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Programma del corso (NUOVO) Introduzione al corso; Introduzione ai sensori biochimici: Introduzione al concetto di sensore e principali figure di merito. Rilevazione diretta e indiretta, marcata e non marcata. Il sensore biochimico come principale caso di studio: pri...

Programma del corso (NUOVO) Introduzione al corso; Introduzione ai sensori biochimici: Introduzione al concetto di sensore e principali figure di merito. Rilevazione diretta e indiretta, marcata e non marcata. Il sensore biochimico come principale caso di studio: principali elementi costitutivi. Approcci allo sviluppo di biosensori. Biorecettori e Analiti: richiami sulle caratteristiche delle principali biomolecole di interesse per lo sviluppo di sensori biochimici; tecniche di realizzazione dello strato di recettori (adsorbimento fisico, modifica chimica e intrappolamento). Sensori Biochimici (classificati per tipologia di trasduzione): Sensori ottici: proprietà ottiche dei materiali, fluorescenza, FRET e quenching. Applicazioni allo stato dell’arte (immunofluorescenza, ELISA, DNA microarray, PCR e real-time PCR). Sensori ottici di nuova generazione: Lab-on-Chip e SPR. Sensori elettrochimici: richiami di circuiti elettrici di base; elementi di elettrochimica (reazioni redox, celle elettrochimiche, meccanismi e modelli per le celle elettrochimiche). Biosensori elettrochimici allo stato dell’arte: sensori potenziometrici a membrana ionoselettiva, sensori enzimatici (potenziometrici, amperometrici di prima e seconda generazione, conduttometrici). Nuovi approcci alla sensoristica biochimica elettrochimica: sensori enzimatici di terza generazione, immunosensori amperometrici, tecniche voltammetriche e impedenzometriche e loro applicazione nei biosensori. Sensori elettronici: introduzione ai transistor: tecnologia e principio di funzionamento. Dal MOSFET all’ISFET e suo utilizzo come sensore di pH. Dall’ISFET al BioFET per la rilevazione di bioreazioni. Cenni a nuove tecnologie per lo sviluppo di biosensori elettronici. Biosensori - A.A. 2022/2023 9  UNIVERSITÀ DI CAGLIARI DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMEDICHE LAUREA TRIENNALE IN BIOTECNOLOGIE Introduzione a Sensori e Biosensori Stefano Lai, PhD [email protected]  Sensore Un sensore è un apparato in grado di convertire una grandezza fisica in ingresso in una grandezza fisica in uscita, normalmente più conveniente (tipicamente, una grandezza elettrica). È l’elemento che interfaccia un sistema di misura con il misurando. Biosensori - A.A. 2022/2023 2  Sensori e Trasduttori trasduttore Un trasduttore è un dispositivo in grado di convertire una forma di energia in un’altra. Che differenza c’è tra un sensore e un trasduttore? Un trasduttore è un sistema più complesso, che comprende uno o più sensori ma anche altri blocchi di interfacciamento. La differenza è sottile, e spesso i termini sono usati come sinonimo. Biosensori - A.A. 2022/2023 3  Domanda: differenza trasduttore e sensore Sensori e Trasduttori L’occhio: Iride e pupilla fungono da interfaccia di ingresso, regolando la luce in ingresso e focalizzandola sulla retina; I fotorecettori sulla retina (e Text in particolare sulla macula) fungono da sensore, in grado di convertire lo stimolo luminoso in segnali elettrici; Il nervo ottico convoglia i segnali elettrici verso il cervello, dove vengono sensore elaborati per generare Interfaccia di ingresso l’immagine. L’occhio quindi è un trasduttore! trasduttore Biosensori - A.A. 2022/2023 4  Caratterizzazione di un sensore Un sensore può essere considerato un blocco che Input Sensore Output converte uno stimolo in ingresso in uno stimolo di uscita. Caratterizzazione di un Output Output sensore: Dinamica: variazione dell’uscita nel tempo; Statica: variazione dell’uscita rispetto tempo Input all’ingresso. Biosensori - A.A. 2022/2023 5  Come riconosco la risposta specifica del sensore e sono in grado di pulirla dal rumore? Risposta dinamica rumore Idealmente, il segnale di uscita del sensore è generato solo dopo Input Sensore Output l’applicazione dell’ingresso, mentre prima l’uscita resta a zero. Output In pratica, è necessario considerare le sorgenti di rumore presenti nel sistema: Rumore casuale proveniente dal Sistema di misura e dal sensore; Rumore ambientale (es., cambio di temperatura, di luce, modifiche nel pH tempo della soluzione). Biosensori - A.A. 2022/2023 6  Risposta dinamica – effetto del rumore Output La rimozione del rumore è fondamentale per __ _ __ __ _ una corretta caratterizzazione del sensore. __ _ __ __ _ __ __ Vincere sul rumore in modo totale è impossibile, normalmente per rendere il _ __ __ segnale utile all’applicazione è essenziale avere dispositivi che tolgano il _ __ __ rumore, o un rallentamento del sensore o intervenire sulle caratteristiche del _ __ __ t segnale stesso. La prima operazione attuabile è fare medie. Ogni singola acquisizione tuttavia durerà di più, abbiamo quindi una lettura più lenta. Se in 5 minuti la reazione che voglio misurare non avviene, il mio sensore è pensato per fare una misura ogni misurazioni: questo è rumorosissimo, se medio e di ogni 1000 tiro fuori un valore, ho 300 valori, ogni secondo tira fuori una misura, ma medio ogni secondo faccio una media su 1000 campioni. Biosensori - A.A. 2022/2023 7  Risposta dinamica – effetto del rumore Output La rimozione del rumore è fondamentale per una corretta caratterizzazione del sensore. Un rumore casuale può essere rimosso compiendo una media dei campioni acquisiti, durante l’acquisizione o sui dati salvati. t In alternativa, è possibile utilizzare un dispositivo di riferimento, identico al sensore ma non sensibile all’analita di riferimento, e considerando come uscita la differenza (o il rapporto) delle due uscite. Biosensori - A.A. 2022/2023 7  Misura differenziale: prendo due dispositivi identici, uno è il sensore e uno è il suo gemello ma non sensibile: ho tolto la possibilità di leggere il misurando. Quello che potrà fare il sensore è leggere il rumore, più la risposta al misurando. Il sensore non sensibile non risponde al misurando, gliel’ho impedito, quindi rileverà solo il rumore e la differenza darà la risposta del misurando. Questo può essere fatto solo se da un punto di vista formale i due sensori sono identici. Risposta dinamica – Drift Drift: disturbo diverso dal rumore casuale, porta il sensore a modificare la propria uscita in assenza di ingresso specifico, con continuità nel tempo. Un sensore che sia sensibile solo a una cosa è impossibile da ottenere. Possiamo massimizzare la specificità ma ci sarà sempre una fonte di disturbo che attiva il sensore. Esempio: vogliamo misurare pH dell’acqua, magari il sensore può Oltre al rumore, è possibile che il segnale di uscita vari essere influenzato anche dalla temperatura esterna, dando una lentamente e con costanza in modo totalmente risposta che non c’entra col pH. aspecifico: questo effetto viene chiamato drift (deriva). La presenza di fenomeni di drift può dipendere da fattori tecnologici o dalla variazione (lenta e costante) di parametri nell’ambiente di misura. L’impatto del drift sulla misura dipende dall’applicazione e in particolare dal tempo caratteristico del drift: Drift continuo ed evidente nel breve periodo può essere correlato a variazioni nell’ambiente di misura; se sistematico, si può compensare. Se è lento, e produce una variazione di segnale molto piccola, può Il drift non è sempre un problema, se è un qualcosa di sistematico essere trascurato. e riproducibile siamo autorizzati a sottrarlo. In misure molto lunghe, potrebbe essere sintomo di una degradazione del sensore. Biosensori - A.A. 2022/2023 8  Dalla risposta dinamica alla risposta statica Fisso un tempo in cui sono sicuro che in tutti gli esperimenti il sensore abbia raggiunto ampiezza massia, piazzo l’uscita in un grafico in cui sull’asse X ho il valore dell’input dell’’esperimento. Output Output Input Funzione di trasfeirmento: funzione che lega valore di uscita all’ingresso (per noi è la curva di taratura) t Input La risposta dinamica è forse la forma di caratterizzazione più intuitiva. Se l’ingresso viene modificato in intensità, l’uscita del sensore si modifica, ad esempio raggiungendo ampiezze maggiori. Considerando l’intensità dell’uscita per diversi valori dell’ingresso a un dato istante di tempo (tipicamente, quando il valore dell’uscita è stabile), si ottiene la caratteristica statica del sensore, nota anche come funzione di trasferimento o curva di taratura. Biosensori - A.A. 2022/2023 9  Parametri caratteristici di un sensore A seconda della caratterizzazione adottata, esistono diversi parametri di interesse (caratteristiche metrologiche) che possono essere ricavati per un sensore. Caratteristica dinamica: Tempo di risposta; Tempo di assestamento. Risoluzione Caratteristica statica: Campo di misura (operating range); Linearità; Sensibilità; Risoluzione; Accuratezza e Precisione; Isteresi; Ripetibilità e Riproducibilità; Stabilità. Limite di rilevazione. Biosensori - A.A. 2022/2023 10  Risposta dinamica – Tempo di risposta Il tempo di risposta è il periodo di tempo necessario al sensore per produrre un’uscita apprezzabile dal momento dell’applicazione dell’ingresso. Convenzionalmente, è il tempo necessario ad osservare una variazione del segnale di uscita pari al 95% della massima risposta osservata. In caso di sensori reversibili, si considera un tempo di risposta anche per quel che concerne la scomparsa del segnale di uscita. Il tempo di risposta nelle due fasi è normalmente differente. Il mio sensore ci ha messo 60 secondi, questo è il tempo di risposta Biosensori - A.A. 2022/2023 11 Risposta dinamica – tempo di assestamento In un sensore, il tempo di assestamento è definite come il tempo necessario ad ottenere una risposta stabile dopo l’applicazione del sistema. La risposta viene considerate stabile quando possibili oscillazioni dell’uscita non superano una certa banda di errore. Biosensori - A.A. 2022/2023 12  Risposta dinamica - risoluzione Output Risoluzione: la minima variazione nella grandezza di ingresso che produce una variazione rilevabile nell’uscita del sensore. [A]=x Nell’esempio possiamo affermare che la risoluzione del [A]=x sensore rispetto al parametro di ingresso (concentrazione di [A]=x [A]=x un certo analita A) è 2x, perché la prima risposta rilevabile del sensore è ottenuta solo dopo il secondo inserimento di A (la concentrazione è cumulativa). La risoluzione è negativamente influenzata dal rumore: all’aumentare del rumore, risposte del sensore troppo «piccole» possono risultare del tutto oscurate! tempo Biosensori - A.A. 2022/2023 13  Risposta statica – Campo di misura e linearità Il campo di misura è quell’intervallo in cui il sensore mappa i valori di ingresso in uscita. Output Il campo di misura identifica l’intervallo di valori dell’ingresso che possono essere misurati con il sensore, ovvero per i quali è possibile trovare un’univoca identità tra il valore dell’ingresso e un valore dell’uscita. Regione di Oltre un certo valore dell’ingresso, l’uscita entra in saturazione una regione di saturazione. La caratteristica ideale di un sensore è lineare, ma nella pratica nessuna caratteristica è perfettamente lineare: in prossimità della parte terminale del campo di misura (fondo scala), si raggiunge un intervallo non lineare. Campo lineare Il sensore viene preferenzialmente utilizzato in una Input regione del campo di misura assimilabile a una Campo di misura retta: questo viene chiamato campo lineare. Biosensori - A.A. 2022/2023 14  Risposta statica - Sensibilità Sensibilità: derivata matematica curva statica, variazione dell’uscita rispetto all’ingresso. La sensibilità è la pendenza del campo lineare. Output Formalmente, si definisce sensibilità del sensore la derivata della risposta statica, 𝑑 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 Per definizione di derivata potrei 𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑡à = prendere qualsiasi punto e 𝑑(𝐼𝑛𝑝𝑢𝑡) definire la sensibilità in punti In un sensore dotato di caratteristica lineare, questa diversi, non ha senso definirla punto per punto. derivata ha un valore unico, corrispondente alla pendenza della caratteristica stessa. Nel caso di una caratteristica «reale», esistono diverse sensibilità; in parti della curva non lineari, si sensibilità compiono delle linearizzazioni. Di norma, la sensibilità dichiarata deve essere quindi Campo linearizzato correlata a un preciso intervallo di valori dell’ingresso. Campo lineare Convenzionalmente, le sensibilità dichiarata è riferita al campo lineare del sensore. Input Biosensori - A.A. 2022/2023 15  Risposta statica - Precisione Output Abbiamo visto che la caratteristica statica è ottenuta come interpolazione di punti sperimentali. Affinché l’interpolazione sia significativa, è importante avere un numero significativo di punti sperimentali p*, ma anche ripetere un numero significativo di volte ciascuna misura. I valori su cui si compie l’interpolazione sono quindi una media di diversi valori: 1 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ = 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ 𝑁 Le bande di errore di ciascun punto sperimentale sono date dalla deviazione standard delle diverse misure, ∑ 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ − 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ 𝜎 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 = 𝑁−1 Questo parametro definisce inoltre la precisione del sensore, ovvero la sua capacità di fornire un’uscita sempre simile a se stessa quando soggetto allo stesso ingresso. Input Biosensori - A.A. 2022/2023 16  Risposta statica - Precisione Output Abbiamo visto che la caratteristica statica è ottenuta come interpolazione di punti sperimentali. Affinché l’interpolazione sia significativa, è importante avere un numero significativo di punti sperimentali p*, ma anche ripetere un numero significativo di volte ciascuna misura. I valori su cui si compie l’interpolazione sono quindi una media di diversi valori: 1 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ = 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ 𝑁 Le bande di errore di ciascun punto sperimentale sono date dalla deviazione standard delle diverse misure, ∑ 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ − 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ 𝜎 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 = 𝑁−1 Questo parametro definisce inoltre la precisione del sensore, ovvero la sua capacità di fornire un’uscita sempre simile a se stessa quando soggetto allo stesso ingresso. Input Biosensori - A.A. 2022/2023 16  Risposta statica - Precisione Output Abbiamo visto che la caratteristica statica è ottenuta come interpolazione di punti sperimentali. Affinché l’interpolazione sia significativa, è importante avere un numero significativo di punti sperimentali p*, ma anche ripetere un numero significativo di volte ciascuna misura. I valori su cui si compie l’interpolazione sono quindi una media di diversi valori: 1 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ = 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ 𝑁 Le bande di errore di ciascun punto sperimentale sono date dalla deviazione standard delle diverse misure, ∑ 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ − 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ 𝜎 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 = 𝑁−1 Questo parametro definisce inoltre la precisione del sensore, ovvero la sua capacità di fornire un’uscita sempre simile a se stessa quando soggetto allo stesso ingresso. Input Biosensori - A.A. 2022/2023 16  Quando provo qualcosa di cui non conosco l’accuratezza, mi serve uno standard di riferimento. Risposta statica - accuratezza Standard Output Avere un sensore preciso implica che il dato misurato sia rappresentativo del vero valore del misurando? La risposta è no! Il fatto che il valore dell’uscita sia sempre simile a se stesso non vuol dire che il valore sia giusto. Il massimo scostamento dell’uscita del sensore dal valore vero del misurando è definite dall’accuratezza. Per verificare l’accuratezza del sensore, è necessario avere a disposizione uno standard, ovvero una tecnica con cui il misurando è convenzionalmente misurato. ∑ 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 − 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 − 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 𝑟= ∑ 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 − 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 ∑ 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 − 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 Un coefficiente di correlazione prossimo a 1 implica che, a parità di condizioni sperimentali, l’uscita del sensore è paragonabile a quella dello standard. L’operazione di correlazione tra sensore e standard prende il Input nome di calibrazione. Biosensori - A.A. 2022/2023 17  Precisione vs. Accuratezza La precisione è un indice della variabilità dei dati: piccolo errori casuali nella misura implicano Phil «The Power» Ispettore Kemp una precisione elevate Taylor, 16 volte del sensore. Piccoli errori sistematici e Piccoli errori casuali, ma campione del mondo L’accuratezza definisce casuali: preciso e accurato grande errore sistematico: di freccette preciso, ma non accurato quanto il valore misurato è vicino al valore reale. Piccoli errori sistematici implicano un’elevate accuratezza. Idealmente, un sensore Errori casuali elevate ma Stefano Lai, PhD Grandi errori sistematici e Stefano Lai, PhD deve possedere errori sistematici ridotti: casuali: non preciso e non dopo 8 birre entrambe queste accurato, ma non preciso accurato proprietà. Biosensori - A.A. 2022/2023 18 Calibrazione vs. Taratura: attenti al false In inglese adjustment friend! In inglese di dice calibration! Taratura: operazione che calcola la rispsota statica del sensore, ricaviamo l’uscita del sensore dato un ingresso. La calibrazione è l’operazione con cui confronto l’uscita del sensore con un riferimento per valutarne l’accuratezza. L’operazione di taratura consente di ottenere la caratteristica statica, e quindi di ricavare le caratteristiche metrologiche del sensore. L’operazione di calibrazione consente invece di verificare (ed eventualmente migliorare) l’accuratezza del sensore. Caratteristica statica: In inglese, taratura è tradotto con calibration! Campo di misura (operating range ); Linearità; Nei libri inglesi, quindi, è facile imbattersi nel Sensibilità; termine calibration curve, che corrisponde alla Accuratezza e Precisione; Isteresi; curva di taratura. Ripetibilità e Riproducibilità; L’equivalente inglese di calibrazione è invece Stabilità. Limite di rilevazione. adjustment. Biosensori - A.A. 2022/2023 19  Risposta statica – Limite di rilevazione Output Il punto (0,0) fa parte della curva di taratura? NO! Anche se l’ingresso è zero, l’uscita del sensore non è zero per via delle sorgenti di rumore. La minima risposta del sensore distinguibile dal semplice rumore è detto limite di rilevazione (limit of detection., LoD). Quando applico 0 non posso avere uscita zero. C’è il rumore. Input Biosensori - A.A. 2022/2023 20  Limite di rilevazione: distanza tra valore di uscita in condizioni di assenza dell’analita a cui si somma la deviazione standard del processo. Più K è grande meno una parte di questa curva verrà sovrapposta all’esperimento. Risposta statica – limite di rilevazione K è l’ampiezza dell’intervallo di tolleranza In assenza di ingresso, N misure del sensore produrranno dei valori dell’uscita Outputblank distribuiti secondo una curva gaussiana, con massimo nel valore medio della misura e dotata di deviazione standard blank. 𝜎 Ripetendo le N misure applicando il più piccolo degli ingressi che può essere controllato in fase sperimentale, l’uscita del sensore assumerà dei valori distribuiti secondo una curva gaussiana, centrata nel valore medio. Questo 𝑘𝜎 prende il nome di limite di quantificazione (Limit of Quantification, LoQ). Se le due gaussiane non sono sovrapposte, la risposta del sensore sarebbe Outputblank LoD LoQ Output sempre distinguibile dal rumore. In caso di sovrapposizione, possono esistere condizioni in cui una risposta effettiva del sensore venga scambiata per rumore (falso negativo), o in cui il rumore venga scambiato per una risposta valida k sovrapposizione (falso positivo). Definiamo il LoD come il punto di sovrapposizione tra le due gaussiane, 1 31,73% 𝐿𝑜𝐷 = 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 + 𝑘𝜎 2 4,55% Il valore del LoD dipende da k: più questo è alto, inferiore è la sovrapposizione 3 0,27% Bianco considerata accettabile e quindi più accurato sarà il sensore. Nella pratica, non Limite di rilevazione, non possiamo sapere si utilizzano valori di k inferiori a 2. se dipende dal bianco o dall’analita Biosensori - A.A. 2022/2023 21  Risposta statica - Isteresi Output Idealmente, un l’uscita di un sensore dipende unicamente dall’ingresso applicato. Se la “storia” del sensore ne modifica la funzione di trasferimento mostra un’isteresi, ovvero una mancata sovrapposizione delle funzioni di trasferimento Un caso tipico di isteresi è quello relative al “verso” di applicazione dell’ingresso: quando l’intensità dell’ingresso è applicata in senso ascendente o discendente, l’uscita del sensore è differente. Input Biosensori - A.A. 2022/2023 22  Risposta statica – altri parametri Ripetibilità: attitudine del sensore a fornire valori dell’uscita per un dato valore dell’ingresso con elevata precisione, a parità di condizioni di lavoro (stesso operatore e condizioni di utilizzo) nel breve periodo. Riproducibilità: attitudine del sensore a fornire valori dell’uscita per un dato valore dell’ingresso con elevata precisione, in condizioni di lavoro differenti. Stabilità: attitudine del sensore a conservare inalterate le sue prestazioni in un periodo di tempo più o meno lungo. Biosensori - A.A. 2022/2023 23 Biosensore: definizione IUPAC AUndevice thatche dispositivo uses specific utilizza biochemical specifiche reazioni reactions biochimichemediated mediate da by isolated enzimi enzymes, isolati, immunosystems, sistemi immunitari, tissues, tessuti, organuli organelles o cellule or intere per whole rilevarecells to detect composti chimici,chemical di solito compounds usually attraverso segnali by electrical, elettrici, termici o thermal orottici.optical signals. TRASDUTTORE ELABORAZIONE DEL SEGNALE RECETTORI ANALITI Biosensori - A.A. 2022/2023 24 Biosensori Infatti sarebbe più corretto il nome biotrasduttori Un biosensore è quindi formalmente un sistema di misura complesso, ottenuto integrando degli elementi biochimici (recettori) a un trasduttore, che converte l’energia della reazione in una forma di energia diversa. Biosensori - A.A. 2022/2023 25  Classificazione dei biosensori Biosensori Per principio di Per recettore trasduzione Acidi Organelli, Anticorpi Enzimi Nucleici cellule o Ottici Gravimetrici Elettrochimici Elettrici (Affinità) (Catalitici) (Genetici) tessuti Biosensori - A.A. 2022/2023 26  UNIVERSITÀ DI CAGLIARI DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMEDICHE LAUREA TRIENNALE IN BIOTECNOLOGIE Analiti e Recettori Stefano Lai, PhD [email protected] Questa immagine spiega cosa può essere analita e cosa un recettore. Gli analiti possono essere cose diverse, è ciò che dobbiamo rilevare. Una volta definito l’analita dobbiamo capire qual è il miglior recettore possibile (specifico, selettivo). Normalmente ci sono enzimi che fanno da recettori, gli anticorpi sono molto usati nelle reazioni immunologiche, si possono usare sensori che usano come recettore meccanismi complessi come parti di tessuto. Come posiziono i recettori sul sensore? Analiti e recettori biochimici Shavanova et al., Sensors 2016, 16, 223 Biosensori - A.A. 2022/2023 2  Recettori Biochimici – Modifica delle superfici Come prendere una biomolecola e trasformarla in un recettore? ci sono tre sostemi: assorbimento, intrappolamento o modifica chimica La modifica delle superfici consiste quindi nell’integrare sulla superficie sensibile del sensore i recettori necessari. Esistono diverse strategie a riguardo: Modifica fisica (adsorbimento); Modifica chimica (modifica covalente) ; Prendiamo la soluzione che contiene la biomolecola e la mettiamo nella Intrappolamento. superficie, evapora, quello che resta come precipitato sono le molecole. Biosensori - A.A. 2022/2023 3  Modifica delle Superfici - Adsorbimento Ha lo svantaggio di essere poco stabile Nel caso dell’adsorbimento fisico, si sfrutta la possibile interazione del recettore con la superficie tramite forze fisiche. Tipicamente, l’adsorbimento avviene per interazione elettrostatica. È la tecnica più semplice, ma anche quella che garantisce la stabilità inferiore dello strato recettore sulla superficie. Biosensori - A.A. 2022/2023 4  Modifica delle Superfici – Modifica chimica Reazione chimcia tra superficie e recettore, genera un legame duraturo. Se la molecola ha un gruppo chimico con un gruppo chimico sulla superficie, facciamo avvenire la reazione. Nel caso della modifica chimica, si forma un legame stabile tra il recettore e la superficie. Garantisce la miglior stabilità possibile del legame, ma pone dei vincoli sulla superficie (deve possedere degli adeguati gruppi chimici). Qualora non sia possibile garantire il legame diretto tra recettore e superificie, esistono comunque delle possibili strategie. Biosensori - A.A. 2022/2023 5 Modifica delle Superfici – Modifica chimica In cosa consiste un monostrato autoassemblato: il precursore è una molecola che è sempre fatta allo steso modo, con un gruppo testa fatto apposta per interagire. Alla testa è collegata una catena alchilica chiamata coda, alla fine della coda c’è un gruppo funzionale costruito per interagire con la biomolecola. La strategia più comune è quella di porre delle molecole che facciano da «ponte» tra superficie e recettore. Tra queste, la più utilizzata è quella rappresentata dai monostrati autoassemblati (Self-Assembled Monolayer, SAM). I precursori di un SAM sono delle molecole composte da tre elementi: gruppo di testa, in grado di interagire chimicamente con la superficie; spaziatore (coda), tipicamente una catena alchilica; gruppo funzionale, che definisce la proprietà chimica desiderata. I gruppi funzionali sono scelti per legarsi al recettore, mentre lo spaziatore garantisce l’ordinamento delle molecole tramite interazioni deboli. Biosensori - A.A. 2022/2023 6  Modifica delle Superfici – È la più usata insieme alla modifica chimica. Il caso tipico è l’inserimento del recettore in una matrice che consente la diffusione dell’analita tenendo però fermo il recettore stesso. Il caso più diffuso è intrappolamento in membrane Intrappolamento o gel. È la più usata per le più grandi biomolecole complesse. Nel caso dell’intrappolamento, i recettori sono tipicamente inglobati all’interno di matrici (tipicamente organiche in forma di reticoli o gel), realizzate secondo diverse tecniche. L’intrappolamento può avvenire direttamente sulla superficie, includendo recettori e precursori della matrice organica e facendo avvenire la reazione che porta alla formazione dello strato finale, o depositando il materiale sulla superficie dopo l’intrappolamento delle biomolecole. Alternativamente, è possibile realizzare sulla superficie delle micro- o nano- strutture atte a contenere il recettore, ottenendo una sorta di adsorbimento fisico «potenziato». Biosensori - A.A. 2022/2023 7 La rilevazione di specie ioniche è fondamentale per le applicazioni biologiche. Il pH può essere rilevato con un recettore, gruppi buffer (tampone) che agiscono a variazioni di pH. Esistono gruppi chimici capaci di rispondere a variazioni locali del pH della soluzione, assorbendo ioni idrogeno dall’ambiente, assumendo carica netta positiva, deprotonando quando l’ambiente diventa basico. Normalmente le ammine sono molecole con un pK acido, il carbossilico o il carbossile tendono a essere neutre o deprotonate. Recettori biochimici - pH La rilevazione del pH di un fluido è una delle applicazioni più importanti in ambito fisiologico e biologico. Il pH è legato alla concentrazione di ioni idrogeno. NH2 La rilevazione di ioni idrogeno può essere effettuata per mezzo di specifici gruppi chimici in grado di fungere da buffer, controbilanciando COOH la variazione di pH assorbendo o rilasciando ioni H+ in soluzione. OH Questi gruppi chimici si trovano naturalmente sulla superficie di determinati materiali, come ad esempio gli ossidi metallici e certi polimeri, o possono essere integrati mediante modifica chimica della superficie del materiale. Biosensori - A.A. 2022/2023 8  Gli ionofori sono molecole che hanno componenti organiche, con gruppi inoranici con un certo grado di specie, sono in grado di prendere una specie chimica. Recettori biochimici – Specie ioniche La rilevazione di specie ioniche Ca2+ K+ può essere compiuta utilizzando delle molecole note come ionofori. Beauvericina Gli ionofori sono molecole Valinomicina organiche in grado di favorire il passaggio di una determinata specie ionica attraverso una membrana. NH4+ Sono normalmente integrati per via chimica o intrappolamento. Gramicidina (Na+) Enniatina Biosensori - A.A. 2022/2023 9 Recettori biochimici – Acidi nucleici Gli acidi nucleici di maggior interesse per applicazioni biosensoristiche sono il DNA e l’RNA. Per rilevare tali molecole, si sfruttano come recettori acidi nucleici (tipicamente DNA) e il principio di complementarietà. DNA: Molecola composta da due filamenti, legati tra loro attraverso legami idrogeno tra le basi azotate (adenina, citosina, timina e guanina) dei nucleotidi. Il principio di complementarietà prevede che l’adenina si leghi alla timina, e la citosina alla guanina. Data la sequenza di un filamento, esiste una e una sola sequenza complementare in grado di legarsi. RNA: Acido nucleico a singolo filamento, rispetto al DNA cambia una base azotata (uracile al posto della timina), ma resta valido il principio di complementarietà (citosina – guanina e adenina – uracile). Biosensori - A.A. 2022/2023 10 Recettori biochimici – Acidi nucleici Sfruttando il principio di complementarietà, singoli filamenti di DNA possono essere sfruttati come recettori (sonde) per altri singoli filamenti di DNA o per RNA (target). Se l’analita è un doppio filamento di DNA, è possibile ottenere la separazione tra i due filamenti (denaturazione) in diversi modi (tipicamente, aumentando la temperatura). RNA/DNA target Biosensori - A.A. 2022/2023 11  Recettori biochimici – Acidi nucleici Trasformare base azotata in recettore: modifica gruppu chimici es: ossidirili o ossigeni liberi che possono interagire facilmente con gruppi presenti in alcuni ossidi. Per legare un acido nucleico alla superficie, è possibile sfruttare i gruppi ossidrili terminali della catena nucleotidica. Questi possono essere utilizzati qualora la superficie da modificare presenti deli gruppi –OH, –NH2 o –COOH; qualora non fossero disponibili (es., su un metallo), è possibile modificare la superficie con un SAM. In alternativa, è possibile sintetizzare delle sonde aventi un gruppo terminale diverso: casi tipici sono quelli del gruppo tiolo (–HS), che si lega in maniera stabile con l’oro, o di OH HO gruppi aminici per il legame con superfici di OH HO ossidi. HS L’oro ha vantaggi come superifice: puro, biocompatibile, non tende a generare leghe, stabile nel tempo, poco reattivo. Biosensori - A.A. 2022/2023 12 Recettori biochimici – Acidi nucleici La moleocla col gruppo tiolo, aggancciata alla superficie, assume un ordinamento abbastanza specifico e preciso. Sonde di DNA modificate tramite gruppi chimici che ne consentono l’immobilizzazione chimica su una superficie sono a tutti gli effetti dei SAM! self assembled monolayed Le lunghe catene fosfate consentono a molecole di DNA vicine di interagire e ordinarsi sulla superficie. Biosensors and Bioelectronics - A.A. 2021/2022 13 Recettori biochimici – Acidi nucleici DNA and RNA sono acidi deboli, e come tali tendono a liberare ioni idrogeno nell’ambiente. In condizioni fisiologiche, i gruppi fosfati di ciascun nucleotide deprotonano. Come conseguenza, DNA e RNA sono molecole negative, con una carica netta pari a nq, dove n è il numero di nucleotidi per ciascun filamento e q è la carica elementare (1.6x10-19 C). Una proprietà spesso ignorata ma importante è una caratteristica dei nucleoitidi: la loro capacità di assumere una carica elettrica. Nel gruppo fosfato sono presenti gruppi OH, in condizioni fisiologiche gli idrogeni sono rilasciati dal gruppo fosfato. L’altro ossiegeno in forma anionica resta libero. Quindi ogni acido nucleico in condizioni fisiologiche, sono dotati di carica fissa negativa, cosa che può essere sfruttata per rilevarle in ambiente di misura. Biosensors and Bioelectronics Text - A.A. 2022/2023 14 Recettori biochimici – Proteine Le proteine sono i principali costituenti della classe dei peptidi, e la principale tipologia di biomolecola. Diverse proteine sono altamente selettive, grazie al particolare rapporto tra la loro reattività chimica e la conformazione spaziale. Le principali proteine utilizzate nei biosensori sono gli anticorpi e gli enzimi. Biosensori - A.A. 2022/2023 15  Esisteranno valore di pH in cui l’aminoacido in forma neutra lascia il suo posto a uno in forma polare. Recettori biochimici – Proteine I gruppi aminico e carbossilico di ciascun aminoacido hanno proprietà di buffer. In risposta al pH ambientale, questi tendono a rilasciare o catturare ioni idrogeno. Gli aminoacidi possono quindi essere molecole ioniche (positive o negative), o comportarsi da zwitterioni (ioni bipolari). Ulteriori cariche elettriche possono essere legate ai radicali. Biosensori - A.A. 2022/2023 16 Recettori biochimici – Proteine La carica associata a ciascun aminoacido dipende dal valore del pH della soluzione; Il valore del pH al quale un gruppo chimico cambia il suo stato di carica è detto pK. Biosensori - A.A. 2022/2023 17  Recettori biochimici – Proteine La carica della proteina è variabile, si può calcolare contando quante volte compare un amminoacido tra quelli carichi. La carica di una proteina può essere calcolata sulla base del numero di elementi in grado di assumere una configurazione di carica: Symbol Name pK 𝑄=𝑞 𝑁 + 𝛼𝐾 + 𝛽𝑅 + 𝛾𝐻 + 𝛿𝐷 + 𝜀𝐸 + 𝐶 Nterm Amine 8 Nterm e Cterm sono i gruppi amino e carbossilico finali K Lysine 10 della proteina. R Arginine 12 Per ogni radicale in rosso (carico positivo), la carica parziale può essere calcolata sulla base del suo pK e del H Histidine 6.5 pH dell’ambiente in base alla formula D Aspartate 4.4 10 𝑖= E Glutamate 4.4 1 + 10 Cterm Carboxylic 3.1 Per i radicali in blu (carichi negativi), invece 10 𝑖=− 1 + 10 Applications of ICTs to Molecular Biology 18 Recettori biochimici - Anticorpi Gli anticorpi sono proteine sintetizzate dai vertebrati e rappresentano una parte del Sistema immunitario. Fanno parte della categoria delle glicoproteine. Gli anticorpi sono composti da due identiche catene pesanti, legate tra di loro da un doppio legame disulfide, a cui si connettono due identiche catene leggere. Il dominio N-terminale delle due catene è detto regione variabile, essendo diversa tra anticorpo e anticorpo. È questa regione a definire la specificità dell’anticorpo rispetto a un determinato antigene. Biosensori - A.A. 2022/2023 19 Recettori biochimici - Anticorpi Un anticorpo è una sostanza che l’organismo riconosce come aliena. Gli antigeni contengono specifici gruppi chimici, chiamati epitopi. Gli anticorpi interagiscono con gli epitopi tramite la parte terminale della regione variabile, detta paratopo. Gli anticorpi capaci di interagire con un solo epitopo sono detti monovalenti, altrimenti sono polivalenti. Il complesso ottenuto dal legame tra antigene e anticorpo viene detto complesso immunologico. Biosensori - A.A. 2022/2023 20 Recettori biochimici - Anticorpi L’interazione tra antigene e anticorpo coinvolge diversi meccanismi: Le forze dominanti sono quelle idrofobiche: i gruppi apolari delle proteine contribuiscono ad allontanare le molecole d’acqua, consentendo l’avvicinamento tra antigene e anticorpo; Su una scala più corta (0.3-0.4 nm), le forze dominanti solo le interazioni deboli tipo Van der Waals; In alcuni casi, si ottiene la formazione di ponti idrogeno, su una distanza di 10 nm; Eventuali interazioni elettrostatiche intervengono su una scala maggiore, ma sono tipicamente secondarie. Biosensori - A.A. 2022/2023 21 Recettori biochimici - Anticorpi Esistono diversi approcci per l’immobilizzazione di anticorpi su una superficie: Immobilizzazione covalente, ottenuta facendo reagire gruppi funzionali dell’anticorpo con gruppi chimici presenti (o indotti) sulla superficie; Immobilizzazione orientata, ottenuta utilizzando delle specie chimiche in grado di legarsi alla catena pesante o alle regioni variabili, fornendo all’anticorpo una specifica direzione; Immobilizzazione non-covalente, ottenuta per adsorbimento fisico sulla superficie; Immobilizzazione specifica, ottenuta introducendo sulla superficie un peptide in grado di legarsi alla catena pesante dell’anticorpo, Immobilizzazione tramite DNA o PNA, che sfruttano queste due specifiche molecole come ponte tra anticorpo e superficie, Immobilizzazione tramite anticorpo ricombinante, nel quale è introdotta la modifica che rende possibile l’immobilizzazione sulla superficie scelta. Biosensori - A.A. 2022/2023 22 Recettori biochimici - Enzimi 𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 ⇌ 𝐸𝑃 ⇌ 𝐸 + 𝑃 Gli enzimi sono proteine che realizzano funzioni catalitiche, aumentando il rate di reazione dalle 103 alle 1020 volte. La reazione enzimatica consiste nella cattura di un reagente (substrato) da parte dell’enzima. Il complesso enzima- substrato da in seguito origine a un prodotto. Affinché avvenga la reazione catalitica, la maggior parte degli enzimi necessita di specifici gruppi detti cofattori, che possono essere altre proteine (co-enzimi) o ioni metallici. Biosensori - A.A. 2022/2023 23 Recettori biochimici - Enzimi Biosensori - A.A. 2022/2023 24 Recettori biochimici - Enzimi Esistono diverse strategie per l’immobilizzazione di enzimi sulla superficie, simili a quelle già viste per gli anticorpi. Nella maggior parte delle applicazioni pratiche, per via delle dimensioni degli enzimi, si sfrutta l’intrappolamento degli enzimi in matrici organiche, o per reticolazione degli stessi enzimi per formare una membrana sensibile. Biosensori - A.A. 2022/2023 25 Recettori biochimici – organelli, cellule e tessuti Le proteine, e in particolare gli enzimi, sono estremamente suscettibili alle condizioni ambientali. Se si vuole studiare il comportamento di un enzima in condizioni fisiologiche, lo studio di un singolo enzima in vitro può essere poco rappresentativo. I sensori che sfruttano come elemento recettore un sistema più complesso, come un organello, una cellula o parti di tessuto, consentono di studiare l’attività del recettore in modo più vicino a quanto accade in vivo. Il loro utilizzo è inoltre consigliabile qualora si voglia un’informazione più attendibile dell’effetto dell’analita su un organismo complesso (ad esempio, quando si studiano tossine). Biosensori - A.A. 2022/2023 26  Isoterma di Langmuir L’interazione tra analita e recettore segue il cosiddetto modello di Langmuir per l’adsorbimento di specie chimiche alla superficie. Tale modello assume che la cattura avvenga secondo una dinamica del primo ordine, 𝑅 + 𝐴 ⇄ 𝑅𝐴 Nella precedente equazione, [R] rappresenta la concentrazione dei recettori, [A] la concentrazione dell’analita e [RA] la concentrazione finale del complesso che risulta dalla cattura. All’equilibrio (d[RA]/dt = 0), 𝑘 𝑅𝐴 𝑘 𝑅 𝐴 =𝑘 𝑅𝐴 ⇒ 𝐾 = = 𝑘 𝑅 [𝐴] Biosensori - A.A. 2022/2023 27  Isoterma di Langmuir Durante la reazione, si avranno sia recettori occupati che recettori liberi. Introducendo la concentrazione totale dei recettori [Rtot] =  [R]+[RA] e la ricopertura superficiale  = [RA]/[Rtot], la precedente 1 equazione diviene 𝑘 𝑅 − 𝑅𝐴 𝐴 = 𝑘 𝑅𝐴 𝐾 1−Γ 𝐴 =Γ 0.5 𝐾 𝑇 =Γ 1+𝐾 𝐴 𝐾 𝐴 Γ= 1+𝐾 𝐴 1/Ka [A] Questa rappresenta una «curva di taratura» normalizzata (massima ampiezza = 1), normalmente rappresentata in funzione di [A] or log[A]. Biosensori - A.A. 2022/2023 28  UNIVERSITÀ DI CAGLIARI DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMEDICHE LAUREA TRIENNALE IN BIOTECNOLOGIE Biosensori Ottici Stefano Lai, PhD [email protected] Sono la maggior parte dei sensori a livello commerciale. Trasduzione ottica La trasduzione ottica è la più semplice e utilizzata. Rappresenta generalmente una trasduzione indiretta, in quanto è necessario fornire le molecole di un gruppo chimico (marcatore) in grado di generare una reazione «visibile». Le principali trasduzioni ottiche sono quella colorimetrica, e quella a fluorescenza. Biosensori - A.A. 2022/2023 13  Tecniche colorimetriche A + R (A+R → P) Le tecniche colorimetriche consistono P nell’inserimento di un marcatore che, in seguito a una reazione, sia in grado di analita analita reagire alla luce visibile con un cambio di colore. La reazione può essere una comune E P reazione chimica S Fosfato + ammonio molibdato + acido ascorbico → prodotto di colore blu analita analita Più comunemente, si sfruttano reazioni enzimatiche, che sono più selettive. X-Gluc + b-glucoronidase → prodotto NP NP NP In alternativa, è possibile utilizzare dei marcatori la cui coalescenza produca un analita analita analita cambio di colore macroscopico, come ad esempio le nanoparticelle metalliche. Biosensori - A.A. 2022/2023 14 Tecniche a fluorescenza I processi di assorbimento ed emissione sono spesso correlati: l’energia assorbita da un materiale può essere rilasciata sempre sotto forma di radiazione elettromagnetica. In genere, le due radiazioni emesse non sono identiche, perché parte dell’energia assorbita può essere rilasciata in altro modo (ad esempio, per via di vibrazioni o urti). Un materiale in grado di assorbire una radiazione a una determinata lunghezza d’onda e di emettere, di conseguenza, una radiazione a una lunghezza d’onda diversa viene detto fluorescente. Molecole fluorescenti sono dette fluorocromi. Biosensori - A.A. 2022/2023 15 Tecniche a fluorescenza Un fluorocromo è quindi dotato di uno spettro di assorbimento, e da uno spettro di radiazione che può essere emessa (spettro di emissione). I due spettri devono essere il meno sovrapposti possibile. La fluorescenza è un fenomeno che decade velocemente nel tempo (nell’ordine dei nanosecondi), quando la sorgente di eccitazione è rimossa. Biosensori - A.A. 2022/2023 16 Traduzione ottica Tecniche a fluorescenza CIANINA-3 (Cy3) Biosensori - A.A. 2022/2023 17 Traduzione ottica Förster Resonance Energy Transfer (FRET) e Quenching La FRET consiste nel trasferimento di energia tra due fluorocromi, scelti in modo che lo spettro di emissione del primo (donore) sia parzialmente sovrapposto allo spettro di assorbimento del secondo (accettore). Quando donore e accettore sono vicini, è possibile che il primo trasferisca energia al secondo invece di emettere. In questo caso si ottiene un segnale FRET, ovvero l’emissione di radiazione da parte dell’accettore dovuta all’eccitazione del donore. Il segnale FRET è più «pulito» del segnale a fluorescenza di un singolo fluorocromo, in quanto l’eccitazione è fuori dalla banda di emissione dell’accettore. Un simile meccanismo è quello dello smorzamento (quenching): in questo caso l’accettore è una molecola (quencher) che assorbe energia dal donore senza emettere radiazione. In questo modo, si osserva la scomparsa del segnale fluorescente in presenza del quencher. Biosensori - A.A. 2022/2023 18  Immunosensori ottici Immunosensori: sfruttando una reazione di affinità consente la rilevazione di proteine. Gli immunosensori studiano la formazione di complessi antigene-anticorpo, detti anche complessi immunologici. Le tecniche standard di indagine immunologica richiedono tipicamente (con eccezioni minime) l’utilizzo di marcatori, che consentano di rilevare l’avvenuta formazione del complesso immunologico. Allo stato dell’arte, sono principalmente utilizzati marcatori fluorescenti, o enzimi in grado di generare delle reazioni ottiche (colorimetriche). Si parla, nei due casi, di immunofluorescenza o di ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Biosensori - A.A. 2022/2023 19 Tecniche a immunofluorescenza reporter Le tecniche a immunofluorescenza sono principalmente distinte in: Diretta Dirette: l’analita è immobilizzato su una superficie, e si introducono delle molecole marcate (reporter): in analita presenza dell’analita, si ottiene il fissaggio della fluorescenza sul reporter substrato. analita Indirette: si utilizza un recettore immobilizzato per catturare l’analita dalla soluzione di misura; il reporter Indiretta si lega quindi all’analita. Biosensori - A.A. 2022/2023 20  Tecniche a immunofluorescenza O in un caso il reporter compete con l’analita per interagire con la superficie, nel sencondo caso non c’è questa competizione. Le tecniche indirette sfruttano tipicamente un anticorpo come recettore, e sono quindi utilizzati per rilevare antigeni nella soluzione di misura. Queste possono essere ulteriormente distinte in: Competitive, se si sfruttano degli Competitiva Non competitiva antigeni marcati; Non-competitive (sandwich), se si utilizza un secondo anticorpo marcato. Biosensori - A.A. 2022/2023 21 Tecniche di immunofluorescenza competitive Fluorescenza Gli anticorpi sono esposti alla soluzione di misura, alla quale viene aggiunta una concentrazione nota di un antigene specifico agli anticorpi recettori e marcato con una molecola fluorescente. Se nella soluzione di misura è presente una bassa concentrazione di antigene, sarà probabile che si venga a formare un complesso tra anticorpo e antigene marcato: il segnale di fluorescenza sarà quindi intenso. Se nella soluzione di misura è presente una elevata concentrazione di antigene, allora sarà dominante la presenza di complessi immunologici non marcati, con una conseguente bassa emissione a fluorescenza. [Ag] Il riconoscimento positivo è quindi legato alla diminuzione del segnale a fluorescenza. Biosensori - A.A. 2022/2023 22 Tecniche di immunofluorescenza non competitive Si espongono gli anticorpi recettori Fluorescenza alla soluzione di misura; Si inserisce poi una soluzione contenente una seconda specie di anticorpi, progettati per connettersi a un diverso epitopo dell’antigene in esame e dotati di marcatore fluorescente. Il marcatore viene immobilizzato solo se l’antigene era presente, ed era stato catturato dall’anticorpo recettore. In questo caso, una rilevazione positiva è associata ad un elevato [Ag] segnale fluorescente. Biosensori - A.A. 2022/2023 23 Microarray di proteine I principi dell’immunofluorescenza possono essere sfruttati nella tecnica nota come microarray di proteine. Gli anticorpi (o gli antigeni) sono immobilizzati su un supporto (chip) in una specifica posizione (spot), in modo da consentire la rilevazione contemporanea e parallela di diversi antigeni. I microarray di proteine possono essere utilizzati per la rilevazione di altre proteine, non necessariamente per applicazioni immunologiche: in questo caso si parla di functional protein microarrays. Biosensori - A.A. 2022/2023 24 Microarray di proteine I chip per la microarray di proteine hanno dimensioni ridotte (dai mm2 ai cm2) ma la risoluzione degli spot può essere elevata (pochi micrometri). Normalmente, sono coinvolti diversi fluorocromi, in modo da consentire analisi differenziali. L’eccitazione dei diversi fluorocromi, la rilevazione dei segnali a fluorescenza e la raccolta dei dati vengono eseguiti mediante opportuni sistemi, detti scanner a fluorescenza. Biosensori - A.A. 2022/2023 25  basso costo quando il numero di proteine è elevato: es: 1 centesimo a proteina se hai 10.000 proteine, quindi anche per solo 1 ti fa pagare 10.000 Microarray di proteine Gli scanner per microarray sono un tipico esempio di strumento di laboratorio: per quanto (ormai) decisamente compatti, sono degli strumenti da tavolo che richiedono un computer e un software dedicato per la rilevazione dell’immagine. Il costo di questa strumentazione varia nell’ordine di grandezza dei 10-100k€. Biosensori - A.A. 2022/2023 26 ELISA L’acronimo ELISA sta per Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, e rappresenta una delle principali tecnologie di indagine immunologica. In un kit ELISA, si sostituisce il marcatore fluorescente con un enzima. Se l’enzima è bloccato sulla superficie di un supporto (tipicamente, un pozzetto in una piastra) in seguito alla formazione del complesso immunologico tra l’anticorpo (antigene) al quale era bloccato e il corrispondente recettore, aggiungendo un opportuno substrato è possibile ottenere una reazione catalitica che può essere sfruttata per rilevare l’avvenuta reazione immunologica. Le reazioni catalitiche utilizzate determinano tipicamente una variazione di colore del liquido di misura. Biosensori - A.A. 2022/2023 27 ELISA Esistono diversi tipi di approcci ELISA: Diretto: si introduce la soluzione di test nel pozzetto; la reazione viene rilevata introducendo nel pozzetto un anticorpo specifico per l’antigene di interesse marcato con un enzima. Si sfrutta se l’analita di interesse è l’antigene. Indiretto: si modifica la superficie dei pozzetti con un antigene affine a un analita (anticorpo primario) che vuole essere rivelato; si introduce la soluzione di test e un anticorpo secondario (marcato con enzima) affine all’anticorpo primario; Sandwich: si modifica la superficie dei pozzetti con un anticorpo affine all’analita (antigene) che vuole essere rivelato; si introduce la soluzione di test e un reporter, che può essere un solo anticorpo modificato con un enzima (e affine a un diverso epitopo dell’antigene di interesse) o un complesso di un anticorpo primario e uno secondario marcato. Competitivo: Si modifica la superficie del pozzetto con l’antigene (analita) da testare. Si introduce nel pozzetto una soluzione contenente un anticorpo specifico per l’analita, dotato di marcatura con enzima, insieme a un antigene inibitore. Se l’anticorpo si lega all’antigene inibitore, non potrà legarsi alla superficie del pozzetto e verrà rimosso dal lavaggio. L’intensità del segnale è inversamente proporzionale alla concentrazione di inibitori. Si modifica la superficie del pozzetto con degli anticorpi, che fungono da recettori. Si introduce quindi nei pozzetti la soluzione contenente gli analiti e degli antigeni marcati con enzima e affini ai recettori. L’intensità del segnale colorimetrico è inversamente proporzionale alla concentrazione dell’analita (più forte il segnale colorimetrico, meno analita era presente per legarsi all’anticorpo). Biosensori - A.A. 2022/2023 28 Un dispositivo «ELISA» I test immunologici a flusso laterale utilizzati per rilevare lo stato di gravidanza sono un semplice esempio in cui viene sfruttato il principio ELISA per la rilevazione dell’ormone gonadrotropina corionica umana (hCG) nelle urine. L’area di reazione contiene gli anticorpi specifici per l’hCG, modificati con un eznima. Quando l’area i test viene a contatto con l’urina, gli anticorpi si staccano dall’area di reazione e fluiscono con l’urina verso l’area di test. Nell’area di test sono presenti due bande: una banda di rilevazione, contenente un altro anticorpo specifico per l’hCG (su un diverso epitopo) e una banda di controllo, contenente un anticorpo secondario per l’anti-hCG. Il test è positivo solo se gli anti-hCG catturano gli hCG, e possono quindi immobilizzare l’enzima sulla banda di test; la banda di controllo deve essere inoltre attivata, dimostrando che gli anti-hGC sono stati rilasciati dall’area di reazione. Biosensori - A.A. 2022/2023 29 Kit ELISA Tipicamente, la tecnologia ELISA è venduta in kit contenente tutti i diversi