffers überprüft.  Bei weitgehender Entsalzung (Dialyse gegen Wasser): wegen der niederen Ionenstärke können Proteine teilweise ausfallen.  Dialyse in der Praxis  Proteinlösung luftfrei in Schlauch aus Dialysemembran gefüllt, mit Klammern verschlossen, von Puffer umgeben.  Schlauch zu maximal zwei Drittel befüllen, da es zu einer Volumenzunahme während der Dialyse kommt. WARUM?  Diffusionsrate durch die Membran wir durch den Konzentrazionsgradienten der diffundierbaren Teilchen, die Membranoberfläche, und die Temperatur bestimmt Dialysemembran Puffer Konzentrierte Lösung Dialyse in der Praxis Chromatographie  Trennmethode: die Komponenten einer Molekülmischung aufgrund ihrer unterschiedlichen Eigenschaften wie Löslichkeit, Größe, Ladung oder Funktion ungleich zwischen zwei Phasen verteilen  Mobile Phasen (Laufmittel): Gase oder Flüssigkeiten (Gaschromatographie (GC) oder Flüssigkeitschromatographie (LC))  Stationäre Phasen: Flüssigkeiten oder Festkörper  Trennprinzip: unterschiedlich starke Wechselwirkungen der Teilchen zwischen den Komponenten der mobilen und stationären Phase  Zu trennende Substazmischung = Analyt  Unveränderte Lösungsmittelzusammensetzung der mobilen Phase während der Trennung: isokratischer Trennung  Änderung des Lösungsmittelgemisches (pH oder Salzgehalt) im Verlauf der Elution: Gradiententrennung Säulenchromatographie  Ein poröser Feststoff (die stationäre Phase) ist in eine Säule gepackt  Durch die Stationäre Phase fließt eine Lösung (die mobile Phase)  Die Proteinmischung wird oben auf die Säule gegeben  Bei der Wanderung durch die Säule werden die Proteine von der Mischung durch ihre unterschiedlichen Wechselwirkungen mit dem Füllmaterial unterschiedlich lange festgehalten Chromatographie Säulenchromatographie. Die Bestandteile einer Chromatographiesäule. Als Füllmaterial wird ein poröser Feststoff (die Matrix) in eine Säule gepackt, die im Allgemeinen aus Kunststoff oder Glas besteht. Durch die Matrix, die stationäre Phase, fließt dann eine Lösung, die mobile Phase. Die Lösung, welche die Säule am unteren Ende verlässt (das Eluat), wird kontinuierlich durch Lösung aus dem Behälter im oberen Teil ersetzt. Das zu trennende Proteingemisch wird oben auf die Säule gegeben und wandert in das Füllmaterial. Von oben wird weitere Lösung zugegeben. Das Proteingemisch bildet in der mobilen Phase eine Bande, deren Breite am Anfang der Höhe der auf die Säule aufgetragenen Proteinlösung entspricht. Bei der Wanderung durch die Säule werden die Proteine durch ihre unterschiedlichen Wechselwirkungen mit dem Füllmaterial unterschiedlich lange festgehalten. Die Proteinbande weitet sich somit während der Wanderung durch die Säule aus. Nach und nach trennen sich einzelne Proteinarten, wie z. B. A (blau), B (rot) und C (grün), voneinander und bilden Zonen innerhalb der breiteren Proteinbande. Mit zunehmender Länge der Säule verbessert sich die Trennung, weil sich die Auflösung erhöht. Die einzelnen Proteinzonen verbreitern sich jedoch mit der Zeit aufgrund von Diffusion; damit nimmt die Auflösung wieder ab. In diesem Beispiel ist das Protein A gut von B und C getrennt, die diffusionsbedingte Verbreiterung verhindert jedoch die vollständige Trennung der Banden B und C unter den vorliegenden Bedingungen  Gelfiltrationschromatographie  Auftrennung der Proteine nach Größe  Probe auf eine Säule aus porösen Kügelchen (stationäre Phase) aufgetragen  Kleine Moleküle können in die Kügelchen eindringen, große nicht. Kleine Moleküle verteilen sich in der wässrigen Lösung innerhalb der Kügelchen und zwischen ihnen, große Moleküle nur dazwischen  Große Moleküle passieren die Säule schneller und verlassen sie zuerst, weil ihnen nur ein kleines Volumen zugänglich ist.  Chromatographie – Stationäre Phase  Gepackte Trennsäule: Metall- Kunststoff- oder Glasrohr mit Füllmaterial, das aus Partikeln von einheitlicher Größe besteht  poröse Partikel: ermöglichen das Eindringen von Molekülen des Substanzgemisches. Die Partikelporen vergrößern das Volumen für kleinere Moleküle. Zusätzlich stehen die äußeren und inneren Oberflächen des Füllmaterials für Wechselwirkungen mit den Analyten zur Verfügung  Partikeldurchmesser von 3 -100 µm mit einer Porenweite von 10 -100 nm  je kleiner der Durchmesser der Partikel, desto besser die Auflösung, aber desto höher der Druck  Trägermaterialien sind: Biopolymere (Cellulose, Dextran, Agarose), synthetische Polymere (Polyacrylamid, Methacrylat, Polyvinylbenzol/ Polystyrol) oder anorganische Polymere (Kieselsäure, Hydroxyapatit, Silica) Lehninger, Biochemie Chromatographie - Theorie Prinzip der Größenausschlusschromatographie  Nach Probenauftrag wandern die unterschiedlichen Komponenten als Banden in Abhängigkeit von der Elutionsmethode mit unterschiedlicher Geschwindigkeit durch die Säule  Das Ausschlussvolumen (V0) entspricht dem Volumen des Raums zwischen den Partikeln  Das innere Volumen (Vi) entspricht dem Volumen der Poren in den Partikeln  Das Gesamtvolumen (Vt) ist demnach V0 + Vi  Detektion beim Austritt  Dokumentation im Chromatogramm: die eluierten Komponenten werden als Peak gegen die Zeit oder das Elutionsvolumen aufgezeichnet  Optimale Bedingungen erzeugen schlanke, symmetrische Proteinpeaks Prinzip der Größenausschlusschromatographie Kleine Moleküle dringen in wäßrige Hohlräume in den Kügelchen ein Kügelchen aus Kohlenhydratpolymer Große Moleküle können nicht in die Kügelchen eindringen Trennung von 3 Proteinen unterschiedlicher Größe mit Hilfe der Gelfiltrationschormatographie. Große Proteine verlassen das Trennmedium früher als kleine, da sie nicht in den Innenraum der Kügelchen eindringen können. Stryer, Biochemie  Ionenaustauschchromatographie  Trennung der Proteine aufgrund ihrer Nettoladung  Oft erster Schritt einer Proteinreinigung  Grundlage ist kompetitive Wechselwirkung geladener Ionen: Probenmolekül konkurriert mit Salz-Ionen um geladene Positionen auf einer Ionenaustauscher-Matrix  Zuerst bindet das Molekül an die fixierten Ladungen der stationären Phase, dann folgt Verdrängung und Eluition des Proteins durch steigende Salzkonzentration des Eluenten Anionenaustauscher: Negativ geladene anionische Proteine werden in Säulen mit positiv geladenen funktionellen Gruppen zB Diethylaminoethyl (DEAE) getrennt. Kationenaustauscher: Positiv geladene (kationische) Proteine werden mit Hilfe von negativ geladenen Gruppen zB Carboxymethyl (CM), abgetrennt. Affinitätschromatographie – trennt Proteine nach ihren Bindungseigenschaften auf  Nutzt die hohe Affinität vieler Proteine zu bestimmten chemischen Gruppen.  Man kann z.B. das pflanzliche Protein Concanavalin A über die Säule reinigen, die kovalent gebundene Glucosereste enthält. Con A besitzt im Gegensatz zu den meisten Proteinen eine Affinität zu Glucose.  Durch Zugabe einer konzentrierte Glucoselösung kann das gebundene Con A von der Säule eluiert werden. Die Glucosemoleküle in der Lösung verdrängen die säulenfixierten Glucosereste von den Bindungstellen auf dem Con A.  Diese Technik besitzt eine geringe Trennkapazität, aber eine extrem hohe Selektivität, da in einem Schritt aus einer komplexen Mischung ein einzelnes Protein isoliert werden kann.  Leitfähigkeit  Bei steigender Konzentration nimmt die Leitfähigkeit linear zu. Ab einer gewissen Konzentration beginnt die Leitfähigkeit bei steigender Konzentration langsamer anzusteigen, stagniert dann, um bei weiterer Erhöhung sogar abzunehmen. Bei konzentrierten Salzlösungen nimmt die Beweglichkeit der Ionen ab. Sie können sich nicht mehr unabhängig voneinander bewegen, da sie sich Wassermolekülen aus den Hydrathüllen anderer Ionen teilen. Im linearen Bereich ist es aber möglich, von der elektrischen Leitfähigkeit auf die Konzentration zu schließen Die Leitfähigkeit einer wässrigen Lösung ist abhängig von der Konzentration, der Ionenladung und der Beweglichkeit der Ionen. Leitfähigkeit Elektrische Leitfähigkeit von Lösungen: Praktikum Probe von Proteine-Teil I: Kälberserum (Ausfällen der Proteine mittels Ammoniumsulfats). Große Mengen an Ammoniumsulfat würden bei SDS- PAGE stören. a. Entsalzen einer Proteinlösung (Pellet aus AS-Fällung) mittels Dialyse b. Entsalzen einer Proteinlösung (Überstand aus AS-Fällung) mittels Gelchromatographie c. Messung der Leitfähigkeit (Salzkonzentration) vor und nach Entsalzung d. Bestimmung der Proteinkonzentration der Fraktionen der Gelchromatographie sowie des Dialysats, Pellet und Überstand mittels Bradford-Färbereaktion A. DIALYSE  200 µl der Probe (Pellet aus AS-Fällung) in Dialysekapsel pipettieren  Dialysemembran vorsichtig zwischen Deckel und Kapsel klemmen  Kapsel in Becherglas mit destilliertem Wasser geben  Dialyse erfolgt unter ständigem Rühren mittels Magnetrührer  Bestimmen der Proteinkonzentration und der Leitfähigkeit der Probe nach der Dialyse  Die entsalzte Probe wird für den nächsten Übungsteil eingefroren Wichtig: Unbedingt mit der Dialyse beginnen! Das dauert 2/3 Stunden B. GELCHROMATOGRAPHIE  Fertig gepackte NAP-5 Säulchen  Gefüllt mit Sephadex G-25 (Polydextran)  Ausschlussgröße von 10kD, entspricht der Dialysemembran B. GELCHROMATOGRAPHIE  100 µl der Proteinlösung (Überstand) auf die Säule  Eluat in Mikrotiterplatte (U-Form) aufgefangen (2 Tropfen pro Well, ca. 100µl)  Bestimmung der Protein- und Salzkonzentration der einzelnen Fraktionen  3 Fraktionen mit der höchsten Proteinkonzentration für das nächste Übungsbeispiel gefroren aufbewahrt C. LEITFÄHIGKEITSMESSUNG - Salzkonzentration  Ammoniumsulfat Eichgerade  Wir schließen von der elektrischen Leitfähigkeit (µS) auf die Ionenkonzentration (mmol/l): Messen der Leitfähigkeit des Pellet, des Überstand, der 24 Fraktionen, des Dialysats. D. PROTEINBESTIMMUNG  BSA Eichgerade zum Umrechnen der Absorption-Werte in mg/ml  Proteinkonzentration der Fraktionen aus der Säulenchromatographie, des Pellet, des Übestand und des Dialysats mittels Bradford-Assay bestimmt SALZGEHALT RECHNEN  Wir kennen jetzt von unseren Proben die Proteinkonzentration in mg/ml und die Salzkonzentration in mM (= mmol/l oder µmol/ml)  Das Molekulargewicht von Ammoniumsulfat beträgt 132.14 g/mol, dh. eine Ammoniumsulfatkonzentration von 1 µmol/ml entspricht 132.14 µg/ml  Daraus berechnen wir den Salzgehalt der Proben in µgSalz pro mgProtein SALZGEHALT RECHNEN Beispiel