Total Kalitatif Analiz (1).pdf

Total Kalitatif Analiz Farmakognozi Laboratuvari III Öğr. Gör. Eda AVCI Öğr. Gör. Elif Ayça ALTINKAYA SAMİM Öğr. Gör. Reyhan ARICI • Bitki ve bitki karışımlarında çok çeşitli kimyasal madde grupları vardır. • Total kalitatif analiz ile bu madde gruplarının teşhisleri yapılır. • Bu yöntemde k...

Total Kalitatif Analiz Farmakognozi Laboratuvari III Öğr. Gör. Eda AVCI Öğr. Gör. Elif Ayça ALTINKAYA SAMİM Öğr. Gör. Reyhan ARICI • Bitki ve bitki karışımlarında çok çeşitli kimyasal madde grupları vardır. • Total kalitatif analiz ile bu madde gruplarının teşhisleri yapılır. • Bu yöntemde karışımdaki maddelerin farklı solvanlarda farklı oranlarda çözünmelerine dayanarak fraksiyonları hazırlanır. Fraksiyonlamada petrol eteri, benzen, eter, kloroform, etanol ve su gibi farklı polaritedeki solvanlar kullanılır. • Tanımadığımız bir drog ile çalışırken nonpolar bir solvan olan petrol eteri ile ekstraksiyona başlanır. Petrol eterine uçucu yağ, mum ve steroller geçer. • Takiben kalan bitki kısımları sırasıyla eter, kloroform, etanol ve su ile ekstre edilir. • Heterozitler, ozlar ve tanenler etanol ve suyla ekstre edilir. • Etken maddenin tipine göre çeşitli fraksiyonlamalar yapılabilir. • Genelde etanollü bir ekstre hazırlanır. Maddelerin çoğu etanole geçer. • Etanol uzaklaştırıldıktan sonra kuru ekstre suda çözünüp sırasıyla petrol eteri, kloroform, eter ve etil asetat gibi çeşitli solvanlarla ayırma hunisinde ekstre edilerek fraksiyonlama yapılabilir. • Daha sonra bu ekstrelerde etken maddeler aranır. • Laboratuvarlarda fraksiyonlama yapılmayacaktır fakat değişik tipte ekstreler hazırlanacaktır. Deney: Numune alınınca ilk olarak numune numarası kaydedilecek ve numune bir kağıdın üzerine dökülerek homojen olarak karıştırılacaktır. Bu karışım 3 parçaya bölünmelidir. 1. Bir kısmı herhangi bir ekstrenin dökülme ihtimaline karşı veya tereddütte kalınan deneylerin tekrar edilebilmesi için saklanır. Bu kısmın az miktarı ile siyanogenetik heterozitlerin teşhisi ve mikroskobik inceleme yapılır. 2. Bir kısmı ile (diğerlerinden biraz daha fazlası) sulu ekstre hazırlanır (heterozit, oz ve tanen teşhis reaksiyonları için). 3. Bir kısmı üçe bölünüp, etanollü ekstre (kardiyoaktif heterozitler), alkaloit ekstresi (alkaloit) ve toluen ekstresi (lipid aranması) hazırlanır. TOZ KARIŞIMI 3’E BÖLÜNÜR! Yedek olarak ayrılır (toz karışımının dökülmesi durumunda). Siyanogenetik heterozit teşhisinde kullanılır. Mikroskobik incelemede kullanılır. 1. kısım Saponozit, antrasen türevi heterozit, nişasta, flavon heterozitleri, tanen, oz teşhisi için sulu ekstre hazırlanır. Bu kısım diğer iki kısımdan biraz daha fazla olmalıdır! 2. kısım Kardiyoaktif heterozit, oz ve kumarin teşhisi için etanollü ekstre hazırlanır. Alkaloit teşhisi için alkaloit ekstresi hazırlanır. Lipit teşhisi için toluen ekstresi hazırlanır. 3. kısım EKSTRAKSİYON 1. Sulu Ekstre: ● Toz edilmiş numune 250 ml’lik bir erlene konulur ve üzerine 100 ml kaynar su ilave edilir. Erlenin ağzı pamuk ile kapatılır ve mikrobek üzerinde hafif alevde 30 dk ısıtılır. ● Sıcakken pamuktan süzülür. ● Süzüntüde flavon heterozitleri, saponozit, antrasen türevi heterozitler, oz, tanen ve nişasta aranır. 2. Alkaloit Ekstresi: ● Toz numune 20 damla %5’ lik amonyak çözeltisiyle ıslatılır ve karıştırılır. Üzerine 10 ml eter veya kloroform konup, çalkalanır. ● Erlenin ağzı kapatılır ve ara sıra çalkalayarak 45 dakika bekletilir. Daha sonra ekstre pamuktan süzülür. Süzüntü ayırma hunisinde 3 ml 1N HCl ile çalkalanır, sulu kısım alınır ve alkaloit teşhisinde kullanılır. 3. Etanollü Ekstre: ● Toz edilmiş numune 10 ml %70’lik etanol ile 3-5 dakika su banyosu üzerinde kaynatılır ve pamuktan süzülür. Süzüntüye 1 ml %10’luk kurşun subasetat çözeltisi ilave edilip karıştırılır ve ardından süzülür. Böylece çözelti klorofil ve diğer pigmentlerden kurtarılmış olur. ● Temizlenmiş süzüntü 10 ml kloroform ile ekstre edilir. ● Kloroformlu faz kardiyoaktif heterozit teşhisinde kullanılır. Sulu kısım oz ve kumarin aranmasında kullanılabilir. 4. Toluenli Ekstre: ● Toz edilmiş numune 50 ml’lik bir erlende 20 ml toluenle sık sık çalkalanarak ekstre edilir. ● Toluenli kısım pamuktan süzülerek alınır ve lipit teşhisinde kullanılır. ETKEN MADDE GRUPLARININ TEŞHİS EDİLMESİ a. Saponozitler 10 ml sulu ekstre alınır, bir deney tüpüne konur, tüpün ağzı baş parmak ile sıkıca kapatılır ve yatay olarak 30 sn. kadar kuvvetle çalkalanıp kendi haline bırakılır, 15 dk sonra tüpte en az 1 cm köpük kalıyorsa saponozit var demektir. b. Antrasen Türevi Heterozitler ● 5 ml sulu ekstre üzerine 5-6 damla derişik H2SO4 konur ve mikrobek üzerinde dikkatlice kaynatılır (hidroliz amacıyla). Bu esnada aglikonlar serbest hale geçer ve süzülür. ● Süzüntü soğutulur ve az miktarda toluen ile ekstre edilir (kuvvetli çalkalanmamalı). ● Üstteki toluen tabakası (Antrasen türevleri mevcut ise sarı renklidir) ayrılır ve %10’luk amonyak çözeltisi ile çalkalanır. Alttaki amonyaklı tabaka gül pembesinden kiraz kırmızısına giden bir renk alır. ● Aglikon bir antronol ise renk önce sarıdır, 5 dk sonra karakteristik kırmızı renge dönüşür. ● Mikrosüblimasyon: Toz edilmiş numuneden birkaç mg bir lam üzerine konur. Lamın üstünde 1-2 mm kalacak şekilde başka bir lam ile kapatılır. Alttan küçük bir alevle ısıtılır. Süblimat üst lamın alt yüzeyinde toplanır. Süblimat üzerine bir damla 1 N NaOH damlatılır. Kırmızı-pembe renk oluşması antrasen türevi heterozit varlığını gösterir. c. Nişasta: Sulu ekstrenin 3 ml’sine 3-5 damla O.1 N sulu iyot çözeltisi ilave edilir. Mor renk nişasta varlığını gösterir. Toz numunenin mikroskobik analizi ile de nişasta varlığını saptayabiliriz (Sartur Reaktifi ile teşhisi; distile su ile şekil ve büyüklüklerinin belirlenmesi). d. Flavonoitler: 10 ml sulu ekstre üzerinde “SİYANİDİN reaksiyonu” uygulanır. Sulu ekstre üzerine 0.5 ml derişik hidroklorik asit ve bir spatül ucu magnezyum veya çinko tozu ilave edilir. Hidrojen gazı çıkışı tamamlandığında meydana gelen renk tespit edilir (flavon→portakal rengi, flavonol→kiraz kırmızısı, flavanon→menekşe) e. Tanenler: 5 ml sulu ekstre üzerine 2 ml tuzlu jelatin çözeltisi (NaCl ile doyurulmuş %1’lik jelatin çözeltisi) ilave edilir. Krem rengi çökelek tanen varlığını gösterir. f. Ozlar: Sulu ekstreden 2 ml bir deney tüpüne konur, üzerine 2 ml Fehling A ve 2 ml Fehling B çözeltileri ilave edilir. Su banyosu üzerinde dikkatli bir şekilde ısıtılır. Kırmızı renkli Cu2O çökeleği görülür. g. Kumarinler: 5 ml etanollü ekstre kapsülde su banyosu üzerinde yoğunlaştırılır. Üzerine 3-4 damla 1N NaOH çözeltisi ilave edilir. UV366 nm’ de mavi-yeşil floresans verir. h. Kardiyoaktif Heterozitler: Etanollü ekstrenin kloroformlu fazı alınır ve üçe bölünür. 1. ve 2. kısım iki ayrı kapsüle alınarak su banyosunda yoğunlaştırılır. 3. kısım ise deney tüpüne alınır. ● Kapsülün birinde kalan artık üzerine 1 ml Baljet Reaktifi ve 2 damla %6’lık NaOH çözeltisi ilave edilir. Turuncu renk meydana gelir. ● İkinci kapsüle “KELLER-KLIANI reaksiyonu” uygulanır. Artık üzerine 2 ml %3.5’luk demir (III) klorür’ün glasiyel asetik asitteki çözeltisinden ilave edilir. Elde edilen çözelti, bir deney tüpünde bulunan 2 ml derişik sülfürik asit çözeltisine tüpün kenarından dikkatlice sızdırılarak eklenir. İki tabaka arasındaki yüzeyde mavi-menekşe bir halka meydana gelir. ● Deney tüpünde bulunan ekstreye “LIEBERMANN-BURCHARD reaksiyonu” uygulanır. Ekstre üzerine 1 ml asetik asit anhidriti ve derişik sülfürik asit karışımından (5:1) eklenir. Ya doğrudan doğruya yeşil renk oluşur ya da kırmızı ve mavi tonlarından sonra renk yeşile döner. i. Alkaloitler: Alkaloit ekstresinden 3 ml bir tüpe alınır ve Dragendorff Reaktifi ilave edilir. Kırmızı-turuncu rengin meydana gelip gelmediği tespit edilir. j. Lipitler: Toluen ekstresinden 5 ml alınır, su banyosunda 1-2 damla kalıncaya kadar uçurulur. Bu yoğun ekstre bir süzgeç kağıdına küçük bir leke halinde tatbik edilir ve 100°C’ lik etüvde 5-10 dakika tutulur. Kağıt üzerinde yağsı bir iz varsa reaksiyon pozitiftir. k. Siyanogenetik Heterozitler: Toz edilmiş numune 50 veya 100 ml’lik bir erlene konur ve üzerine numuneyi ıslatacak kadar su ilave edilir. Pikrik asitli kağıdın bir parçası, sodyum karbonat çözeltisi ile ıslatılır ve bir pamuk ile erlenin boynuna sıkıştırılarak ıslatılmış droğun hemen üzerine kadar sarkıtılır. Daha sonra bek üzerinde dikkatlice ısıtılır. Burada pikrik asitli kağıdın droğa değmemesi gerekir. Aksi halde sonuç yanıltıcı olabilir. Hidrosiyanik asit (HCN) çıkışına bağlı olarak sarı renkli sodyum pikratın, tuğla kırmızısı renkli sodyum izopurpurata dönüşmesi siyanogenetik heterozitlerin varlığını gösterir. Deney sonucunda kırmızı renk almış olan kağıt üzerine %10’luk asetik asit çözeltisinden birkaç damla damlatılır. Eğer kırmızı renk değişmeden kalırsa numunede siyanogenetik heterozit var demektir. MİKROSKOBİK İNCELEME ● ● Mikroskobik incelemelerde, bitki karışımı içinden ayrılan, farklı droglara ait olduğu düşünülen parçalar için farklı reaktiflerle hazırlanan preparatlar dikkatlice incelenmelidir. İncelenen droglarda gözlenen karakteristik elementler kurşun kalem ile laboratuvar defterine çizilecek, inceleme ortamı, mikroskop büyütmesi belirtilerek doku/elementin adı yazılacaktır. Bu elementlerin hangi bitki kısımlarına ve mümkünse hangi droglara ait olduğu mutlaka yorumlanmalıdır. Örneğin; • Kimyasal analiz sonucunda antrasen türevi heterozitlerin pozitif sonuç vermesi; mikroskobik analiz sonucunda parasitik stoma, kütikulası noktacıklı örtü tüyü, basit billur dizisi; makroskobik analizde görülen yeşil yaprak parçaları akıllara Sennae folium droğunu getirmelidir. • Kimyasal analiz sonucunda oz, sapanozit, flavonozit, nişasta deneylerinin pozitif çıkması; mikroskobik analiz sonucunda; basit billur dizisi, odun boruları, mantar dokusunun görülmesi; makroskobik analizde sarı-kahverengi odunsu-lifli parçaların görülmesi ise Liquiritiae radix droğunun varlığını düşündürmelidir. • Kimyasal incelemeler sırasında hazırlanan ekstreler ve deneyler kısaca laboratuvar defterine tükenmez kalem ile yazılmalıdır. • Sonuçların değerlendirilmesi sırasında öğrencinin kimyasal bulgular ile mikroskobik bulguları bir arada değerlendirmesi önemlidir. Örnek vermek gerekirse mikroskobik incelemede bolca nişasta içerdiği görülen bir numunede kimyasal analiz sonucunda da nişasta deneyi pozitif sonuç vermelidir. • 4 haftanın sonunda defter teslim edilmelidir.