Nanotechnologia Wykład 9 PDF

Wykład 9 Nanotechnologia Projektuje, otrzymuje i stosuje technologie w skali nano (co najmniej 1 wymiar od 1 do 100nm) Metody wytwarzania nanostruktur: - TOP-DOWN: materiały istniejące -> rozdrabnianie, siły mechaniczne, emulgacja, ultradźwięki, mikrofluidyz...

Wykład 9 Nanotechnologia Projektuje, otrzymuje i stosuje technologie w skali nano (co najmniej 1 wymiar od 1 do 100nm) Metody wytwarzania nanostruktur: - TOP-DOWN: materiały istniejące -> rozdrabnianie, siły mechaniczne, emulgacja, ultradźwięki, mikrofluidyzacja (dynamiczna zawiesina) -> produkty I generacji - BOTTOM-UP: atomy -> Procesy chemiczne: strącanie, nanoszenie reagentów, synteza w war. Hydrotermalnych, hydroliza i kondensacja reagentów, kondensacje w fazie ciekłej lub gazowej -> agregacja -> nanokrystalit (powstaje w układzie ciało stałe-gaz, ciało stałe-ciecz, całoobjętościowa przemiana fazowa) -> produkty II generacji Metoda wpływa na właściwości nanomateriału Nanocząstki w medycynie Nośniki leków np. przeciwnowotworowych (chemioterapia, radioterapia, terapia fotodynamiczna, termiczna). Przykłady: - Liposomy – dwuwarstwa lipidowa otaczająca lek w wodzie, często otoczony biopolimerem (wzrost biodostępności i farmakokinetyki). Ze stałych lipidów, nietoksyczna alternatywa dla stosowanych aktualnie metod. Działanie uwalniania: np. rozpad przez niskie pH mikrośrodowiska nowotworu. Nowotwory piersi, jajnika, szpiczak mnogi, mięsak Kaposiego. Przykład leku: cytostatyczny antybiotyk doksorubicyna (mięsaki tkanek miękkich, z tkanek kostnych, chłoniaki, ostra białaczka limfoblastyczna, szpikowa, rak tarczycy, piersi, jajnika) - Nanoczastki polimerowe – zwiększają wydajność transportu do docelowych komórek -> spadek toksyczności. Przenikają przez błony. Lek jest stabilniejszy, jest dłużej w krążeniu. Np. paklitaksel – polimer kwasu glutaminowego (niedrobnokomórkowy rak płuca, rak jajnika). Mogą opłaszczać liposomy, dendrymery, nieorganiczne makrocząstki (np. glikol polietylenowy -> ochrona nanocząstki przed usunięciem -> przekroczenie barier biologicznych). Leki zamykane przez enkapsulację (fizyczne), połączenie kowalencyjne (chemiczne). Wysoka stabilność, biokompatybilność. Rozpuszcza się w nich słabo rozpuszczalne leki - Micele polimeryczne – amfifilowe kuliste struktury z hydrofobowego rdzenia (rezerwuar leku) i hydrofilowej otoczki (stabilizuje rdzeń, nadaje im rozpuszczalność w wodzie). Cechy, działanie i zamykanie leków podobne jak w nanoczastkach polimerowych - Nanorurki węglowe – otwarte lub zamknięte cylindry, jednowarstwowe lub wielowarstwowe, zygzakowate, skrętne etc.. Ciała stałe, mała gęstość. Wytwarzane przez powolną kondensację par atomów węgla. Warstwy grafenowe -> cylindry. Przenikają przez błony, przenoszą małe czastki lub biologiczne makrocząstki. Lek łączy się z nimi wiązaniami kowalencyjnymi (np. baksytaksel), niekowalencyjną adsorpcją (np. doksorubicyna). Wydłużają czas krążenia kompleksu -> wzrost kumulacji w obszarze guza -> sukces. - Dendrymery – trójwymiarowe polimery, kuliste, struktura z rdzeniem, wnętrzem i powierzchnią. Giętkie, zmienny kształt i rozmiar. Leki zwykle umieszczane we wnętrzu (enkapsulacja – wiązania wodorowe, kompleksacja – wiązania kowalencyjne). Na powierzchni aktywne grupy terminalne – przyłączanie receptorów, ligandów, czasem też leków, można je modyfikować (zmiana właściwości i aktywności). Np. poliamidoaminowe, polipropylenoiminowe, karbokrzemowe. Efekt dendrymeryczny – właściwości zmieniane w zależności od budowy, dodatnie lub ujemne (wzmocnienie lub osłabienie), np. wzmocnienie przez wzrost ilości grup terminalnych. Zmniejszają toksyczność leku, zwiększają jego rozpuszczalność i biodostępność. Powinny mieć duże powinowactwo do struktur, być nietoksyczne, nieimmunogenne, przekraczać bariery biologiczne, mieć odpowiedni czas półtrwania. Np. polimer poliamidoaminowy z kamptotecyną (inhibitor topoizomerazy-1) -> wzrost rozpuszczalności, podwyższenie aktywności przeciwnowotworowej (ale duże działanie niepożądane), polimer z topotekanem -> leczenie raka płuc i raka jajnika. Dendrymery a terapia antybakteryjna Np. dendrymery poliaminoamidowe z sulfametoksazolem (enkapsulowany) -> wzrost aktywności antybakteryjnej i rozpuszczalności w wodzie Same dendrymery szkodzą bakteriom. Ujemna błona -> wypieranie dodatnich jonów przez dendrymer i łączenie się z błoną -> wzrost przepuszczalności błony -> wyciek K+, dezintegracja błony - > śmierć. Typy transportu nanocząsteczek - Pasywne dostarczanie leków – przez nanocząstki w krwiobiegu, wnikają do nowotworów przez bierną dyfuzję (zwiększona przepuszczalność i retencja ER komórek; nowe, słabo zróżnicowane naczynia ze złymi rozgałęzieniami i szczelinami). Rozmiar musi być odpowiedni (by nie były wchłaniane przez fagocyty), muszą być hydrofilowe (np. powłoki z glikolu polietylenowego) (ułatwianie wchłaniania). Np. związki z liposomach niestabilne w niskim, charakterystycznym dla guza pH. - Aktywne dostarczanie leków – nanocząstki opłaszczone ligandami (rozpoznawanymi przez receptory) lub cząsteczkami z komórek (np. nowotworowych). Ligand + receptor -> endocytoza do komórki nowotworowej -> ukierunkowane dostarczanie chemioterapeutyku -> wzrost skuteczności terapii, spadek cytotoksyczności dla prawidłowych komórek. Można je ufunkcjonalnić np. łącząc z przeciwciałami -> duże powinowactwo do komórek docelowych -> zwiększenie wychwytu nanocząstek (kompleksy lektyna-węglowodan, ligand-receptor (umożliwia ominięcie oporności na leki), przeciwciało-antygen). Np. nanokoniugat kwas foliowy+metotreksat (selektywna cytotoksyczność przeciw kom. z nadekspresją receptorów kwasu foliowego (rak jajnika, endometrium, piersi, jelita grubego, płuca), nanocząstki opłaszczone przeciwciałami przeciw receptorowi ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) (rak piersi, często ma ich nadekspresję), nanocząstki opłaszczone przeciwciałami przeciw receptorowi swoistego antygenu gruczołu krokowego (PSA) (rak prostaty). Lektyny – nieimmunologiczne białka rozpoznające i wiążące się z glikoproteinami na powierzchni komórek. Używane jako ugrupowania kierujące lek do docelowej powierzchni komórki. Nanodiagnostyka – kropki kwantowe Małe, koloidalne, półprzewodnikowe kryształy. Średnica 1-100nm. Wiązane są nośniki ładunków np. elektrony. Z rdzenia (związki nieorganiczne, z pierwiastków grup II-IV, II-V, IV-VI, np. CdS, CdSe, CdTe, InP3, TiO2, ZnS) otoczone warstwą ZnS, polimerem lub mieszaniną polimerów. Znaczniki fluorescencyjne – pochłaniają fotony -> fluorescencja zależna od wielkości kropki. Jedna wiązka + różne wielkości kropek = różne barwy (niebieski do czerwonego). Są fotostabilne. Małe kropki -> wysoki stosunek powierzchnia-objętość. Większy rozmiar -> więcej atomów na powierzchni. Stabilniejsze niż dotychczasowe znaczniki, można obrazować kilka struktur naraz. Wykorzystywane in vitro (wiele markerów jednocześnie) (najczęściej selenek kadmu) i in vivo. Niewielki rozmiar -> swobodne krążenie i łączenie z cząstkami transportowymi, np. modyfikowane glikolem polietylenowym -> obrazowanie układu limfatycznego. Można łączyć kropki tkankowe z przeciwciałami -> rozpoznanie i obrazowanie antygenów na komórkach nowotworowych. Można je też połączyć z leków -> transport leków + obrazowanie. Przykład: podanie kropek z przeciwciałami pacjentowi onkologicznemu -> kropki łączą się z komórkami nowotworowymi -> dokładna lokalizacja nowotworu -> wdrożenie terapii celowanej. Stosowane razem z rezonansem magnetycznym – większy kontrast, np. tlenek żelaza, złota, kobaltu. Także znakowanie DNA (wykrywanie wirusów), przeciwciał, wykrywanie pierwotniaków (Cryptosporidium parvum, Giardia spp., Lamblia spp.), detekcja drobnoustrojów i obrazowanie bakterii chorobotwórczych (kropki znakowane związkami w ścianie kom. i żelazem) Terapia przeciwnowotworowa Nanocząstki miedzi – toksyczne dla nowotworów. Tlenek miedzi hamuje proliferację nowotworów (czerniak, rak szyjki macicy). Gromadzenie w lizosomach, fagosomach i ich niszczenie, zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G0/G1, indukcja apoptozy, nekroptoza (z charakterystycznym obrzękiem jądra, zaprogramowana śmierć z odpowiedzią zapalną), nekroza (rozpad błony, chromatyny jądrowej, wakuolizacja cytoplazmy, niezaprogramowana śmierć z odpowiedzią zapalną), katastrofa mitotyczna (multinukleacja jądra komórkowego). Nanocząstki złota – przez absorpcję promieniowania X jako wspomaganie radioterapii -> mniejsze dawki promieniowania -> ochrona zdrowych tkanek. Połączenie nanocząstek z glikolem polietylenowym (PEG) zapobiega wychwytowi przez fagocyty. Dendrymer z kamptotecyną – lepszy dostęp do kom. nowotworowej, dłuższy czas retencji, wyższa aktywność leku. Dendrymer z topotekanem – interkalacja między zasady azotowe przy replikacji -> zahamowanie replikacji DNA. Tworzy kompleksy DNA-topotekan -> odtworzenie wiązań przy pęknięciach niemożliwe -> uszkodzone łańcuchy DNA -> komórka niezdolna do replikacji -> śmierć. Doxil – doksorubicyna w liposomie. Wchodzi w kompleks z helisą DNA -> uniemożliwiony podział -> śmierć. Paclitaxel – związany z nanocząsteczkami albuminy (polepszenie słabej rozpuszczalności w wodzie, dostępności, retencji) (rak jajnika, piersi, drobnokomórkowy rak płuca). Hamuje podziały komórkowe – wiązanie z białkami mikrotubul wrzeciona kariokinetycznego -> zatrzymanie mitozy -> nieprawidłowe mikrotubule -> śmierć. Należy do taksanów. Efektywny przeciw komórkom szybko dzielącym się.  Zastosowanie nanorurek węglowych Dobre właściwości fizyczne i elektryczne. Wytrzymałe (dzięki silnym wiązaniom chemicznym), odporne na czynniki chemiczne i fizyczne. Terapia fotodynamiczna – nanorurka z fotouczulaczem -> gromadzenie w chorobowo zmienionych tkankach -> naświetlanie (światło bliskie podczerwieni) -> wzbudzenie fotouczulacza -> RFT -> apoptoza/nekroza. Umożliwiają (razem z dendrymerami i innymi) dobranie (zwiększenie) rozmiaru -> wzrost selektywności względem komórek nowotworowych -> wzrost efektywności terapii, spadek szkodliwości dla zdrowych tkanek. Nanorurki używane przez ich wytrzymałość na różne czynniki. Terapia fototermiczna – w tym przypadku wypadkowa terapii fotodynamicznej, wykorzystuje wzrost temperatury po naświetlaniu Medycyna regeneracyjna – rusztowania (skafoldy). Kompozyt z polilaktydem lub same nanorurki-> proliferacja osteoblastów, wzrost aksonów, regeneracja komórek Schwanna, mięśnia sercowego Transport leków – np. amfoterycyna b, cis-platyna, doksorubicyna, karboplatyna. Można je wypełnić lekiem, modyfikować ich zewnętrzne ściany. Rak piersi, nowotwór pęcherza moczowego. Nanocząstki w termoterapii Hipertermia – wzrost temperatury w komórce do 42-46oC uwrażliwia na terapię. Termoablacja – wzrost temperatury w komórce do 51-55oC zabija komórkę. Używana przy złośliwych zmianach wątroby. Używane cząsteczki nanozłota. Termoterapia łączona często z magnetoterapią, np.: - Wprowadzenie sprzężonych z lekiem/ligandem nanocząsteczek żelaza -> wprowadzenie do kom. docelowych za pomocą pola magnetycznego -> dostarczanie leku, źródło ciepła w termoterapii, w hipertermii magnetycznej przeciw nowotworom (jeśli opłaszczone ligandami) - Nanocząstki złota + dendrymery -> wprowadzenie do kom. nowotworowych -> terapia hipertermiczna Leczenie antywirusowe z użyciem dendrymerów Blokują receptory na powierzchni wirusa (np. u HIV odpowiedzialne za adhezję do limfocytów T) -> utrata potencjału zakaźnego Zmodyfikowane dendrymery -> wiązanie się z białkami powierzchniowymi -> działanie wirusobójcze (np. VivaGel przeciw HIV, leczenie HSV) Nanotoksykologia Badanie toksycznego działania nanostruktur na poziomie komórkowym, tkankowym i ogólnoustrojowym. Ich znajomość umożliwia redukcję efektów ubocznych, by np. chronić komórki przed potencjalnym szkodliwym wpływem (ochrona komórek hipokampa przed nanocząstkami tlenku miedzi, wykorzystanie ekspresji Sirt3 w naprawie uszkodzeń po nanoditlenku tytanu w kościach) Nanocząstki łatwo wnikają wszędzie. Np. srebro, tytan, miedź, cynk -> wzrost reaktywnych form tlenu i azotu -> naruszenie bariery antyoksydacyjnej na poziomie białka i mRNA -> śmierć komórki Efekt toksyczny nanocząstek zależy od właściwości fizykochemicznych, rozmiaru, kształtu, funkcjonalizacji, stężenia, czasu inkubacji, rodzaju eksponowanych komórek. Niewielka zmiana -> zmiana mechanizmu działania -> poprawa biokompatybilności. Np. funkcjonalizacja nanocząstek złota glikolem polietylenowym -> biokompatybilność względem płytek krwi Inżynieria komórkowa Hodowle 2D – zniekształcone, uproszczone interakcje, uproszczona macierz zewnątrzkomórkowa, statyczne warunki. Ograniczony potencjał badawczy Hodowle 3D – Np. agregaty, sferoidy, proste kokultury, hodowle na scaffoldach, hodowle organotypowe i narządowe. mogą obejmować więcej niż 1 typ komórek -> naśladowanie tkanek. Odtworzone przestrzenne kontakty między komórkami i układ typów komórek w tkance. Komunikacja zazwyczaj z wieloma typami komórek, a nie tylko między sobą. Badanie biologii komórek, oddziaływań międzykomórkowych, różnicowania, toksyczności substancji, skuteczności leków. System lab-on-a-chip (LOC) – mikroukłady przepływowe, systemy 3D i 2D pozwalające na precyzyjne umieszczenie kilku typów komórek w układzie i obserwację wzajemnych interakcji. Najczęściej wykorzystywane narzędzie w inżynierii komórkowej. Inżynieria tkankowa Tkankowy produkt inżynieryjny (TIP) – bioimplant wszczepiany do żywego organizmu w ubytkach. Komórki przez różnicowanie tworzą nową tkankę, a rusztowanie jest degradowane. Kokultury organotypowe Organoidy Hodowle narządowe i tkankowe (HOC) – w makro-, mikro- lub nanoskali. Mikrofluidowe systemy hodowli (automatyczna hodowla w mikroskali na porowatych membranach lub żelach (chipach mikrofluidowych)). Stosowane biodegradowalne nanomateriały na bazie poliestrów, szybkość absorpcji powinna współgrać z tempem odnowy danej tkanki. Porowatość i wielkość otworów -> przestrzeń życiowa dla komórek -> integralność narządu. Np. chip tkanki serca (regeneracja serca po zawale), chip płuca (prototyp do badań mechaniki tkanki płuc) Mikrosystem przepływowy 2D Ma mikrokanały, w nich pary komór hodowlanych. Każda połączona ze sobą poprzecznymi mikrokanałami (dyfuzja medium, migracja komórek). Do analizy cytotoksyczności związków inkubowanych z komórkami pojedynczo lub w kombinacjach. Tworzone z polimetakrylanu etylu (płytka z siecią mikrokanałów) i szkła (macierz z mikrokomorami), struktury w obu mają się ze sobą pokrywać. Obecny też generator gradientu stężeń. Do analizy żywotności komórek, np. nowotworowych po ekspozycji na związki o różnych stężeniach, migracji komórek. Mikrosystemy przepływowe lab-on-a-chip (LOC) Mikrośrodowisko bardziej zbliżone do warunków ustroju. Redukcja zużywanych reagentów, materiału biologicznego, możliwość sterowania stężeniami badanych związków, substancji odżywczych, badania wielu związków naraz. Komórki proliferujące w mikrosystemach przepływowych (komory+kanały) pod ciągłym działaniem przepływu reagentów (badania dynamiczne). Używane szkło i materiały polimerowe modyfikowane np. białkiem z macierzy zewnątrzkomórkowej (kolagen, fibronektyna) -> podłoża sztuczne, naturalne, mieszane. Powstawanie: najczęściej metoda replikacyjna (pieczątki/matryce odzwierciedlające strukturę mikrosystemu -> wylewanie mieszaniny nieusieciowanego polimeru -> utwardzenie i oddzielenie od pieczątki). Umożliwiają analizę stresu hydrodynamicznego (wpływ ciągłych naprężeń ścinających podczas przepływu reagentów -> zmiany przepuszczalności, fragmentacja i przerwanie błony -> wpływ na morfologię, żywotność i proliferację) naśladującego przepływ płynów w organizmie. Monitorowana objętość hodowli. Istotne w badaniu leków i ich różnorodnego wpływu na komórki, w tym nowotworowe. Agregaty (pierwsze modele 3D) Złożone z jednego lub kilku typów komórek, wydzielają macierz zewnątrzkomórkową (w tym kolagen utrzymujący integralność agregatu), połączenia międzykomórkowe – przypominają tkankę. Śr. od 250 do 500 mikrometrów. Otrzymywanie: zawiesina w butelce hodowlanej -> wolna rotacja w łaźni wodnej -> odstawienie. Sedymentacja komórek -> agregaty na dnie -> przeniesienie do hodowli Agregaty żyją dłużej w stanie zróżnicowania niż pojedyncze warstwy. Przydatne w hodowli komórek wysoce zróżnicowanych, z krótką aktywnością biologiczną (komórki guzów nowotworowych (wpływu substancji na nie, stopnia inwazyjności, apoptozy), komórki nerwowe (rozwój ch. Alzheimera, Parkinsowa, nowotworów mózgu). Dzięki agregatom kom. macierzystych neuroepitelialnych wykazano np., że na neurogenezę duży wpływ ma środowisko macierzy zewnątrzkomórkowej. Wyniki sprawdzane poprzez oznaczanie markerów neurogenezy w hodowli metodą immunocytochemiczną. Sferoidy Agregat przekracza 500 mikrometrów -> agregacja (dzięki integrynom) -> polaryzacja (przez zbijanie się dzięki E-kadherynie) -> różnicowanie -> odtworzenie swoistych połączeń (desmosomy, strefy przylegania, szlaki komunikacyjne) i mikrośrodowiska -> sferoid z fenotypem charakterystycznym dla tkanki + adaptacje do warunków in vitro. Komórki nie przeżyją we wnętrzu sferoidu większego niż 500 mikrometrów. To samoograniczające się skupiska powstające przy niemożności przyczepienia się do podłoża i dominacji oddziaływań komórka-komórka. Nie są kolonią, nie powstają przez podział pojedynczych komórek. Może odtwarzać niszę macierzystych komórek nowotworowych. Otrzymywanie: hodowla metodą wiszącej kropli (grawitacyjne opadanie na dół), naczynia rotacyjne (symulowanie mikrograwitacji). Badania nad nowotworami (przeżywalność komórek, przerzutowanie, migracja pod wpływem leków, farmakodynamika leków, nowotworowe komórki macierzyste, karcynogeneza, oddziaływania kom. nowotworowa-kom. prawidłowa) Sferoidy nowotworowe wykazują cechy podobne do nowotworów in vivo – kom. o zróżnicowanym fenotypie w różnych miejscach cyklu komórkowego (spoczynkowe (przy obszarach centralnych), proliferujące (głównie 3-5 zewnętrznych warstw), martwicze (głównie w środku), jak w guzie), podobne oddziaływania kom.-kom., aktywizacja podobnych szlaków sygnałowych, zbliżona ekspresja genów, reagują na podobne substancje przeciwnowotworowe i dawki promieniowania. Sferoidy robi się też z komórek endokrynnych – badania czynności wydzielniczej; komórek ze zróżnicowanych linii komórkowych – badania regeneracji narządów. Kokultury komórkowe Jednoczesna hodowla dwóch lub więcej typów komórek. Przedłuża żywotność i poprawia funkcjonowanie komórek zróżnicowanych – przeciwdziałanie utracie właściwości przez brak stymulacji przez inne komórki. Podział kokultur ze względu na oddziaływania międzykomórkowe: - Bezpośrednia – zapewniony kontakt bezpośredni ze sobą - Pośrednia – inserty (kontakt jedynie przez substancje rozpuszczane w medium hodowlanym) i biomateriały (oddzielają typy komórek) Przykład: Kokultura hepatocytów – stosuje się kom. macierzyste, Browicza-Kupffera, fibroblasty, endotelialne, gwiaździste, epitelialne. Mają pozytywny wpływ na funkcjonowanie hepatocytów (proliferacja, żywotność). Wykorzystywane w terapii uszkodzeń wątroby (marskość, WZW-C, terapia wspomagająca w oczekiwaniu na przeszczep), badaniu hepatotoksyczności, toksyczności ogólnoustrojowej (np. na ekdotoksyny bakterii Gram(-) przy kokulturze z kom. Kupffera), bezpośrednim przeszczepie komórkowym hepatocytów (izolowane przez podwójną perfuzję z kolagenazą, podawane przez żyłę wrotną pompą perfuzyjną, do zachowania żywotności ok. 60% muszą być świeżo wyizolowane i przeszczepione w ciągu 48h). Hodowla i oddziaływanie terapeutyczne możliwe dzięki wydzielanym cytokinom, czynnikom wzrostu, hormonom. Skafoldy Trójwymiarowe, fizyczne podłoża do hodowli komórek. Budowane z bioresorbowalnych polimerów – implant. Pobranie komórek -> namnażanie w hodowli 2D -> wysianie na skafold -> wszczepienie do organizmu -> proliferacja komórek i integracja z komórkami biorcy -> bioresorpcja podłoża polimerowego Stosowane są kolagen, elastyna, kwas hialuronowy, poliakryd, mieszaniny polimerów naturalnych i sztucznych. Nie może być cytotoksyczny i ogólnie toksyczny, immunogenny, musi być biodegradowalny, powinny być bioresorbowalne, czas degradacji zgrany z regeneracją tkanki, wytrzymały mechanicznie, porowaty (migracja składników, metabolitów), struktura chemiczna i komórkowa umożliwiająca adhezję. Są nośnikami czynników wzrostu (zamykane w rusztowaniu, na rusztowaniu lub będące rusztowaniem), leków (przeciwzapalne, antybiotyki) – stopniowe uwalnianie związków do komórek. Wykorzystywane w medycynie regeneracyjnej (ubytki chrząstki, kości, urazy w ortopedii i traumatologii, regeneracja w chorobach zwyrodnieniowych), po operacjach przy przeciwdziałaniu stanom zapalnym, przy długotrwałej terapii. Najczęściej wykorzystywane: autologiczne chondrocyty lub membrany z osadzonymi włóknami kolagenowymi z hydroksyapatytem (odwzorowanie chrząstki)  Kokultury organotypowe Mają mieć jak najwięcej właściwości narządów, z których zostały wyprowadzone. Kluczowe utrzymanie ułożenia przestrzennego, polaryzacji (czynnościowej i morfologicznej) i kontaktu komórek z macierzą. Wydzielają substancje w ukierunkowany sposób. W hodowli obecne komórki różnego pochodzenia współdziałające ze sobą -> cechy narządu. Można stworzyć m.in. sztuczną skórę z komórek naskórka i skóry właściwej, trzustkę z kom. heterologicznych wysp trzustkowych. Badane są dzięki nim procesy fizjologiczne, biologia nowotworów (proliferacja, apoptoza, migracja komórek nowotworowych w pierwotnym mikrośrodowisku, wzrost i inwazyjność nowotworu, wrażliwość na leczenie). Kokultura organotypowa skóry Odtworzono keratynocyty z fibroblastami podścieliska. Użyto materiał z warstwy ziarnistej i podstawnej hodowane na macierzy kolagenowej. Wykorzystywana do testów na toksyczność, biozgodność, fototoksyczność czy przenikalność związków, badań procesów zapalnych w skórze. Dzięki niej wyjaśniono mechanizm komunikacji parakrynnej w/w komórek: keratynocyty -> IL-1 -> stymulacja dermatocytów -> czynnik wzrostu keratynocytów -> proliferacja keratynocytów. Sztuczna skóra Do oparzeń, ropni, rozległych uszkodzeń, martwicy, powikłań cukrzycy. Fibroblasty skóry właściwej -> namnażanie na podłożu z polimerami kwasu mlekowego lub żelami kolagenowymi -> hodowla w bioreaktorze ze stymulatorami wzrostu -> zamrożenie -> pokrycie warstwą keratynocytów -> implantacja w uszkodzone miejsce -> przyspieszenie gojenia się -> zastąpienie przez skórę chorego Przykłady: - Integra – matryca do regeneracji skóry właściwej + opatrunek – dwuwarstwowy system błon (usieciowane włókna kolagenu t. I ze ścięgien bydlęcych + warstwa silikonowa zapobiegająca wysychaniu rany). Umieszczona w ranie jest przerastana przez fibroblasty i indukuje angiogenezę. Ulega resorpcji. Tworzy się nowa skóra prawdziwa. - Dermagraft – używany w leczeniach uszkodzeń skóry u diabetyków Organoidy Komórki hodowlane w 3D środowiskach -> miniaturowe narządy (uproszczona budowa, zachowane funkcje fizjologiczne). Wykorzystuje się embrionalne komórki macierzyste, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub somatyczne komórki macierzyste. Nie mają różnorodności histologicznej i otaczającej tkanki. Wymagają wsparcia strukturalnego (ciągłość, właściwa orientacja wzrostu). Podatne na niekorzystne zmiany (mogą np. wyjść poza zasięg tlenu i składników odżywczych). Do badań biologii komórek macierzystych, mechanizmów pojawiania się mutacji (badania genomowe), podstawa do spersonalizowanych terapii, badanie toksyczności, ustalanie warunków terapii. Przykład: Organoid mózgu – wykorzystuje ciało embrionalne (układ komórek zdolnych do agregacji w sferyczne struktury). Inicjuje tworzenie ektodermy nerwowej, wewnętrzne tkanki nieneuronalne się nie rozwijają, neurony nie mają architektury takiej, jak normalnie. Daleko mu do normalnego mózgu. Hodowle narządowe (HOC) Badanie dynamicznych interakcji molekularnych w tkance z wysoką rozdzielczością przestrzenną. Wykorzystywana ocena genomiczna, proteomiczna, metaboliczna, mikroskopia konfokalna, mikroskopia elektronowa (lokalizacja komórkowa leku, aktywacja/inaktywacja związków, ocena ekspresji genów), testy immunohistochemiczne, Western-blot, RT-qPCR, hybrydyzacja in-situ. Procedura: Fragment tkanki -> analiza próbek -> usunięcie nadmiaru krwi -> przeniesienie na szalkę -> podział na małe fragmenty ( zanurzenie w odżywce do hodowli w sterylnych, 96-studzienkowych płytkach -> inkubacja w t. 37oC i 5% CO2 (zwykle krócej niż 24h) Wykorzystanie: Badania reakcji na mediatory (np. na cytokinę TGF-beta promującą włóknienie nerki) komórek macierzystych w naturalnych niszach (np. reakcje na cytokinę TGF-2 w komórkach macierzystych serca – dojrzewanie -> wykazano, że cytokina ta przyspiesza dojrzewanie kardiomiocytów), macierzystych komórek nowotworu (np. z raka nerki – aktywność kom. macierzystych przez ich związek z oceną ekspresji receptora TNF -> badanie cyklu proliferacyjnego, stymulację procesu nekroptozy) Komórki macierzyste (pnia) Nieśmiertelne i samoodnawialne (nieograniczona liczba podziałów), plastyczne (różnicują się do różnych typów komórek w odpowiednim mikrośrodowisku). To rezerwuar komórek o różnym stopniu zróżnicowania, rozwoju, potencjalności -> regeneracja narządów. W każdym organizmie przez całe życie powstaje ich dużo, potem dojrzewają, różnicują się, a po określonym czasie starzeją się i obumierają. Pozyskiwane z: szpiku, krwi pępowinowej, mezenchymy, tkanki tłuszczowej. Klasyfikacja komórek macierzystych Ze względu na pochodzenie: - Embrionalne – największy potencjał proliferacyjny (mogą zróżnicować się w każdy typ komórek) i różnicujący. Mogą tworzyć potworniaki i inne nowotwory, mieć problemy z immunokompatybilnością. Są to komórki wewnętrznej masy blastocysty. - Płodowe – komórki tkanek płodowych, komórki pępowinowe, łożyskowe, płynu owodniowego, komórki hematopoetyczne, komórki mezenchymalne. Te z krwi pępowinowej bardziej pierwotne, większy potencjał proliferacyjny, dłuższa przeżywalność (dłuższe telomery i więcej telomerazy) i mniejszy potencjał odrzucenia niż u tych ze szpiku. - Dorosłego człowieka (somatyczne) – stosowane jako autoprzeszczepy (mniejsze ryzyko nowotworzenia i odrzucenia). Komórki szpiku kostnego, tkanki tłuszczowej i tkankowo specyficzne Ze względu na stopień potencji: - Totipotencjalne – cały organizm i łożysko – w zygocie i moruli - Pluripotencjalne – każda linia zarodkowa komórek (listki zarodkowe) – w blastocyście (wewnętrznej warstwie, embrionalne komórki macierzyste) - Multipotencjalne – jedna linia zarodkowa – w zarodku, płodzie i u dorosłego - Unipotencjalne – jeden rodzaj tkanki – w płodzie i u dorosłego Podziały komórek macierzystych - Symetryczny z zachowaniem cech -> powstają komórki macierzyste - Asymetryczny -> powstaje kom. macierzysta i progenitorowa - Symetryczny bez zachowania cech -> powstają kom. progenitorowe Embrionalne komórki macierzyste (ESC) Z blastocysty (100-150 niewyspecjalizowanych komórek), zwykle z epiblastu (wewnętrzna warstwa komórek blastocysty), pluripotencjalne, nieograniczona liczba podziałów symetrycznych, powstają z nich 3 listki zarodkowe, klonogenne (z pojedynczej może powstać cała kolonia klonów), brak inaktywacji chromosomu X, pokrewne do nowotworowych komórek macierzystych. Można podtrzymywać stan niezróżnicowania przez ok. 2 lata, a hodować je przez czas nieograniczony. Embrionalne komórki zarodkowe (EGC) – z pierwotnych komórek zarodkowych z grzebienia gonadalnego. Tworzą się podczas powstawania gastruli (komórki pnia migrują do grzebieni -> osiadają tam -> gamety). W chwili osiedlenia już są w jakimś stopniu zróżnicowane w kierunku powstawania gonad. Komórka progenitorowa – częściowo zróżnicowana. Zdolna do dalszego różnicowania się w różne typy komórek określonej linii, ale niezdolna do samoodnowy. Otrzymywanie swoistej linii komórkowej z ESC Usunięcie jądra z komórki jajowej -> wspólna hodowla z komórką somatyczną dawcy -> impulsy elektryczne -> fuzja komórek dawcy z kom. jajowymi bez jądra -> pobudzenie komórek do podziału -> kom. macierzyste identyczne genetycznie z kom. dawcy -> pobranie embrioidów (wewnętrznej masy kom. macierzystych w blastocyście)-> otrzymywanie czystej kolonii -> selekcja przez sortowanie -> indukcja różnicowania lub wzrostu -> hodowla komórek (na podłożu zapobiegającym różnicowaniu) -> testowanie funkcji -> sprawdzanie wydajności i bezpieczeństwa -> ocena integracji z kom. biorcy i indukcji zmian nowotworowych -> zastosowanie w eksperymentalnej terapii komórkowej (badane do choroby Parkinsona, cukrzycy t. I, uszkodzeń rdzenia kręgowego, dystrofii Duchenne’a itd.) Przy braku transferu jądra kom. somatycznej (pierwsze 6 etapów) nie ma zastosowania terapeutycznego, tylko cele badawcze. Somatyczne komórki macierzyste (ASC) Główny materiał badawczy. Rezerwuar komórek odpowiadający za regenerację tkanek i regulację homeostazy. Multi- lub unipotencjalne, w większości organów. Liczba i dostępność zależy od lokalizacji i stanu organizmu, fizjologicznie potencjał do ich tworzenia jest nieograniczony (różne tempo w różnych tkankach). Podlegają starzeniu. Klasyfikacja: - Umiejscowienie w niszy: hematopoetyczne krwi, hematopoetyczne szpiku, mezenchymalne szpiku, mezenchymalne innych tkanek, kom. satelitarne mięśni, neuronalne komórki macierzyste, epidermalne kom. macierzyste, mezenchymalne tkanki tłuszczowej. Namnażanie, potencjał do różnicowania i migracji zależą od warunków w niszy, w której się znajdują. Zaburzenia równowagi układu -> zaburzenia regeneracji narządów, niekontrolowany wzrost liczby komórek, zaburzona homeostaza tkankowa, nowotwory u potencjalnego. Źródło komórek macierzystych – szpik kostny Zawiera: - Nieadherentne hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) – obecne też we krwi obwodowej i pępowinowej - Adherentne mezenchymalne komórki macierzyste (MSC, kom. stromalne, BM-MSC) – 1/2500 – 1/100 000 komórek szpiku. Różnicują się do komórek ekto-, endo- i mezodermalnych (pluripotencjalne). Zabieg pozyskiwania komórek ze szpiku metodą aspiracyjną może wiązać się z bólami kostnymi i nawet infekcją szpiku. Źródło komórek macierzystych – krew pępowinowa Różnorodne komórki macierzyste mobilizowane z tkanek płodu do krwi przez stres porodowy. Heterogenne, łatwo dostępne, mniej dojrzałe, mniej immunogenne, większe zdolności proliferacyjne, umożliwiają dłuższe przechowywanie -> banki, przeszczepy allo- i autogeniczne Krwiotwórcze komórki macierzyste (HSC) Ze szpiku lub krwi obwodowej (1:10 000 kom. krwi), populacje wykryte też np. w sercu, w skórze, różnicują się w komórki krwi, multipotentne, zdolne do podziałów niesymetrycznych. Z niszy docierają sygnały -> równowaga samoodnowa-różnicowanie-apoptoza-migracja. Nisza w szpiku (cz. komórkowa – osteoblasty, makrofagi, kom. mezenchymalne, kom. śródbłonka; macierz pozakomórkowa). Funkcjonowanie kom. macierzystych regulowane przez białka adhezyjne, cytokiny, stężenie tlenu i jonów wapnia. Ich pula musi starczyć na całe życie. Wszystkie zmiany genetyczne -> utrwalenie w komórkach potomnych -> zaburzenia hematopoezy. Kom. macierzysta + cytokiny, czynniki wzrostu -> kom. progenitorowe (linii mieloidalnej lub limfoidalnej) -> monocyty, granulocyty, megakariocyty, erytrocyty, mastocyty lub limfocyty T, B, komórki NK, limfoidalne komórki dendrytyczne Typy: - Typ I – komórki długookresowe, zdolność do samoodnowy, wytwarzają dowolne komórki krwi w okresie kilku miesięcy - Typ II – komórki odnawiające układ krążenia w krótkim czasie, niemożliwa samoodnowa Różnicowanie względem leukocytów: badanie markerów powierzchniowych (antygeny CD34, CD59, Thy1, C-kit, brak CD38 (markera leukocytów)). Ochrona komórek macierzystych: - Cześć zostaje w spoczynku (faza G0) -> spadek ryzyka mutacji. - Podwyższona ekspresja białek oporności na apoptozę, naprawy uszkodzeń DNA, usuwania toksyn, ochrony przed kom. swoistej i nieswoistej odpowiedzi odpornościowej - Mikrośrodowisko szpiku kostnego  Pobranie HSC z krwi obwodowej - Za pośrednictwem aferezy z udziałem mobilizacji HSC do krwi obwodowej za pomocą G-CSF (czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów. Glikoproteina, cytokina krwiotwórcza) Procedura: Podanie G-CSF; uwalnianie elastazy neutrofilowej i katepsyny -> chętniejsza migracja HSC na obwód; proteoliza białek utrzymujących HSC w przestrzeni szpikowej -> upłynnienie szpiku kostnego i migracja do krwi obwodowej (mobilizacja) -> przepuszczenie krwi przez separator z oczyszczonym antygenem CD34 (wiązanie komórek) -> ocena cytometryczna -> podanie wysortowanych komórek pacjentowi (np. przy nowotworach krwi) Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) Podobne i podobnie in-vitro rozwijające się do fibroblastów, samoodnawialne, różnicują się w komórki wszystkich listków zarodkowych, a potem w np. miocyty, osteoblasty, adipocyty, chondrocyty czy neurony. Multipotencjalne komórki macierzyste zdolne do różnicowania się co najmniej w komórki tkanki kostnej, chrzęstnej i tłuszczowej (głównie w te 3 tkanki się różnicują). Wytwarzają tkankę łączną (w tym siateczkowatą), mogą modulować układ odpornościowy (wydzielają IL-6, -7, -8, - 11, GM-CFS, TGF-beta) i otaczające mikrośrodowisko (w/w cytokiny, czynniki wzrostu) (wpływ na angiogenezę, zmniejszenie stanu zapalnego, sprzyjanie regeneracji tkanek), syntezują antygeny powierzchniowe (CD73+, CD90+, CD105+; brak CD45, CD34+). Obecne w okolicach bogatych w macierz międzykomórkową. Pozyskiwane ze szpiku, krwi (obwodowej i płodowej), tkanki tłuszczowej, chrzęstnej, kostnej, skóry, wątroby, płuca, śledziony, grasicy, trzustki, nerki. Lokalne uszkodzenia, odczyn zapalny, niedotlenienie -> migracja MSC tam MSC z adipocytów – mniejszy potencjał macierzystości, obecny potencjał regeneracyjny. Rozwój in vitro: kolonia z komórek przylegających do podłoża -> pokrywanie całej dostępnej powierzchni Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) Dowody na istnienie: - wzrost liczby adipocytów przy nadmiarze energii -> istnienie komórek adipogennych, niezróżnicowanych - pobudzenie receptorów warunkujących różnicowanie adipocytów przez tiazolidinedion Stosowane w ortopedii, traumatologii, w leczeniu ostrych i przewlekłych stanów zapalnych, zwyrodnień, rekonstrukcji tkanki chrzęstnej lub kostnej, leczeniu schorzeń neurologicznych Bardziej homogenna populacja niż kom. mezenchymalne szpiku (tylko kilka procent kom. prekursorowych śródbłonka naczyń krwionośnych), brak różnic morfologicznych między nimi a mezenchymalnymi szpiku, niższy potencjał chondro- i osteogenezy, wszechstronne w różnicowania się – pluripotencjalne (enktodermalne: neurony, dendrocyty, kom. Schwanna, kom. naskórka; mezodermalne: adipocyty, chondrocyty, osteoblasty, miocyty, kardiomiocyty, fibroblasty; endodermalne: hepatocyty, kom. beta trzustki) Zalety ADSC: dostępność, obfitość występowania (podścielisko, tkanki tłuszczowe), wolne starzenie się, łatwość hodowania (szybko proliferujące, zwłaszcza z tkanki podskórnej), immunomodulacja, immunosupresja, długo utrzymywane jako komórki niezróżnicowane (przez warunki beztlenowe). Właściwości immunomodulacyjne ADSC Hamują proliferację limfocytów T, czynności efektorowe limf. B i T, kom. NK, hamują dojrzewanie kom. dendrytycznych (promowanie generacji limf. Treg), ograniczają zdolność limf. T do podtrzymywania odpowiedzi immunologiczno-zapalnej, zmniejszają wydzielanie IL-2, TNF-alfa, interferonu gamma, działają immunosupresyjnie, pobudzają wydzielanie IL-10 przez makrofagi (hamowanie migracji neutrofilów, ograniczenie wybuchu tlenowego). To skutek wydzielania przez nie TGF-beta, prostaglandyn (PGE2), czynnika wzrostu hepatocytów (HGF), ludzkiego antygenu leukocytarnego G (HLA-G), IL-1Ra Otrzymywanie ADSC Pobranie tkanki tłuszczowej (najczęściej liposukcja) -> płukanie w roztworach i trawienie kolagenazą-1 -> wirowanie i zebranie frakcji zrębu (SVF) (dolna warstwa) -> hodowla ADSC (oddzielenie ich od innych komórek zrębu wykorzystując ich zdolność do adhezji do plastikowego podłoża. Odklejające się od podłoża komórki giną. Hodowane w pożywce adipogennej), proliferacja -> różnicowanie -> badania in-vitro, wypełnianie ubytków tkanek miękkich np. po mastektomii, regulator Najistotniejsze dla adipogenezy składniki pożywki: insulina, insulinopodobny czynnik wzrostu-1 (IGF- 1), glikokortykosteroidy Zastosowanie kliniczne ADSC – miogeneza Warunki hodowli: 5% surowica końska, glikokortykoidy (deksametazon, hydrokortyzon). Dzięki temu ekspresja genów markerów miogenezy (np. ASMA, kalponiny, troponiny, SM22, MHC) -> fuzja komórek, formowanie wielojądrowych mikrotubul, kurczliwość pod wpływem atropiny Zastosowanie: leczenie dystrofii mięśniowej Zastosowanie kliniczne ADSC – kardiomiogeneza Warunki hodowli: 10% surowica, DMEM/F12 (wyższe stężenie aa i witamin + składniki uzupełniające) Dzieki temu ekspresja genów markerów kardiomiogenezy (troponiny-1, troponiny T, tropomiozyny, lekkiego łańcucha miozyny II, kanału wapniowego typu L) -> rytmicznie kurczące się kardiomiocyty, wydzielanie naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF), czynnika wzrostu hepatocytów, łożyskowy czynnik wzrostu, czynnik wzrostu fibroblastów II, TGF-beta Działanie na uszkodzone serce myszy: regeneracja narządu i promowanie angiogenezy Zastosowanie kliniczne ADSC – chondrogeneza Warunki hodowli: TGF-beta, deksametazon, insulina, askorbinian. Hodowla peletkowa (na rusztowaniach, zapewnia dużą gęstość macierzy), potrzebny tlen (ok. 10%, nie może być więcej niż 20%) Modele hodowli: - mikropeletki (micropellets) -> wytwarzanie macierzy międzykomórkowej. Naśladuje stan fizjologiczny i rozwój embrionalny, zapewnia odpowiednią komunikację komórek - monolayer -> utrata fenotypu chrząstkowego (spadek ekspresji kolagenu t. II, wzrost kolagenu t. X – zmiany charakterystyczne dla przerośniętych chondrocytów) - 3D – skafoldy z agarozy, fluoropolimerów lub żelatyny -> naśladuje stan fizjologiczny Dzięki temu ekspresja genów markerów chondrogenezy (Sox-9 (prawidłowy rozwój chrząstki), agrekanu (główny składnik strukturalny chrząstki), kolagenu II (występuje w chrząstce), GAG, białka BMP-6, -7 (białka morfogenetyczne kości)) -> powstawanie chondrocytów Zastosowanie: odtwarzanie chrząstki w RZS, chorobie zwyrodnieniowej stawów Zastosowanie kliniczne ADSC – osteoblastogeneza Warunki hodowli: deksametazon, 1,25-hydroksywitamina D3, glicerofosforan, askorbinian. Hodowane przez 2-4 tygodnie. Dzięki temu ekspresja genów markerów osteoblastogenezy (Runx-2, osterix, BMP-2, kolagenu typu I, osteopontiny, osteokalcyny) -> mineralizacja macierzy międzykomórkowej, powstawanie osteoblastów, aktywność fosfatazy alkalicznej, zdolność odkładania fosforanu wapnia, wrażliwość na nacisk -> indukcja ekspresji genów kolagenu t. I Zastosowanie: nieprawidłowe zrośnięcia kości, brak wzrostu kości, wspomaganie przeszczepu tkanki kostnej Zastosowanie kliniczne ADSC – neurogeneza Warunki hodowli: surowica, NGF (neuronalny czynnik wzrostu), BDNF (neurotropowy czynnik pochodzenia mózgowego). Duża gęstość hodowli. Potem zbiera się neurosfery. Warunki hodowli dla neurosfer: integryny (białka powierzchniowe, adhezyjne), podłoże żelowe skoniugowane z lamininą (składnik błony podstawnej) Dzięki temu ekspresja genów markerów neurogenezy (MBP, nestyny (marker nerwowych komórek macierzystych), kwaśnego białka włókienkowego (GFAP) (filamenty pośrednie w komórkach glejowych), beta-tubuliny III (białko wczesnej fazy różnicowania się neuronów)) -> różnicowanie komórek neurosfer w komórki neuropodobne Formują się neurosfery – struktury z mniejszych, okrągłych komórek, słabo przytwierdzonych do podłoża lub luźno pływających Zastosowanie: regeneracja uszkodzonych neuronów (przez działanie parakrynne – wydzielanie czynników wzrostu) Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (IPSC) Komórki o właściwościach komórek embrionalnych pochodzące z dorosłych, zróżnicowanych komórek Fibroblasty -> indukcja nadekspresji KLF4, SOX2, c-Myc, Nanog, Oct-3/4, LIN28 za pomocą retrowirusowego wektora -> reprogramowanie komórek -> IPSC -> kardiomiocyty, adipocyty, neurony (dopaminergiczne, ruchowe), komórki beta trzustki, hematopoetyczne komórki progenitorowe Otrzymano je już też z keratynocytów, hepatocytów, amniocytów, limfocytów, astrocytów, melanocytów i innych. Proces ten jest jednak bardzo niewydajny (np. przez indukcję ścieżki sygnałowej TP53 (supresji nowotworu) przez KLF4 i c-Myc (onkogeny)). Reprogramowanie zwiększa prawdopodobieństwo pojawienia się aberracji chromosomowych Przejściowe wyciszenie ekspresji TP53 -> wzrost wydajności, możliwość użycia tylko SOX2 i Oct-4. Wydajność zwiększano też np. za pomocą stosowania miRNA do reprogramowania (np. miR302) Obecne ryzyko nowotworzenia – powstawania potworniaków. Morfologia: wysoki stosunek objętości jądra do cytoplazmy, wyraźne jąderka, nieograniczony potencjał proliferacyjny. Testy in-vitro: ocena profilu ekspresji genów markerowych pluripotencji (Oct-3, SOX2, Nanog), wszczepianie podskórne/domięśniowe myszom z obniżoną odpornością (spontaniczne różnicowanie się i uformowanie potworniaków), tworzenie ciał embrionalnych, bezpośrednie różnicowanie przez modyfikację warunków hodowli. MSC w medycynie regeneracyjnej MSC mają właściwości terapeutyczne: immunomodulujące, hamujące stany zapalne, koordynują procesy regeneracji i naprawy, aktywują endogenne procesy regeneracji narządów. Przeszczepione i podane dotkankowo mogą odbudować uszkodzone narządy (różnicują się w kom. chrząstki, kości, mięśnia itd.), podane dosystemowo mogą aktywować endogenną regenerację narządu (działanie parakrynne -> wpływ na wydzielanie czynników wspomagających regenerację lub odpowiedź immunologiczną) Dopuszczony lek z nimi: Prohymal Procedura przeszczepu komórek macierzystych Dawca -> pierwotna hodowla komórek macierzystych -> hodowla in-vitro, namnażanie -> stabilna hodowla kom. macierzystych niezróżnicowanych -> stabilna chodowla, ewaluacja ilościowa i jakościowa -> transplantacja LUB różnicowanie (ew. manipulacje genetyczne) przy czynnikach stymulujących (np. czynniki wzrostu i różnicowania, cytokiny, chemokiny, witaminy, hormony) i transplantacja wyróżnicowanych kom. macierzystych (spadek ryzyka nowotworzenia) -> chory biorca - > regeneracja -> zdrowy biorca ADSC w regeneracji tkanek miękkich Preadipocyty -> stymulowanie adipogenezy de novo za pomocą skafoldu z egzogennymi czynnikami wzrostu, wspomaganego lipoaspiratem wzbogaconym komórkami zrębowymi z tk. tłuszczowej -> dojrzała tkanka tłuszczowa -> przeszczep Preadipocyty - bez dużych kropli tłuszczu (łatwiejsza rewaskulazylacja), potrzebują mniej tlenu (większe szanse na przeżycie), nie tworzą blizn po przeszczepie. Są częściej stosowane w terapii. Lipoaspirat -> stymulowanie rozwoju tkanki przez białka ASC -> dojrzała tkanka tłuszczowa -> przeszczep. Dojrzałe adipocyty – przeżywają do 4 dni po przeszczepie, wolno się unaczyniają, tworzą blizny, cysty. Rzadziej stosowane.  MSC w gojeniu się ran MSC wydzielają parakrynne czynniki pobudzające gojenie ran (np. VEGF, IGF-1, EGF, czynniki wzrostu keratynocytów, erytropoetyna). Podobne wydzielanie u tych pochodzenia szpikowego i tłuszczowego. Oba po iniekcji do myszy inicjują migrację fibroblastów skóry, przyspieszają gojenie (nawet przy cukrzycy), mogą różnicować się np. do keratynocytów, perycytów, kom. endotelialnych. Szybciej wykryto obecność białka Ki67 (markera proliferacji) na modelu mysim i większą intensywność gromadzenia się fibroblastów przy brzegu rany -> wzmocnienie migracji fibroblastów -> przyspieszenie gojenia. MSC w terapii cukrzycy Po iniekcji do myszy stymulują regenerację komórek beta wysp trzustki uszkodzonych w rozwoju cukrzycy, zasiedlając uszkodzone miejsca w trzustce. Najpewniej wydzielały czynniki wzrostu i cytokiny stymulujące endogenne komórki macierzyste trzustki do różnicowania się w komórki beta, same podobnie się różnicując. Badano komórki pochodzenia szpikowego. Podanie drogą śródtrzustkową było porównywalne w efektywności z drogą dożylną, dając obraz zbliżony do zdrowej trzustki. Komórki progenitorowe trzustki aktywowane były przez szlak sygnałowy AKT i gen FOXO – regulacja apoptozy, cyklu komórkowego, naprawy DNA, odpowiedzi na stres oksydacyjny, metabolizmu glukozy. ADSC w medycynie regeneracyjnej Do myszy z owrzodzeniem skóry wszczepiono kom. keratynocytopodobne zróżnicowane z ADSC i niezróżnicowane ADSC. Szybkość gojenia rany: keratynocytopodobne komórki > niezróżnicowane ADSC > kontrola Keratynocytpoodobne promują obkurczenie tkanki ziarninowej i epitelializację rany -> szybsze gojenie Niezróżnicowane ADSC spowodowały większą ekspresję markera zróżnicowania w kierunku mięśni gładkich naczyń krwionośnych (alfa-aktyny mięśni gładkich (alfa-SMA)) -> szybsza regeneracja prawidłowego unaczynienia ADSC + osocze bogatopłytkowe (PRP) w ranach skórnych szczurów- cukrzyków Cukrzyca -> spadek procesów odpornościowych i osłabienie mikrokrążenia -> osłabienie gojenia się skóry, spadek barierowości i mikroangiopatie Zastosowanie komórek ADSC+PRP poprawiło angiogenezę u szczurów. Wzrost ekspresji czynnika VEGF -> silna promocja proliferacji komórek śródbłonka naczyń i tworzenia naczyń w miejscu iniekcji mieszanki. Wykryto też wzrost ekspresji markerów naczyń krwionośnych (CD34, CD31, alfa-SMA). Rany goiły się szybciej, mikrokrążenie zostało poprawnie i szybciej odtworzone. Rany cukrzycowe zamknęły się kompletnie -> ADSC i PRP działają synergicznie. Silna ekspresja markerów VEGF, p-STAT3 i SDF-1 -> intensywna angiogeneza.  ADSC w owrzodzeniach stopy cukrzycowej u ludzi Poprawa gojenia się owrzodzeń (szybsze zmniejszanie się powierzchni rany, krótszy czas do 50% redukcji rany, większa liczba całkowicie wygojonych ran). ADSC były bezpieczne i dobrze tolerowane w leczeniu stopy cukrzycowej. ADSC w uszkodzeniach nerwu kulszowego ADSC i hydrożel najlepiej poprawiał funkcje nerwów i mięśni, regenerację i remielinizację aksonów przy uszkodzeniu nerwu kulszowego u szczurów. ADSC w osteoartrozie ADSC promują proliferację chondrocytów stawowych i znacznie przyspieszają ich migrację u królików. W chondrocytach stawowych hodowanych z kom. macierzystymi zwiększone były poziomy mRNA i białka agrekanu, COL2A1 i czynnika transkrypcyjnego SOX9 -> przewaga procesów anabolicznych -> zwiększony potencjał do regeneracji. Zastosowano ADSC podane śródstawowo w osteoartrozie kolana u królika. Obecne było jedynie niewielkie ścieranie powierzchni chrząstki stawowej, brak zmian masy ciała, trybu życia, wzorców i nawyków żywieniowych, brak obrzęku/zaczerwienienia stawów kolanowych -> opóźnienie progresji osteoartrozy. ADSC naprawiają uszkodzoną chrząstkę i zmieniają ekspresję molekularną związaną z osteoartrozą (więcej proteoglikanów w macierzy, mniejsza ekspresja metaloproteinazy-13 (markera osteoartrozy, degraduje macierz poprzez hydrolizę kolagenu t. II)) -> zmniejszenie proteolizy kolagenu -> spowolniony proces zwyrodnieniowy