Travaux Pratiques de Microbiologie - S3 2024-2025 (PDF)

Travaux Pratiques de Microbiologie – S3 Techniques microbiologiques de base Année universitaire: 2024 – 2025 1 Séance 1  Objectifs ▪ Observation et mise en évidence de microorganismes sur une série d’éch...

Travaux Pratiques de Microbiologie – S3 Techniques microbiologiques de base Année universitaire: 2024 – 2025 1 Séance 1  Objectifs ▪ Observation et mise en évidence de microorganismes sur une série d’échantillons d’origine naturelle. ▪ Initiation aux techniques d’étude et de culture des microorganismes. 3 1- Observations de cultures microbiennes dans la nature Vidéo Vidéo poivron Vidéo Vidéo Observez et notez l’aspect des différents échantillons. Est-ce que la présence des microorganismes sur votre échantillon peut-elle être perceptible aisément à l’œil nu ? 4  Questions ▪ Comment expliquez-vous la présence des microorganismes sur les différents échantillons ? ▪ Est-ce que ce sont toujours les mêmes microorganismes qui colonisent les différents aliments ? 5  Des bactéries sur milieu de culture Des champignons Levure Une cyanobactérie : Synechocystis sp. La levure boulangère 6 2- Poste de travail et Règles de sécurité Film "Poste de travail" 7 Lancer le film 8 Mise en évidence des sources de contaminations en Microbiologie 9  Questions Dans un laboratoire de Microbiologie, on manipule toujours dans une zone aseptique autour du bec bunsen (voir documents relatifs au « Poste de travail » et déposés sur la plateforme), Cependant, il y a des sources de contamination possibles à éviter même devant un poste de travail. Une contamination c’est la présence de germes étrangers à ceux qu’on est entrain d’étudier. D’où peuvent venir ces contaminations? = voir exemples A, B, C et D Comment peut-on les mettre en évidence? Et comment peut-on les éviter ? 10  3- Sources de contamination : Ensemencement Sources de N° Matériel Manipulations contamination Paillasse Ouvrir la boite de Pétri, toucher en déposant Peau de la main 1 et 7 Boite de Pétri divisée en soigneusement un doigt à la surface de la gélose deux secteurs a : doigt non lavé b : après lavage au savon Peau de la main 2 et 8 Boite de Pétri divisée en a : doigt non lavé deux secteurs b : après utilisation de la solution hydroalcoolique Peau de la main 3 et 9 Boite de Pétri divisée en a : doigt non lavé deux secteurs b : après lavage à l’eau de Javel Cheveux 4 et 10 Boite de Petri n°4 Ouvrir la boite de gélose nutritive (Paillasse 4) ou le tube de bouillon nutritif (Paillasse 10), déposer des cheveux sur ces milieux de culture. Agiter les cheveux sur la gélose nutritive de façon à faire tomber des cheveux et des pellicules. Voies 5 et 11 Boite de Petri n°5 Veuillez tousser et souffler sur la boite de gélose Rhinopharyngées nutritive. Air 6 et 12 Boite de Petri n°6 6: Laisser la boite ouverte pendant 5 min près du bec Bunsen, puis la refermer 12: Idem 6, mais loin du bec Bunsen 11  Exemple A: La main = source de contamination ? Comment le vérifier ? Manipulation 1: ▪ On prend une boite de Pétri contenant la gélose nutritive et on la partage en deux quadrants par marquage du fond de la boite. ▪ Dans le premier quadrant, on dépose l’empreinte d’un doigt non lavé. Dans le deuxième quadrant, on dépose l’empreinte d’un doigt lavé avec un antiseptique : ✓ Le savon pour les étudiants 1 et 7. ✓ Une solution hydro-alcoolique pour les étudiants 2 et 8. ✓ Une solution d’eau de Javel pour les étudiants 3 et 9. ▪ La boite sera incubée pendant 24h à 37 °C. 12 Exemple B: Voies Rhino-Pharyngées (VRP)= source de contamination ? Comment le vérifier ? Manipulation 2: ▪ On prend une boite de Gélose Nutritive stérile; ▪ On l’ouvre dans la zone d’asepsie; ▪ On parle et on tousse dans le milieu gélosé (boite ouverte); ▪ Enfin, on ferme cette boite et on l’incube à 37°C pendant 24H. 13  Exemple C: Cheveux = source de contamination ? Comment le vérifier? Manipulation 3: ▪ On prend une boite de Gélose Nutritive stérile ▪ On se gratte les cheveux sur le milieu de culture ▪ On arrache un cheveu et on le dépose sur le milieu de culture (GN). ▪ On incube la boite GN à 37°C pendant 24 h. 14  Exemple D: Air = Source de contamination ? Comment le vérifier ? Manipulation 4: ▪ On prend deux boites de Gélose Nutritive stériles, L’une est marquées (air), l’autre (zone aseptique: ZA) ▪ La boite (air) est laissée ouverte à l’air en dehors de la zone d’asepsie pendant (5 mn) ▪ La boite (ZA) est laissée ouverte dans la zone d’asepsie, près du bec Bunsen pendant ( 5 mn). ▪ Après, les deux boites sont incubées à 37°C pendant 24H. 15  4- Transferts bactériens 4A- Ensemencement d’un milieu solide Protocole expérimental La boite de Petri est divisée en deux parties A et B : - on ensemence la partie A par la suspension bactérienne, - et la partie B par l’eau physiologique stérile. 16  4- Transferts bactériens 4B- Ensemencement d’un milieu liquide Protocole expérimental 17 5- Techniques d’isolement bactérien A- Faire un isolement par la méthode des quadrants à partir du mélange M = (Ec + Sa). B- Réaliser un 2ème type d’isolement par l’utilisation de milieux sélectifs et différentiels. 18 5- Techniques d’isolement bactérien 5A- Isolement sur milieu solide (G.N.) par la méthode des quadrants (bactéries ou groupes inconnus) Objectif séparer les cellules de microorganismes les uns des autres à partir d’un mélange polymicrobien : Obtenir des cultures pures Vérifier la pureté d’une culture microbienne 19  Principe: Epuisement de la semence: les cellules microbiennes prélevées à l’aide d’une anse stérile à partir du mélange microbien, sont ensemencées par des stries serrées à la surface du milieu gélosé, et à la fin de la manipulation il reste quelques cellules au bout de l’anse de platine. Celles-ci seront isolées dans le dernier quadrant de la boite de gélose. Epuisement de la semence Colonies jointives Colonies isolées 20  Protocole expérimental 1 2 4 3 1 -2 1 -2 Quadrants striés Suspension bactérienne 21 1 2 4 3 2-3 Quadrants striés 1 -2 Quadrants striés 2-3 Quadrants striés 22  24h incubation-37°C Etuve = incubateur 3-4 4 Quadrants striés 23  5- Techniques d’isolement bactérien 5B- Isolement bactérien en utilisant un milieu sélectif et différentiel Objectifs * Réaliser un isolement par l’utilisation d’un milieu sélectif et différentiel (bactéries ou groupes connus) Exemple : Milieu de Chapman * Apprendre à faire la lecture de milieux sélectifs et différentiels 24  Isolement sur milieu sélectif et différentiel "Milieu Chapman" Aspect du milieu Mode Sélectivité / Caractères avant utilisation d’ensemencement composition recherchés L'ensemencement Ce milieu contient un On peut étudier la doit être massif, en inhibiteur : forte fermentation du stries serrées : concentration en mannitol par chlorure de sodium virage au jaune de (NaCl : 75 g.l-1), l’indicateur coloré, le rouge ce qui permet un de phénol isolement sélectif de Staphylococcus tolérant les fortes concentrations en NaCl 25  Protocole expérimental : - Divisez chaque boite de Pétri en 3 secteurs. - Ensemencer chaque section par à l’aide d’une anse de platine par l’une des colonies (A, B et M : mélange) striation. Gélose nutritive Chapman (Témoin) A B A B M M A : Staphylococcus aureus, B : Escherichia coli, M : Mélange des 2 souches A et B. 26  Protocole expérimental : Gélose nutritive Chapman (Témoin) A C A C M M A : Staphylococcus aureus, C : Bacillus subtilis, M : Mélange des 2 souches A et C. 27  Composition des milieux de culture Milieu de Chapman (g/l) Gélose nutritive (g/l) - Peptone (source de C et N) 10 - Peptone 20 - Mannitol (Sucre: Source de C) 10 - Extrait de viande 2 - NaCl 75 - NaCl 5 - Rouge de phénol 0,025 - Agar-agar 15 - Extrait de viande 1 - Eau distillée q.s.p. 1 litre - Agar-agar 15 - Eau distillée q.s.p. 1 litre Milieu Chapman : Agent sélectif : NaCl à 75 g/l Agents différentiels : Mannitol : Sucre Rouge de phénol : Indicateur de pH 28  Virage du rouge de Phénol en fonction du pH Dégradation du Mannitol : Mannitol + → production d’acides → Virage du rouge de phénol en jaune (Colonies jaunes) 29 Séance 2 RESULTATS OBTENUS 31  3- Sources de contamination : Lecture Sources de N° Matériel Manipulations contamination Paillasse Ouvrir la boite de Pétri, toucher en déposant Peau de la main 1 et 7 Boite de Pétri divisée en soigneusement un doigt à la surface de la gélose deux secteurs a : doigt non lavé b : après lavage au savon Peau de la main 2 et 8 Boite de Pétri divisée en a : doigt non lavé deux secteurs b : après utilisation de la solution hydroalcoolique Peau de la main 3 et 9 Boite de Pétri divisée en a : doigt non lavé deux secteurs b : après lavage à l’eau de Javel Cheveux 4 et 10 Boite de Petri n°4 Ouvrir la boite de gélose nutritive (Paillasse 4) ou le tube de bouillon nutritif (Paillasse 10), déposer des cheveux sur ces milieux de culture. Agiter les cheveux sur la gélose nutritive de façon à faire tomber des cheveux et des pellicules. Voies 5 et 11 Boite de Petri n°5 Veuillez tousser et souffler sur la boite de gélose Rhinopharyngées nutritive. Air 6 et 12 Boite de Petri n°6 6: Laisser la boite ouverte pendant 5 min près du bec Bunsen, puis la refermer 12: Idem 6, mais loin du bec Bunsen 32  Sources de contamination : Lecture Après 24 heures d’incubation à 37°C La main = source de contamination ? Résultats: Avant incubation Après incubation à 37°C pendant 24h Amas de colonies Aucune colonie 33  La main = source de contamination ? Interprétation Le quadrant 1: (Doigt non lavé) Il y a présence d’un amas de colonies. Donc, le doigt (= main) non lavé(e) contient des microorganismes (Main = source de contamination). Conclusion: Il ne faut jamais toucher un matériel stérile (pipettes, anse, un milieu de culture …etc.) par la main. Le quadrant 2: (Doigt lavé) à la solution hydro-alcoolique: absence de colonies. La solution antiseptique a éliminé les microorganismes. Conclusion: Il faut bien laver la main par un antiseptique (ex: Alcool, solution hydro-alcoolique , ……..) avant de manipuler en microbiologie. 34 Cheveux = source de contamination ? Résultats: Avant incubation Après incubation à 37°C pendant 24H Différents types de colonies autour du cheveu 35  Cheveux = source de contamination ? Interprétation: ▪ Après 24 h d’incubation, il y a développement d’un grand nombre de colonies, même autour du cheveu (=développement continu). ▪ Donc, les cheveux contiennent des microorganismes et peuvent être considérés comme une source de contamination. ▪ Conclusion: le manipulateur doit se relever les cheveux ou mettre un bonnet au moment de la manipulation. 36  Voies Rhino-Pharyngées (VRP)= source de contamination ? Résultats: Avant incubation Après incubation à 37°C pendant 24H n Différents types de colonies 37  Voies Rhino-Pharyngées (VRP)= source de contamination ? Interprétation ▪ Après incubation , la boite contient différents types de colonies. Boite après incubation ▪ Donc la voie rhino-pharyngée contient des microorganismes. ▪ La VRP peut être considérée comme une source de contamination possible à éviter. ▪ Conclusion: En microbiologie, il ne faut ni parler ni tousser devant/sur les milieux de cultures au moment de la manipulation. Différents types de colonies 38  Air = Source de contamination ? Résultats: Boite (zone aseptique ZA) Boite (air) après incubation à 37°C pendant 24h après incubation à 37°C pendant 24h Différents types de colonies Aucune colonie 39  Air = Source de contamination ? Interprétation: ▪ La boite (air) contient des colonies multicolores. ▪ Donc, L’air contient des microorganismes (air= source de contamination). ▪ Conclusion: il ne faut jamais ouvrir les milieux de culture dans l’air (en dehors de la zone d’asepsie), ni laisser les outils stériles à l’air sans les protéger contre cette source de contamination. ▪ La boite (ZA) ne contient pas de colonies. ▪ Donc, la zone d’asepsie est bien décontaminée par la flamme bleue du bec bunsen. ▪ Conclusion: En Microbiologie, pour éviter TOUTE contamination, il faut toujours travailler dans la zone d’asepsie. 40  Transferts bactériens (Lecture) RESULTATS Obtention de colonies Obtention d’un trouble 41  4- Transferts bactériens (Lecture) 4A- Ensemencement d’un milieu solide Protocole expérimental La boite de Petri est divisée en deux parties A et B : - on ensemence la partie A par la suspension bactérienne, - et la partie B par l’eau physiologique stérile. 42  4- Transferts bactériens (Lecture) 4B- Ensemencement d’un milieu liquide Protocole expérimental 43  Développement microbien en milieu liquide/gélosé Bouillon nutritif (Milieu liquide) Milieu gélosé en boite de Petri Trouble Types Types Colonies 44  Choix de l’utilisation d’un milieu liquide ou gélosé Milieu liquide Milieu gélosé - Obtention d’un trouble -Obtention de colonies: La colonie est une masse de cellules issue de la prolifération d’une ou plusieurs cellules initiales. - Croissance plus rapide - Étude des aspects macroscopiques - Permet une étude de la - Dénombrement croissance de souches pures par la mesure de la DO; densité optique par le spectrophotomètre Isolement 45  Illustration: Film "Les microbes" Technique d’isolement : Méthode des quadrants RESULTAT Colonies jointives Colonies isolées 1 -2 3-4 2-3 47 Aspect macroscopique des colonies 48  Technique d’isolement : Isolement sur milieu sélectif et différentiel Lecture des résultats : Milieu Chapman Milieu vire Milieu vire en jaune en rouge pH acide pH alcalin 49  Composition des milieux de culture Milieu de Chapman (g/l) Gélose nutritive (g/l) - Peptone (source de C et N) 10 - Peptone 20 - Mannitol (Sucre: Source de C) 10 - Extrait de viande 2 - NaCl 75 - NaCl 5 - Rouge de phénol 0,025 - Agar-agar 15 - Extrait de viande 1 - Eau distillée q.s.p. 1 litre - Agar-agar 15 - Eau distillée q.s.p. 1 litre Milieu Chapman : Agent sélectif : NaCl à 75 g/l Agents différentiels : Mannitol : Sucre Rouge de phénol : Indicateur de pH 50  Virage du rouge de Phénol en fonction du pH Dégradation du Mannitol : Mannitol + → production d’acides → Virage du rouge de phénol en jaune (Colonies jaunes) 51  Lecture des résultats : Milieu Chapman A : Staphylococcus aureus, B : Escherichia coli, M : Mélange des 2 souches A et B. A : Staphylococcus aureus, C : Bacillus subtilis, M : Mélange des 2 souches A et C. 52 Coloration de Gram A partir de colonie bactérienne sur GN (méthode des quadrants ou l’une des boites des sources de contamination) Recouvrir le frottis d’une solution de violet de gentiane ou violet cristallisé. Laisser 1 min. Egoutter (verser le colorant). Recouvrir d’une solution de lugol. Laisser 1 min et égoutter. Rincer à l’eau du robinet. Plonger la lame dans un bain d’alcool et laisser agir 30 secondes en agitant doucement ; Rincer abondamment à l’eau du robinet. Couvrir de solution de fuchsine ou de safranine. Laisser 30 secondes. Rincer à l’eau du robinet. Sécher avec du papier buvard et observer. Observation microscopique : Objectif x 40 (G: x 400) puis Objectif x 100 (G: x 1000)+ Huile à immersion  Coloration de Gram 1 min 1 min Rinçage Alcool 30 secondes Rinçage 30 secondes Rinçage Coloration violette rose Gram + Gram - Sécher le frottis bactérien avec du papier buvard et observer. Observation microscopique : Objectif x 40 (G: x 400) puis Objectif x 100 (G: x 1000)+ Huile à immersion FORMES ET REGROUPEMENTS DES BACTÉRIES  Synthèse Echantillon naturel Mise en culture et Isolement sur Milieu sélectif et différentiel Colonies isolées Réisolement et Purification des colonies (Techniques des quadrants) Culture pure Caractérisation macroscopiques et microscopiques (dont Coloration de Gram) Identification biochimique (TD), moléculaire … 61