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Programma del corso (NUOVO) Introduzione al corso; Introduzione ai sensori biochimici: Introduzione al concetto di sensore e principali figure di merito. Rilevazione diretta e indiretta, marcata e non marcata. Il sensore biochimico come principale caso di studio: pri...

Programma del corso (NUOVO) Introduzione al corso; Introduzione ai sensori biochimici: Introduzione al concetto di sensore e principali figure di merito. Rilevazione diretta e indiretta, marcata e non marcata. Il sensore biochimico come principale caso di studio: principali elementi costitutivi. Approcci allo sviluppo di biosensori. Biorecettori e Analiti: richiami sulle caratteristiche delle principali biomolecole di interesse per lo sviluppo di sensori biochimici; tecniche di realizzazione dello strato di recettori (adsorbimento fisico, modifica chimica e intrappolamento). Sensori Biochimici (classificati per tipologia di trasduzione): Sensori ottici: proprietà ottiche dei materiali, fluorescenza, FRET e quenching. Applicazioni allo stato dell’arte (immunofluorescenza, ELISA, DNA microarray, PCR e real-time PCR). Sensori ottici di nuova generazione: Lab-on-Chip e SPR. Sensori elettrochimici: richiami di circuiti elettrici di base; elementi di elettrochimica (reazioni redox, celle elettrochimiche, meccanismi e modelli per le celle elettrochimiche). Biosensori elettrochimici allo stato dell’arte: sensori potenziometrici a membrana ionoselettiva, sensori enzimatici (potenziometrici, amperometrici di prima e seconda generazione, conduttometrici). Nuovi approcci alla sensoristica biochimica elettrochimica: sensori enzimatici di terza generazione, immunosensori amperometrici, tecniche voltammetriche e impedenzometriche e loro applicazione nei biosensori. Sensori elettronici: introduzione ai transistor: tecnologia e principio di funzionamento. Dal MOSFET all’ISFET e suo utilizzo come sensore di pH. Dall’ISFET al BioFET per la rilevazione di bioreazioni. Cenni a nuove tecnologie per lo sviluppo di biosensori elettronici. Biosensori - A.A. 2023/2024 9  UNIVERSITÀ DI CAGLIARI DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMEDICHE LAUREA TRIENNALE IN BIOTECNOLOGIE Introduzione a Sensori e Biosensori Stefano Lai, PhD [email protected]  Sensore Un sensore è un apparato in grado di convertire una grandezza fisica in ingresso in una grandezza fisica in uscita, normalmente più conveniente (tipicamente, una grandezza elettrica). È l’elemento che interfaccia un sistema di misura con il misurando. Biosensori - A.A. 2023/2024 2  Sensori e Trasduttori trasduttore Un trasduttore è un dispositivo in grado di convertire una forma di energia in un’altra. Che differenza c’è tra un sensore e un trasduttore? Un trasduttore è un sistema più complesso, che comprende uno o più sensori ma anche altri blocchi di interfacciamento. La differenza è sottile, e spesso i termini sono usati come sinonimo. Biosensori - A.A. 2023/2024 3  Sensori e Trasduttori L’occhio: Iride e pupilla fungono da interfaccia di ingresso, regolando la luce in ingresso e focalizzandola sulla retina; I fotorecettori sulla retina (e in particolare sulla macula) fungono da sensore, in grado di convertire lo stimolo luminoso in segnali elettrici; Il nervo ottico convoglia i sensore segnali elettrici verso il Interfaccia di ingresso cervello, dove vengono elaborati per generare l’immagine. L’occhio quindi è un trasduttore! trasduttore Biosensori - A.A. 2023/2024 4  Caratterizzazione di un sensore Un sensore può essere considerato un blocco che Input Sensore Output converte uno stimolo in ingresso in uno stimolo di uscita. Caratterizzazione di un Output Output sensore: Dinamica: variazione dell’uscita nel tempo; Statica: variazione dell’uscita rispetto tempo Input all’ingresso. Biosensori - A.A. 2023/2024 5  Risposta dinamica Idealmente, il segnale di uscita del sensore è generato solo dopo Sensore Output l’applicazione dell’ingresso, mentre prima l’uscita resta a zero. Output In pratica, è necessario considerare le sorgenti di rumore presenti nel sistema: tempo Biosensori - A.A. 2023/2024 6  Risposta dinamica Idealmente, il segnale di uscita del sensore è generato solo dopo Sensore Output l’applicazione dell’ingresso, mentre prima l’uscita resta a zero. Output In pratica, è necessario considerare le sorgenti di rumore presenti nel sistema: tempo Biosensori - A.A. 2023/2024 6  Risposta dinamica Idealmente, il segnale di uscita del sensore è generato solo dopo Input Sensore Output l’applicazione dell’ingresso, mentre prima l’uscita resta a zero. Output In pratica, è necessario considerare le sorgenti di rumore presenti nel sistema: tempo Biosensori - A.A. 2023/2024 6  Risposta dinamica rumore Idealmente, il segnale di uscita del sensore è generato solo dopo Sensore Output l’applicazione dell’ingresso, mentre prima l’uscita resta a zero. Output In pratica, è necessario considerare le sorgenti di rumore presenti nel sistema: Rumore casuale proveniente dal Sistema di misura e dal sensore; Rumore ambientale (es., cambio di temperatura, di luce, modifiche nel pH tempo della soluzione). Biosensori - A.A. 2023/2024 6  Risposta dinamica rumore Idealmente, il segnale di uscita del sensore è generato solo dopo Sensore Output l’applicazione dell’ingresso, mentre prima l’uscita resta a zero. Output In pratica, è necessario considerare le sorgenti di rumore presenti nel sistema: Rumore casuale proveniente dal Sistema di misura e dal sensore; Rumore ambientale (es., cambio di temperatura, di luce, modifiche nel pH tempo della soluzione). Biosensori - A.A. 2023/2024 6  Risposta dinamica rumore Idealmente, il segnale di uscita del sensore è generato solo dopo Input Sensore Output l’applicazione dell’ingresso, mentre prima l’uscita resta a zero. Output In pratica, è necessario considerare le sorgenti di rumore presenti nel sistema: Rumore casuale proveniente dal Sistema di misura e dal sensore; Rumore ambientale (es., cambio di temperatura, di luce, modifiche nel pH tempo della soluzione). Biosensori - A.A. 2023/2024 6  Risposta dinamica – effetto del rumore Output La rimozione del rumore è fondamentale per una corretta caratterizzazione del sensore. Un rumore casuale può essere rimosso compiendo una media dei campioni acquisiti, durante l’acquisizione o sui dati salvati. t In alternativa, è possibile utilizzare un dispositivo di riferimento, identico al sensore ma non sensibile all’analita di riferimento, e considerando come uscita la differenza (o il rapporto) delle due uscite. Biosensori - A.A. 2023/2024 7 Risposta dinamica – Drift Oltre al rumore, è possibile che il segnale di uscita vari lentamente e con costanza in modo totalmente aspecifico: questo effetto viene chiamato drift (deriva). La presenza di fenomeni di drift può dipendere da fattori tecnologici o dalla variazione (lenta e costante) di parametri nell’ambiente di misura. L’impatto del drift sulla misura dipende dall’applicazione e in particolare dal tempo caratteristico del drift: Drift continuo ed evidente nel breve periodo può essere correlato a variazioni nell’ambiente di misura; se sistematico, si può compensare. Se è lento, e produce una variazione di segnale molto piccola, può essere trascurato. In misure molto lunghe, potrebbe essere sintomo di una degradazione del sensore. Biosensori - A.A. 2023/2024 8  Dalla risposta dinamica alla risposta statica Output Output Input t Input La risposta dinamica è forse la forma di caratterizzazione più intuitiva. Se l’ingresso viene modificato in intensità, l’uscita del sensore si modifica, ad esempio raggiungendo ampiezze maggiori. Considerando l’intensità dell’uscita per diversi valori dell’ingresso a un dato istante di tempo (tipicamente, quando il valore dell’uscita è stabile), si ottiene la caratteristica statica del sensore, nota anche come funzione di trasferimento o curva di taratura. Biosensori - A.A. 2023/2024 9  Parametri caratteristici di un sensore A seconda della caratterizzazione adottata, esistono diversi parametri di interesse (caratteristiche metrologiche) che possono essere ricavati per un sensore. Caratteristica dinamica: Tempo di risposta; Tempo di assestamento; Risoluzione. Caratteristica statica: Campo di misura (operating range); Linearità; Sensibilità; Accuratezza e Precisione; Isteresi; Ripetibilità e Riproducibilità; Stabilità. Limite di rilevazione. Biosensori - A.A. 2023/2024 10 Risposta dinamica – Tempo di risposta Il tempo di risposta è il periodo di tempo necessario al sensore per produrre un’uscita apprezzabile dal momento dell’applicazione dell’ingresso. Convenzionalmente, è il tempo necessario ad osservare una variazione del segnale di uscita pari al 95% della massima risposta osservata. In caso di sensori reversibili, si considera un tempo di risposta anche per quel che concerne la scomparsa del segnale di uscita. Il tempo di risposta nelle due fasi è normalmente differente. Biosensori - A.A. 2023/2024 11 Risposta dinamica – tempo di assestamento In un sensore, il tempo di assestamento è definite come il tempo necessario ad ottenere una risposta stabile dopo l’applicazione del sistema. La risposta viene considerate stabile quando possibili oscillazioni dell’uscita non superano una certa banda di errore. Biosensori - A.A. 2023/2024 12  Risposta dinamica - risoluzione Output Risoluzione: la minima variazione nella grandezza di ingresso che produce una variazione rilevabile nell’uscita del sensore. [A]=x Nell’esempio possiamo affermare che la risoluzione del [A]=x sensore rispetto al parametro di ingresso (concentrazione di [A]=x [A]=x un certo analita A) è 2x, perché la prima risposta rilevabile del sensore è ottenuta solo dopo il secondo inserimento di A (la concentrazione è cumulativa). tempo Biosensori - A.A. 2023/2024 13  Risposta dinamica - risoluzione Output Risoluzione: la minima variazione nella grandezza di ingresso che produce una variazione rilevabile nell’uscita del sensore. [A]=x Nell’esempio possiamo affermare che la risoluzione del [A]=x sensore rispetto al parametro di ingresso (concentrazione di [A]=x [A]=x un certo analita A) è 2x, perché la prima risposta rilevabile del sensore è ottenuta solo dopo il secondo inserimento di A (la concentrazione è cumulativa). La risoluzione è negativamente influenzata dal rumore: all’aumentare del rumore, risposte del sensore troppo «piccole» possono risultare del tutto oscurate! tempo Biosensori - A.A. 2023/2024 13  Risposta statica – Campo di misura e linearità Output Il campo di misura identifica l’intervallo di valori dell’ingresso che possono essere misurati con il sensore, ovvero per i quali è possibile trovare un’univoca identità tra il valore dell’ingresso e un valore dell’uscita. Regione di Oltre un certo valore dell’ingresso, l’uscita entra in saturazione una regione di saturazione. La caratteristica ideale di un sensore è lineare, ma nella pratica nessuna caratteristica è perfettamente lineare: in prossimità della parte terminale del campo di misura (fondo scala), si raggiunge un intervallo non lineare. Il sensore viene preferenzialmente utilizzato in una Input regione del campo di misura assimilabile a una Campo di misura retta: questo viene chiamato campo lineare. Biosensori - A.A. 2023/2024 14  Risposta statica – Campo di misura e linearità Output Il campo di misura identifica l’intervallo di valori dell’ingresso che possono essere misurati con il sensore, ovvero per i quali è possibile trovare un’univoca identità tra il valore dell’ingresso e un valore dell’uscita. Regione di Oltre un certo valore dell’ingresso, l’uscita entra in saturazione una regione di saturazione. La caratteristica ideale di un sensore è lineare, ma nella pratica nessuna caratteristica è perfettamente lineare: in prossimità della parte terminale del campo di misura (fondo scala), si raggiunge un intervallo non lineare. Campo lineare Il sensore viene preferenzialmente utilizzato in una Input regione del campo di misura assimilabile a una Campo di misura retta: questo viene chiamato campo lineare. Biosensori - A.A. 2023/2024 14  Risposta statica - Sensibilità Output Formalmente, si definisce sensibilità del sensore la derivata della risposta statica, 𝑑 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑡à = 𝑑(𝐼𝑛𝑝𝑢𝑡) In un sensore dotato di caratteristica lineare, questa derivata ha un valore unico, corrispondente alla pendenza della caratteristica stessa. Nel caso di una caratteristica «reale», esistono diverse sensibilità; in parti della curva non lineari, si sensibilità compiono delle linearizzazioni. Di norma, la sensibilità dichiarata deve essere quindi Campo linearizzato correlata a un preciso intervallo di valori dell’ingresso. Campo lineare Convenzionalmente, le sensibilità dichiarata è riferita al campo lineare del sensore. Input Biosensori - A.A. 2023/2024 15  Risposta statica - Precisione Output Abbiamo visto che la caratteristica statica è ottenuta come interpolazione di punti sperimentali. Affinché l’interpolazione sia significativa, è importante avere un numero significativo di punti sperimentali p*, ma anche ripetere un numero significativo di volte ciascuna misura. I valori su cui si compie l’interpolazione sono quindi una media di diversi valori: 1 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ = 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ 𝑁 Le bande di errore di ciascun punto sperimentale sono date dalla deviazione standard delle diverse misure, ∑ 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ − 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ 𝜎 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 = 𝑁−1 Questo parametro definisce inoltre la precisione del sensore, ovvero la sua capacità di fornire un’uscita sempre simile a se stessa quando soggetto allo stesso ingresso. Input Biosensori - A.A. 2023/2024 16  Risposta statica - Precisione Output Abbiamo visto che la caratteristica statica è ottenuta come interpolazione di punti sperimentali. Affinché l’interpolazione sia significativa, è importante avere un numero significativo di punti sperimentali p*, ma anche ripetere un numero significativo di volte ciascuna misura. I valori su cui si compie l’interpolazione sono quindi una media di diversi valori: 1 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ = 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ 𝑁 Le bande di errore di ciascun punto sperimentale sono date dalla deviazione standard delle diverse misure, ∑ 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ − 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑝∗ 𝜎 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 = 𝑁−1 Questo parametro definisce inoltre la precisione del sensore, ovvero la sua capacità di fornire un’uscita sempre simile a se stessa quando soggetto allo stesso ingresso. Input Biosensori - A.A. 2023/2024 16  Risposta statica - accuratezza Standard Output Avere un sensore preciso implica che il dato misurato sia rappresentativo del vero valore del misurando? La risposta è no! Il fatto che il valore dell’uscita sia sempre simile a se stesso non vuol dire che il valore sia giusto. Il massimo scostamento dell’uscita del sensore dal valore vero del misurando è definite dall’accuratezza. Per verificare l’accuratezza del sensore, è necessario avere a disposizione uno standard, ovvero una tecnica con cui il misurando è convenzionalmente misurato. Input Biosensori - A.A. 2023/2024 17 Risposta statica - accuratezza Avere un sensore preciso implica che il dato misurato sia rappresentativo del vero valore del misurando? La risposta è no! Il fatto che il valore dell’uscita sia sempre simile a se stesso non vuol dire che il valore sia giusto. Il massimo scostamento dell’uscita del sensore dal valore vero del misurando è definite dall’accuratezza. Per verificare l’accuratezza del sensore, è necessario avere a disposizione uno standard, ovvero una tecnica con cui il misurando è convenzionalmente misurato. Per verificare l’accuratezza si considera il coefficiente di correlazione, ∑ 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 − 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 − 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 𝑟= ∑ 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 − 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 ∑ 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 − 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 Un coefficiente di correlazione prossimo a 1 implica che, a parità di condizioni sperimentali, l’uscita del sensore è paragonabile a quella dello standard. L’operazione di correlazione tra sensore e standard prende il nome di calibrazione. Biosensori - A.A. 2023/2024 17  Precisione vs. Accuratezza La precisione è un indice della variabilità dei dati: piccolo errori casuali nella misura implicano Phil «The Power» Ispettore Kemp una precisione elevate Taylor, 16 volte del sensore. Piccoli errori sistematici e Piccoli errori casuali, ma campione del mondo L’accuratezza definisce casuali: preciso e accurato grande errore sistematico: di freccette preciso, ma non accurato quanto il valore misurato è vicino al valore reale. Piccoli errori sistematici implicano un’elevate accuratezza. Idealmente, un sensore Errori casuali elevate ma Stefano Lai, PhD Grandi errori sistematici e Stefano Lai, PhD deve possedere errori sistematici ridotti: casuali: non preciso e non dopo 8 birre entrambe queste accurato, ma non preciso accurato proprietà. Biosensori - A.A. 2023/2024 18 Calibrazione vs. Taratura: attenti al false friend! L’operazione di taratura consente di ottenere la caratteristica statica, e quindi di ricavare le caratteristiche metrologiche del sensore. L’operazione di calibrazione consente invece di verificare (ed eventualmente migliorare) l’accuratezza del sensore. In inglese, taratura è tradotto con calibration! Nei libri inglesi, quindi, è facile imbattersi nel termine calibration curve, che corrisponde alla curva di taratura. L’equivalente inglese di calibrazione è invece adjustment. Biosensori - A.A. 2023/2024 19  Risposta statica – Limite di rilevazione Output Il punto (0,0) fa parte della curva di taratura? NO! Anche se l’ingresso è zero, l’uscita del sensore non è zero per via delle sorgenti di rumore. La minima risposta del sensore distinguibile dal semplice rumore è detto limite di rilevazione (limit of detection., LoD). Input Biosensori - A.A. 2023/2024 20 Risposta statica – limite di rilevazione In assenza di ingresso, N misure del sensore produrranno dei valori dell’uscita Outputblank distribuiti secondo una curva gaussiana, con massimo nel valore medio della misura e dotata di deviazione standard blank. Output Biosensori - A.A. 2023/2024 21 Risposta statica – limite di rilevazione In assenza di ingresso, N misure del sensore produrranno dei valori dell’uscita Outputblank distribuiti secondo una curva gaussiana, con massimo nel valore medio della misura e dotata di deviazione standard blank. 𝜎 Outputblank Output Biosensori - A.A. 2023/2024 21 Risposta statica – limite di rilevazione In assenza di ingresso, N misure del sensore produrranno dei valori dell’uscita Outputblank distribuiti secondo una curva gaussiana, con massimo nel valore medio della misura e dotata di deviazione standard blank. 𝜎 Ripetendo le N misure applicando il più piccolo degli ingressi che può essere controllato in fase sperimentale, l’uscita del sensore assumerà dei valori distribuiti secondo una curva gaussiana, centrata nel valore medio. Questo prende il nome di limite di quantificazione (Limit of Quantification, LoQ). Se le due gaussiane non sono sovrapposte, la risposta del sensore sarebbe Outputblank LoQ Output sempre distinguibile dal rumore. In caso di sovrapposizione, possono esistere condizioni in cui una risposta effettiva del sensore venga scambiata per rumore (falso negativo), o in cui il rumore venga scambiato per una risposta valida (falso positivo). Biosensori - A.A. 2023/2024 21 Risposta statica – limite di rilevazione In assenza di ingresso, N misure del sensore produrranno dei valori dell’uscita Outputblank distribuiti secondo una curva gaussiana, con massimo nel valore medio della misura e dotata di deviazione standard blank. 𝜎 Ripetendo le N misure applicando il più piccolo degli ingressi che può essere controllato in fase sperimentale, l’uscita del sensore assumerà dei valori distribuiti secondo una curva gaussiana, centrata nel valore medio. Questo 𝑘𝜎 prende il nome di limite di quantificazione (Limit of Quantification, LoQ). Se le due gaussiane non sono sovrapposte, la risposta del sensore sarebbe Outputblank LoD LoQ Output sempre distinguibile dal rumore. In caso di sovrapposizione, possono esistere condizioni in cui una risposta effettiva del sensore venga scambiata per rumore (falso negativo), o in cui il rumore venga scambiato per una risposta valida k sovrapposizione (falso positivo). Definiamo il LoD come il punto di sovrapposizione tra le due gaussiane, 1 31,73% 𝐿𝑜𝐷 = 𝑂𝑢𝑡𝑝𝑢𝑡 + 𝑘𝜎 2 4,55% Il valore del LoD dipende da k: più questo è alto, inferiore è la sovrapposizione 3 0,27% considerata accettabile e quindi più accurato sarà il sensore. Nella pratica, non si utilizzano valori di k inferiori a 2. Biosensori - A.A. 2023/2024 21  Risposta statica - Isteresi Output Idealmente, un l’uscita di un sensore dipende unicamente dall’ingresso applicato. Se la “storia” del sensore ne modifica la funzione di trasferimento mostra un’isteresi, ovvero una mancata sovrapposizione delle funzioni di trasferimento Un caso tipico di isteresi è quello relative al “verso” di applicazione dell’ingresso: quando l’intensità dell’ingresso è applicata in senso ascendente o discendente, l’uscita del sensore è differente. Input Biosensori - A.A. 2023/2024 22  Risposta statica – altri parametri Ripetibilità: attitudine del sensore a fornire valori dell’uscita per un dato valore dell’ingresso con elevata precisione, a parità di condizioni di lavoro (stesso operatore e condizioni di utilizzo) nel breve periodo. Riproducibilità: attitudine del sensore a fornire valori dell’uscita per un dato valore dell’ingresso con elevata precisione, in condizioni di lavoro differenti. Stabilità: attitudine del sensore a conservare inalterate le sue prestazioni in un periodo di tempo più o meno lungo. Biosensori - A.A. 2023/2024 23 Biosensore: definizione IUPAC A device that uses specific biochemical reactions mediated by isolated enzymes, immunosystems, tissues, organelles or whole cells to detect chemical compounds usually by electrical, thermal or optical signals. TRASDUTTORE ELABORAZIONE DEL SEGNALE RECETTORI ANALITI Biosensori - A.A. 2023/2024 24 Biosensori Un biosensore è quindi formalmente un sistema di misura complesso, ottenuto integrando degli elementi biochimici (recettori) a un trasduttore, che converte l’energia della reazione in una forma di energia diversa. Biosensori - A.A. 2023/2024 25  Classificazione dei biosensori Biosensori Per principio di Per recettore trasduzione Acidi Organelli, Anticorpi Enzimi Nucleici cellule o Ottici Gravimetrici Elettrochimici Elettronici (Affinità) (Catalitici) (Genetici) tessuti Biosensori - A.A. 2023/2024 26 Trasduzione diretta e indiretta Diretta: si identifica l’avvenuta reazione in esame rilevando la variazione una grandezza fisica intrinseca delle molecole coinvolte (massa, carica elettrica, …). Indiretta: si identifica l’avvenuta reazione in esame rilevando la variazione di una grandezza fisica associata alle molecole coinvolte. Tale grandezza «associata» può essere: Un effetto secondario della reazione in esame (ad esempio, variazione del pH o della temperatura), nel qual caso si parla di rilevazione indiretta non marcata; Una proprietà aggiunta ad almeno una delle molecole di interesse tramite l’aggiunta di un marcatore (label), nel qual caso si parla di rilevazione indiretta marcata. Biosensori - A.A. 2023/2024 27  Biosensori: i desiderata Quali sono le caratteristiche che un biosensore dovrebbe possedere idealmente? Alcune di queste fanno riferimento alle prestazioni, e possono essere di tipo generale (ripetibilità, riproducibilità, stabilità, precisione, accuratezza…) o relative all’applicazione (sensibilità adeguata, buon intervallo dinamico, buona risoluzione)… Alcune altre sono invece meno banali! Automation Parallelization Cosa significa «prezzo attraente» o «bassi costi di utilizzo; Cosa significa «semplicità di uso» o «portabilità»? Biosensori - A.A. 2023/2024 28 Biosensori: quale paradigma? Biosensori - A.A. 2023/2024 29 Biosensori: quale paradigma? FreeStyle Libre GlucoTrack Biosensori - A.A. 2023/2024 30 Biosensori: quale paradigma? ELISA – lettore di piastre PCR in tempo reale Biosensori - A.A. 2023/2024 31  I biosensori allo stato dell’arte – costi? Haussmann, Vleck, Farrar. (2007). Advances in physiology education. 31. 110-5. Narrandes, Wayne. (2018) Journal of Cancer 9 Biosensori - A.A. 2023/2024 32 Biosensori allo stato dell’arte – tirando le somme Alcuni biosensori hanno già compiuto la «transizione» verso una tecnologia altamente portabile, a basso costo e di facile utilizzo (leggasi, sensori di glucosio). Altre analisi più complesse sono decisamente indietro: Sono richiesti molti passaggi per la preparazione dei campioni; La strumentazione è tipicamente poco portabile; I costi della strumentazione (acquisizioni e mantenimento) e del reagentario sono «significativi». Il grado di parallelizzazione non è necessariamente elevato. Biosensori - A.A. 2023/2024 33 Biosensori allo stato dell’arte – tirando le somme Quale filosofia? Si vogliono rendere anche le tipologie di analisi più elaborate più semplici da compiere, meno costose, più efficienti. Si vuole che questo consenta che a compiere queste analisi sia un non addetto ai lavori? Quali approcci? Fornire gli approcci già esistenti con queste caratteristiche; Introdurre nuovi concetti per l’indagine biochimica. È opportuno fare una distinzione tra tecniche di biosensing e biosensori, perché sempre più nei prossimi anni si tenderà a fare in modo che le prime siano compiute da dispositivi portabili e a basso costo (biosensori), accessibili al personale tecnico e al grande pubblico a seconda dell’analisi considerata. Biosensori - A.A. 2023/2024 34  UNIVERSITÀ DI CAGLIARI DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMEDICHE LAUREA TRIENNALE IN BIOTECNOLOGIE Analiti e Recettori Stefano Lai, PhD [email protected] Analiti e recettori biochimici Shavanova et al., Sensors 2016, 16, 223 Biosensori - A.A. 2023/2024 2  Recettori Biochimici – Modifica delle superfici La modifica delle superfici consiste quindi nell’integrare sulla superficie sensibile del sensore i recettori necessari. Esistono diverse strategie a riguardo: Modifica fisica (adsorbimento); Modifica chimica (modifica covalente) ; Intrappolamento. Biosensori - A.A. 2023/2024 3  Modifica delle Superfici - Adsorbimento Nel caso dell’adsorbimento fisico, si sfrutta la possibile interazione del recettore con la superficie tramite forze fisiche. Tipicamente, l’adsorbimento avviene per interazione elettrostatica. È la tecnica più semplice, ma anche quella che garantisce la stabilità inferiore dello strato recettore sulla superficie. Biosensori - A.A. 2023/2024 4  Modifica delle Superfici – Modifica chimica Nel caso della modifica chimica, si forma un legame stabile tra il recettore e la superficie. Garantisce la miglior stabilità possibile del legame, ma pone dei vincoli sulla superficie (deve possedere degli adeguati gruppi chimici). Qualora non sia possibile garantire il legame diretto tra recettore e superificie, esistono comunque delle possibili strategie. Biosensori - A.A. 2023/2024 5 Modifica delle Superfici – Modifica chimica La strategia più comune è quella di porre delle molecole che facciano da «ponte» tra superficie e recettore. Tra queste, la più utilizzata è quella rappresentata dai monostrati autoassemblati (Self-Assembled Monolayer, SAM). I precursori di un SAM sono delle molecole composte da tre elementi: gruppo di testa, in grado di interagire chimicamente con la superficie; spaziatore (coda), tipicamente una catena alchilica; gruppo funzionale, che definisce la proprietà chimica desiderata. I gruppi funzionali sono scelti per legarsi al recettore, mentre lo spaziatore garantisce l’ordinamento delle molecole tramite interazioni deboli. Biosensori - A.A. 2023/2024 6  Modifica delle Superfici – Intrappolamento Nel caso dell’intrappolamento, i recettori sono tipicamente inglobati all’interno di matrici (tipicamente organiche in forma di reticoli o gel), realizzate secondo diverse tecniche. L’intrappolamento può avvenire direttamente sulla superficie, includendo recettori e precursori della matrice organica e facendo avvenire la reazione che porta alla formazione dello strato finale, o depositando il materiale sulla superficie dopo l’intrappolamento delle biomolecole. Alternativamente, è possibile realizzare sulla superficie delle micro- o nano- strutture atte a contenere il recettore, ottenendo una sorta di adsorbimento fisico «potenziato». Biosensori - A.A. 2023/2024 7 Recettori biochimici - pH La rilevazione del pH di un fluido è una delle applicazioni più importanti in ambito fisiologico e biologico. Il pH è legato alla concentrazione di ioni idrogeno. NH2 La rilevazione di ioni idrogeno può essere effettuata per mezzo di specifici gruppi chimici in grado di fungere da buffer, controbilanciando COOH la variazione di pH assorbendo o rilasciando ioni H+ in soluzione. OH Questi gruppi chimici si trovano naturalmente sulla superficie di determinati materiali, come ad esempio gli ossidi metallici e certi polimeri, o possono essere integrati mediante modifica chimica della superficie del materiale. Biosensori - A.A. 2023/2024 8  Recettori biochimici – Specie ioniche La rilevazione di specie ioniche Ca2+ K+ può essere compiuta utilizzando delle molecole note come ionofori. Beauvericina Gli ionofori sono molecole Valinomicina organiche in grado di favorire il passaggio di una determinata specie ionica attraverso una membrana. NH4+ Sono normalmente integrati per via chimica o intrappolamento. Gramicidina (Na+) Enniatina Biosensori - A.A. 2023/2024 9 Recettori biochimici – Acidi nucleici Gli acidi nucleici di maggior interesse per applicazioni biosensoristiche sono il DNA e l’RNA. Per rilevare tali molecole, si sfruttano come recettori acidi nucleici (tipicamente DNA) e il principio di complementarietà. DNA: Molecola composta da due filamenti, legati tra loro attraverso legami idrogeno tra le basi azotate (adenina, citosina, timina e guanina) dei nucleotidi. Il principio di complementarietà prevede che l’adenina si leghi alla timina, e la citosina alla guanina. Data la sequenza di un filamento, esiste una e una sola sequenza complementare in grado di legarsi. RNA: Acido nucleico a singolo filamento, rispetto al DNA cambia una base azotata (uracile al posto della timina), ma resta valido il principio di complementarietà (citosina – guanina e adenina – uracile). Biosensori - A.A. 2023/2024 10 Recettori biochimici – Acidi nucleici Sfruttando il principio di complementarietà, singoli filamenti di DNA possono essere sfruttati come recettori (sonde) per altri singoli filamenti di DNA o per RNA (target). Se l’analita è un doppio filamento di DNA, è possibile ottenere la separazione tra i due filamenti (denaturazione) in diversi modi (tipicamente, aumentando la temperatura). RNA/DNA target Biosensori - A.A. 2023/2024 11  Recettori biochimici – Acidi nucleici Per legare un acido nucleico alla superficie, è possibile sfruttare i gruppi ossidrili terminali della catena nucleotidica. Questi possono essere utilizzati qualora la superficie da modificare presenti del gruppi –OH, –NH2 o –COOH; qualora non fossero disponibili (es., su un metallo), è possibile modificare la superficie con un SAM. In alternativa, è possibile sintetizzare delle sonde aventi un gruppo terminale diverso: casi tipici sono quelli del gruppo tiolo (–HS), che si lega in maniera stabile con l’oro, o di OH HO gruppi aminici per il legame con superfici di OH HO ossidi. HS Biosensori - A.A. 2023/2024 12 Recettori biochimici – Acidi nucleici Sonde di DNA modificate tramite gruppi chimici che ne consentono l’immobilizzazione chimica su una superficie sono a tutti gli effetti dei SAM! Le lunghe catene fosfate consentono a molecole di DNA vicine di interagire e ordinarsi sulla superficie. Biosensori - A.A. 2023/2024 13 Recettori biochimici – Acidi nucleici DNA and RNA sono acidi deboli, e come tali tendono a liberare ioni idrogeno nell’ambiente. In condizioni fisiologiche, i gruppi fosfati di ciascun nucleotide deprotonano. Come conseguenza, DNA e RNA sono molecole negative, con una carica netta pari a nq, dove n è il numero di nucleotidi per ciascun filamento e q è la carica elementare (1.6x10-19 C). Biosensori - A.A. 2023/2024 14 Recettori biochimici – Proteine Le proteine sono i principali costituenti della classe dei peptidi, e la principale tipologia di biomolecola. Diverse proteine sono altamente selettive, grazie al particolare rapporto tra la loro reattività chimica e la conformazione spaziale. Le principali proteine utilizzate nei biosensori sono gli anticorpi e gli enzimi. Biosensori - A.A. 2023/2024 15  Recettori biochimici – Proteine I gruppi aminico e carbossilico di ciascun aminoacido hanno proprietà di buffer. In risposta al pH ambientale, questi tendono a rilasciare o catturare ioni idrogeno. Gli aminoacidi possono quindi essere molecole ioniche (positive o negative), o comportarsi da zwitterioni (ioni bipolari). Ulteriori cariche elettriche possono essere legate ai radicali. Biosensori - A.A. 2023/2024 16 Recettori biochimici – Proteine La carica associata a ciascun aminoacido dipende dal valore del pH della soluzione; Il valore del pH al quale un gruppo chimico cambia il suo stato di carica è detto pK. Biosensori - A.A. 2023/2024 17  Recettori biochimici – Proteine La carica di una proteina può essere calcolata sulla base del numero di elementi in grado di assumere una configurazione di carica: Symbol Name pK 𝑄=𝑞 𝑁 + 𝛼𝐾 + 𝛽𝑅 + 𝛾𝐻 + 𝛿𝐷 + 𝜀𝐸 + 𝐶 Nterm Amine 8 Nterm e Cterm sono i gruppi amino e carbossilico finali K Lysine 10 della proteina. R Arginine 12 Per ogni radicale in rosso (carico positivo), la carica parziale può essere calcolata sulla base del suo pK e del H Histidine 6.5 pH dell’ambiente in base alla formula D Aspartate 4.4 10 𝑖= E Glutamate 4.4 1 + 10 Cterm Carboxylic 3.1 Per i radicali in blu (carichi negativi), invece 10 𝑖=− 1 + 10 Biosensori - A.A. 2023/2024 18 Recettori biochimici - Anticorpi Gli anticorpi sono proteine sintetizzate dai vertebrati e rappresentano una parte del Sistema immunitario. Fanno parte della categoria delle glicoproteine. Gli anticorpi sono composti da due identiche catene pesanti, legate tra di loro da un doppio legame disulfide, a cui si connettono due identiche catene leggere. Il dominio N-terminale delle due catene è detto regione variabile, essendo diversa tra anticorpo e anticorpo. È questa regione a definire la specificità dell’anticorpo rispetto a un determinato antigene. Biosensori - A.A. 2023/2024 19 Recettori biochimici - Anticorpi Un antigene è una sostanza che l’organismo riconosce come aliena. Gli antigeni contengono specifici gruppi chimici, chiamati epitopi. Gli anticorpi interagiscono con gli epitopi tramite la parte terminale della regione variabile, detta paratopo. Gli anticorpi capaci di interagire con un solo epitopo sono detti monovalenti, altrimenti sono polivalenti. Il complesso ottenuto dal legame tra antigene e anticorpo viene detto complesso immunologico. Biosensori - A.A. 2023/2024 20 Recettori biochimici - Anticorpi L’interazione tra antigene e anticorpo coinvolge diversi meccanismi: Le forze dominanti sono quelle idrofobiche: i gruppi apolari delle proteine contribuiscono ad allontanare le molecole d’acqua, consentendo l’avvicinamento tra antigene e anticorpo; Su una scala più corta (0.3-0.4 nm), le forze dominanti solo le interazioni deboli tipo Van der Waals; In alcuni casi, si ottiene la formazione di ponti idrogeno, su una distanza di 10 nm; Eventuali interazioni elettrostatiche intervengono su una scala maggiore, ma sono tipicamente secondarie. Biosensori - A.A. 2023/2024 21 Recettori biochimici - Anticorpi Esistono diversi approcci per l’immobilizzazione di anticorpi su una superficie: Immobilizzazione covalente, ottenuta facendo reagire gruppi funzionali dell’anticorpo con gruppi chimici presenti (o indotti) sulla superficie; Immobilizzazione orientata, ottenuta utilizzando delle specie chimiche in grado di legarsi alla catena pesante o alle regioni variabili, fornendo all’anticorpo una specifica direzione; Immobilizzazione non-covalente, ottenuta per adsorbimento fisico sulla superficie; Immobilizzazione specifica, ottenuta introducendo sulla superficie un peptide in grado di legarsi alla catena pesante dell’anticorpo, Immobilizzazione tramite DNA o PNA, che sfruttano queste due specifiche molecole come ponte tra anticorpo e superficie, Immobilizzazione tramite anticorpo ricombinante, nel quale è introdotta la modifica che rende possibile l’immobilizzazione sulla superficie scelta. Biosensori - A.A. 2023/2024 22 Recettori biochimici - Enzimi 𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 ⇌ 𝐸𝑃 ⇌ 𝐸 + 𝑃 Gli enzimi sono proteine che realizzano funzioni catalitiche, aumentando il rate di reazione dalle 103 alle 1020 volte. La reazione enzimatica consiste nella cattura di un reagente (substrato) da parte dell’enzima. Il complesso enzima- substrato da in seguito origine a un prodotto. Affinché avvenga la reazione catalitica, la maggior parte degli enzimi necessita di specifici gruppi detti cofattori, che possono essere altre proteine (co-enzimi) o ioni metallici. Biosensori - A.A. 2023/2024 23 Recettori biochimici - Enzimi Biosensori - A.A. 2023/2024 24 Recettori biochimici - Enzimi Esistono diverse strategie per l’immobilizzazione di enzimi sulla superficie, simili a quelle già viste per gli anticorpi. Nella maggior parte delle applicazioni pratiche, per via delle dimensioni degli enzimi, si sfrutta l’intrappolamento degli enzimi in matrici organiche, o per reticolazione degli stessi enzimi per formare una membrana sensibile. Biosensori - A.A. 2023/2024 25 Recettori biochimici – organelli, cellule e tessuti Le proteine, e in particolare gli enzimi, sono estremamente suscettibili alle condizioni ambientali. Se si vuole studiare il comportamento di un enzima in condizioni fisiologiche, lo studio di un singolo enzima in vitro può essere poco rappresentativo. I sensori che sfruttano come elemento recettore un sistema più complesso, come un organello, una cellula o parti di tessuto, consentono di studiare l’attività del recettore in modo più vicino a quanto accade in vivo. Il loro utilizzo è inoltre consigliabile qualora si voglia un’informazione più attendibile dell’effetto dell’analita su un organismo complesso (ad esempio, quando si studiano tossine). Biosensori - A.A. 2023/2024 26  Isoterma di Langmuir L’interazione tra analita e recettore segue il cosiddetto modello di Langmuir per l’adsorbimento di specie chimiche alla superficie. Tale modello assume che la cattura avvenga secondo una dinamica del primo ordine, 𝑅 + 𝐴 ⇄ 𝑅𝐴 Nella precedente equazione, [R] rappresenta la concentrazione dei recettori, [A] la concentrazione dell’analita e [RA] la concentrazione finale del complesso che risulta dalla cattura. Al passare del tempo, la densità del complesso analita-recettore aumenta seguendo la dinamica 𝑑 𝑅𝐴 =𝑘 𝑅 𝐴 −𝑘 𝑅𝐴 𝑑𝑡 All’equilibrio (d[RA]/dt = 0), 𝑘 𝑅𝐴 𝑘 𝑅 𝐴 =𝑘 𝑅𝐴 ⇒ 𝐾 = = 𝑘 𝑅 [𝐴] Biosensori - A.A. 2023/2024 27  Isoterma di Langmuir Durante la reazione, si avranno sia recettori occupati che recettori liberi. Introducendo la concentrazione totale dei recettori [Rtot] =  [R]+[RA] e la ricopertura superficiale  = [RA]/[Rtot], la precedente 1 equazione diviene 𝑘 𝑅 − 𝑅𝐴 𝐴 = 𝑘 𝑅𝐴 𝐾 1−Γ 𝐴 =Γ 0.5 𝐾 𝐴 =Γ 1+𝐾 𝐴 𝐾 𝐴 Γ= 1+𝐾 𝐴 1/Ka [A] Questa rappresenta una «curva di taratura» normalizzata (massima ampiezza = 1), normalmente rappresentata in funzione di [A] or log[A]. Biosensori - A.A. 2023/2024 28  Cinetica dell’isoterma di Langmuir Studiando la reazione nel RA  tempo, si può dimostrare che 1 [Rtot] (per [A] >> [R]) [A] [A] 𝐾 𝐴 Γ 𝑡 = 1−𝑒 𝐾 𝐴 +1 Nella precedente equazione, 𝜅 =𝑘 𝐴 +𝑘. [RA] aumenta nel tempo fino tempo tempo a raggiungere un valore massimo che dipende da [A]; per t →∞, [RA](∞) = [Rtot]. Biosensori - A.A. 2023/2024 29  UNIVERSITÀ DI CAGLIARI DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMEDICHE LAUREA TRIENNALE IN BIOTECNOLOGIE Biosensori Ottici Stefano Lai, PhD [email protected]  Richiami L’ottica La capacità di visualizzare un oggetto è legata alla sua capacità di riflettere la luce verso un rilevatore (ad esempio, l’occhio umano). La riflessione è solo uno dei meccanismi di interazione tra luce e materia: più in generale, ci si riferisce alla rifrazione, come un complesso di riflessione e trasmissione. Biosensori - A.A. 2023/2024 2  Richiami Visualizzare le biomolecole? Biosensori - A.A. 2023/2024 3  Richiami Radiazione elettromagnetica La luce rappresenta un esempio particolare di radiazione elettromagnetica. Una radiazione elettromagnetica è composta da un campo elettrico che oscillano ortogonalmente tra loro, lungo una direzione di propagazione, x. La distanza tra due picchi di campo lungo x prende il nome di lunghezza d’onda (); Immaginando di osservare il campo da x (fronte d’onda), è possibile osservare che il vettore ottenuto dalla composizione dei due campi descrive una circonferenza in un tempo T, detto periodo dell’onda. Si fa spesso riferimento alla frequenza (f), definita come l’inverso del periodo. Essendo un fenomeno spazio-temporale, lunghezza d’onda e frequenza di una radiazione elettromagnetica sono legate nella definizione di velocità di propagazione. 𝑣 = 𝜆𝑓 Biosensori - A.A. 2023/2024 4  Richiami Visualizzare le biomolecole? La lunghezza d’onda della luce visibile è dell’ordine delle centinaia di nanometri. A tali lunghezze d’onda, le biomolecole sono più piccole della lunghezza d’onda della luce visibile: non c’è possibilità che la luce possa essere riflessa da una biomolecola! Biosensori - A.A. 2023/2024 5  Richiami Visualizzare le biomolecole? La visualizzazione di una biomolecola richiederebbe lunghezze d’onda estremamente ridotte, confrontabili o più piccole delle dimensioni molecolari. Questo è possibile usando sorgenti di radiazione elettromagnetica particolarmente energetica, come i raggi X e i raggi Gamma. Anche particelle come elettroni e ioni sono utilizzabili come sorgente di «illuminazione» dell’infinitamente piccolo: la meccanica quantistica ci insegna che particelle si possono comportare come una radiazione elettromagnetica e la radiazione Cristallografia a Cromosomi al elettromagnetica come flussi di pseudo- raggi X del DNA microscopio elettronico particelle (dualismo onda-corpuscolo). a scansione Biosensori - A.A. 2023/2024 6  Richiami Interazione tra onde EM e materia In generale, radiazione e materia possono interagire mediante uno scambio di energia. L’esempio più semplice è la formazione dei colori: la luce bianca è in realtà composta da diverse componenti cromatiche, e il colore associato ad un oggetto è relativo alle componenti che sono riflesse, mentre le altre sono trasmesse oltre l’oggetto o assorbite dallo stesso. La tipologia di interazione dipende, ovviamente, dalle energie in gioco. L’energia di una radiazione elettromagnetica è 𝑣 𝐸 = ℎ𝑓 = ℎ 𝜆 Biosensori - A.A. 2023/2024 7  Richiami Interazione tra radiazione elettromagnetica e molecole Biosensori - A.A. 2023/2024 8  Richiami Interazione tra radiazione elettromagnetica e molecole Transizione elettronica Biosensori - A.A. 2023/2024 8  Richiami Interazione tra radiazione elettromagnetica e molecole Vibrazione Biosensori - A.A. 2023/2024 8  Richiami Interazione tra radiazione elettromagnetica e molecole Rotazione o Traslazione Biosensori - A.A. 2023/2024 8  Richiami Ripasso sulla radiazione elettromagnetica Quando una radiazione elettromagnetica è assorbita dalla materia, gli elettroni degli atomi sono in grado di passare dal loro livello energetico originale (ground state) a un livello a maggiore energia (excited state), aventi una differenza di energia pari a quella della radiazione assorbita. Similmente, il passaggio di un elettrone da uno stato a uno stato a energia inferiore genera l’emissione di radiazione elettromagnetica avente un’energia pari alla differenza energica tra i due livelli. Biosensori - A.A. 2023/2024 9  Richiami Spettri di assorbimento Un’interazione con la materia a livello atomico richiede lunghezze d’onda nello spettro del visibile o della radiazione ultravioletta (spettro UV/Vis). Una radiazione nello spettro UV/Vis è in grado di generare delle transizioni energetiche del tipo: *; n-*; n-*; * Biosensori - A.A. 2023/2024 10  Richiami Spettri di assorbimento Un’interazione con la materia a livello atomico richiede lunghezze d’onda nello spettro del visibile o della radiazione ultravioletta (spettro UV/Vis). Una radiazione nello spettro UV/Vis è in grado di generare delle transizioni energetiche del tipo: *; n-*; n-*; * Biosensori - A.A. 2023/2024 10  Richiami Spettri di assorbimento Un’interazione con la materia a livello atomico richiede lunghezze d’onda nello spettro del visibile o della radiazione ultravioletta (spettro UV/Vis). Una radiazione nello spettro UV/Vis è in grado di generare delle transizioni energetiche del tipo: *; n-*; n-*; * Biosensori - A.A. 2023/2024 10  Richiami Spettri di assorbimento Un’interazione con la materia a livello atomico richiede lunghezze d’onda nello spettro del visibile o della radiazione ultravioletta (spettro UV/Vis). Una radiazione nello spettro UV/Vis è in grado di generare delle transizioni energetiche del tipo: *; n-*; n-*; * Biosensori - A.A. 2023/2024 10  Richiami Spettri di assorbimento Un’interazione con la materia a livello atomico richiede lunghezze d’onda nello spettro del visibile o della radiazione ultravioletta (spettro UV/Vis). Una radiazione nello spettro UV/Vis è in grado di generare delle transizioni energetiche del tipo: *; n-*; n-*; * Biosensori - A.A. 2023/2024 10  Richiami Spettri di assorbimento Biosensori - A.A. 2023/2024 11  Richiami Spettri di assorbimento Modulando la frequenza di una radiazione elettromagnetica incidente su un campione, è possibile ottenerne lo spettro di source Sample Detector assorbimento. Assorbanza di un campione è una funzione del rapporto tra l’intensità della radiazione incidente al campione (Iin)e l’intensità della radiazione uscente (trasmessa, Itr), secondo la relazione 𝐼 𝐴 = − log = − log 𝑇 𝐼 Il parametro T, definite come il rapporto tra Iin e Itr, è detto trasmittanza. Nello spettro di assorbimento, si osservano dei massimi che rappresentano una certa lunghezza d’onda assorbita: questa sarà rappresentativa di un determinato gruppo chimico (cromoforo). Lo studio dello spettro di assorbimento (spettroscopia elettronica) consente di ricavare informazioni sulla struttura di una molecola. Biosensori - A.A. 2023/2024 12 Trasduzione ottica La trasduzione ottica è la più semplice e utilizzata. Rappresenta generalmente una trasduzione indiretta, in quanto è necessario fornire le molecole di un gruppo chimico (marcatore) in grado di generare una reazione «visibile». Le principali trasduzioni ottiche sono quella colorimetrica, e quella a fluorescenza. Biosensori - A.A. 2023/2024 13  Tecniche colorimetriche A + R (A+R → P) Le tecniche colorimetriche consistono P nell’inserimento di un marcatore che, in seguito a una reazione, sia in grado di analita analita reagire alla luce visibile con un cambio di colore. La reazione può essere una comune E P reazione chimica S Fosfato + ammonio molibdato + acido ascorbico → prodotto di colore blu analita analita Più comunemente, si sfruttano reazioni enzimatiche, che sono più selettive. X-Gluc + -glucoronidase → prodotto NP NP NP In alternativa, è possibile utilizzare dei marcatori la cui coalescenza produca un analita analita analita cambio di colore macroscopico, come ad esempio le nanoparticelle metalliche. Biosensori - A.A. 2023/2024 14 Tecniche a fluorescenza I processi di assorbimento ed emissione sono spesso correlati: l’energia assorbita da un materiale può essere rilasciata sempre sotto forma di radiazione elettromagnetica. In genere, le due radiazioni emesse non sono identiche, perché parte dell’energia assorbita può essere rilasciata in altro modo (ad esempio, per via di vibrazioni o urti). Un materiale in grado di assorbire una radiazione a una determinata lunghezza d’onda e di emettere, di conseguenza, una radiazione a una lunghezza d’onda diversa viene detto fluorescente. Molecole fluorescenti sono dette fluorocromi. Biosensori - A.A. 2023/2024 15 Tecniche a fluorescenza Un fluorocromo è quindi dotato di uno spettro di assorbimento, e da uno spettro di radiazione che può essere emessa (spettro di emissione). I due spettri devono essere il meno sovrapposti possibile. La fluorescenza è un fenomeno che decade velocemente nel tempo (nell’ordine dei nanosecondi), quando la sorgente di eccitazione è rimossa. Biosensori - A.A. 2023/2024 16 Tecniche a fluorescenza CIANINA-3 (Cy3) Biosensori - A.A. 2023/2024 17 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) e Quenching La FRET consiste nel trasferimento di energia tra due fluorocromi, scelti in modo che lo spettro di emissione del primo (donore) sia parzialmente sovrapposto allo spettro di assorbimento del secondo (accettore). Quando donore e accettore sono vicini, è possibile che il primo trasferisca energia al secondo invece di emettere. In questo caso si ottiene un segnale FRET, ovvero l’emissione di radiazione da parte dell’accettore dovuta all’eccitazione del donore. Il segnale FRET è più «pulito» del segnale a fluorescenza di un singolo fluorocromo, in quanto l’eccitazione è fuori dalla banda di emissione dell’accettore. Un simile meccanismo è quello dello smorzamento (quenching): in questo caso l’accettore è una molecola (quencher) che assorbe energia dal donore senza emettere radiazione. In questo modo, si osserva la scomparsa del segnale fluorescente in presenza del quencher. Biosensori - A.A. 2023/2024 18  Immunosensori ottici Gli immunosensori studiano la formazione di complessi antigene-anticorpo, detti anche complessi immunologici. Le tecniche standard di indagine immunologica richiedono tipicamente (con eccezioni minime) l’utilizzo di marcatori, che consentano di rilevare l’avvenuta formazione del complesso immunologico. Allo stato dell’arte, sono principalmente utilizzati marcatori fluorescenti, o enzimi in grado di generare delle reazioni ottiche (colorimetriche). Si parla, nei due casi, di immunofluorescenza o di ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Biosensori - A.A. 2023/2024 19 Tecniche a immunofluorescenza reporter Le tecniche a immunofluorescenza sono principalmente distinte in: Diretta Dirette: l’analita è immobilizzato su una superficie, e si introducono delle molecole marcate (reporter): in analita presenza dell’analita, si ottiene il fissaggio della fluorescenza sul reporter substrato. analita Indirette: si utilizza un recettore immobilizzato per catturare l’analita dalla soluzione di misura; il reporter Indiretta si lega quindi all’analita. Biosensori - A.A. 2023/2024 20  Tecniche a immunofluorescenza Le tecniche indirette sfruttano tipicamente un anticorpo come recettore, e sono quindi utilizzati per rilevare antigeni nella soluzione di misura. Queste possono essere ulteriormente distinte in: Competitive, se si sfruttano degli Competitiva Non competitiva antigeni marcati; Non-competitive (sandwich), se si utilizza un secondo anticorpo marcato. Biosensori - A.A. 2023/2024 21 Tecniche di immunofluorescenza competitive Fluorescenza Gli anticorpi sono esposti alla soluzione di misura, alla quale viene aggiunta una concentrazione nota di un antigene specifico agli anticorpi recettori e marcato con una molecola fluorescente. Se nella soluzione di misura è presente una bassa concentrazione di antigene, sarà probabile che si venga a formare un complesso tra anticorpo e antigene marcato: il segnale di fluorescenza sarà quindi intenso. Se nella soluzione di misura è presente una elevata concentrazione di antigene, allora sarà dominante la presenza di complessi immunologici non marcati, con una conseguente bassa emissione a fluorescenza. [Ag] Il riconoscimento positivo è quindi legato alla diminuzione del segnale a fluorescenza. Biosensori - A.A. 2023/2024 22 Tecniche di immunofluorescenza non competitive Si espongono gli anticorpi recettori Fluorescenza alla soluz