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Clase BBM II martes 5 octubre 2021 ESTRÉS OXIDATIVO (Dr. Armando Rojas) Es un tema importante dentro de la investigación Biomédica por la relevancia que tiene en el contexto de la fisiopatología. En esencia, el estrés oxidativo es un concepto que involucra toda una serie de elementos dentro de los...

Clase BBM II martes 5 octubre 2021 ESTRÉS OXIDATIVO (Dr. Armando Rojas) Es un tema importante dentro de la investigación Biomédica por la relevancia que tiene en el contexto de la fisiopatología. En esencia, el estrés oxidativo es un concepto que involucra toda una serie de elementos dentro de los cuales los radicales libres tienen un papel preponderante. RADICALES LIBRES Son entidades químicas altamente reactivas que poseen un electrón no pareado en su orbital más externo, lo cual les confiere a estas moléculas su alto grado de reactividad (alto grado de reaccionar) con biomoléculas. ANTECEDENTES HISTÓRICOS Se pueden dividir en 3 etapas: Primera etapa o Presencia de radicales libres en sistemas biológicos postulada hace 67 años (Nature 174: 689-691, 1954). Antes de 1954, los radicales libres eran un concepto que se utilizaba estrictamente en el área química, no en la biológica. o ya que ya se preveía y postulaba que eran responsables del daño celular a diferentes niveles y de las bases moleculares de diversas patologías. Segunda etapa o Descubrimiento de la (Cupreína) por McCord y Fridovich (1969), el cual fue trascendental ya que se descubre una enzima que es capaz de detoxificar/ anular la capacidad de Tercera etapa (80-90) o Se descubre que los Radicales libres también forman parte de los sistemas de señalización intracelulares, lo que significa que las especies reactivas (radicales libres) no necesariamente se van al lado patológico, sino que también forman parte de los procesos normales y de la señalización intracelular. Óxido nítrico (el cual tiene un papel preponderante en la fisiología cardiovascular), Peróxido de hidrógeno, Superóxido. Radicales libres juegan un importante papel también en la activación de factores transcripcionales, es decir, que existen factores transcripcionales que son sensibles al status redox intracelular el cal puede cambiar de forma importante dependiendo de la cantidad de especies reactivas que se encuentren biodisponibles. FORMACIÓN DE RADICALES LIBRES Esto es consecuencia no sólo de procesos internos (desde el punto de vista biológico), sino que también de otras grandes fuentes externas como, por ejemplo, la contaminación ambiental, malos hábitos como fumar, exposición a radiaciones ionizantes y no ionizantes (ejemplo de esta última: ), etc. Sin embargo, recordemos que desde el punto de la fisiología/fisiopatología, la respiración mitocondrial es una de las principales fuentes de especies reactivas (o radicales libres) y los procesos inflamatorios también. Por lo tanto, todo este pool de radicales libres, tanto exógeno como endógeno, impacta de forma importante en los ácidos nucleicos y ADN particularmente. ESTRÉS OXIDATIVO En el año 1984, se define el concepto de estrés oxidativo como: un desbalance que se produce por el aumento de especies oxidantes o disminución de antioxidantes, lo cual, en ambos casos, lleva igualmente al estrés oxidativo. Principales agentes Oxidantes: Internos: EROs, ERNs, Hidroperóxidos de ácidos grasos polinsaturados (PUFAs), etc. Externos: Paraquat (herbicida), Adriamicina (fármaco/antibiótico antitumoral), etc. Ambos compuestos oxidantes externos nombrados forman especies reactivas del oxígeno. Por un lado, cabe mencionar que al Paraquat estamos expuestos porque como herbicida lo encontramos en el ambiente. Por otro lado, en la Adriamicina la producción de radicales libres derivados del oxígeno es precisamente su mecanismo de acción porque de esta manera tiene la capacidad de dañar los ácidos nucleicos y particularmente el ADN. EROs= las Especies Reactivas derivadas del Oxígeno; ERNs= las Especies Reactivas derivadas del Nitrógeno Principales agentes Antioxidantes: Tienen como principal f(x) resguardar nuestras biomoléculas del efecto de las especies oxidantes. Y como sistemas antioxidantes encontramos: Sistemas enzimáticos: SOD (enzima Superóxido dismutasa), Catalasa (detoxifica al peróxido de hidrógeno), GSH Px (sistema de la Glutatión peroxidasa que es muy importante y veremos luego con más detalle). Atrapadores de radicales (estos no tienen naturaleza enzimática): Ácido ascórbico (vitamina), -tocoferol, GSH (glutatión), Selenio, Flavonoides, etc. OXIDANTES CELULARES: ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO Y NITRÓGENO A continuación, veremos las principales especies oxidantes celulares, centrándonos en las especies reactivas del oxígeno (EROs) y las del nitrógeno (ERNs). Especies Reactivas del Oxígeno (EROs) O2 -. : Radical Superóxido H2O2 : Peróxido de hidrógeno HO . : Radical hidroxilo ROO . : Radical peroxilo ROOH: Hidroperóxido orgánico 1 O2 : Oxígeno singlete Especies Reactivas del Nitrógeno (ERNs) NO . : Óxido nítrico ONOO - : Anión peroxinitrito NO - : Anión nitroxilo NO2 : Dióxido de nitrógeno En las EROs, en primer lugar, tenemos al O2 -. (Superóxido), el cual es una molécula que se encuentra en fácilmente presente en los sistemas biológicos ya que es formado en gran medida en la respiración mitocondrial. Lo mismo ocurre con el H2O2 (Peróxido de hidrógeno) a nivel de fagosoma y lisosoma, por ejemplo. Tenemos también al HO . (Radical hidroxilo), el cual es muy importante en los sistemas biológicos debido a su altísima reactividad (es el radical libre derivado del oxígeno más reactivo que se conoce) y es altamente peligroso por su gran capacidad de reacción con biomoléculas. Otros EROs que tenemos son los ROO . (Radicales peroxilos), todos los ROOH (Hidroperóxidos orgánicos, que se forman, por ejemplo, durante el catabolismo del ácido araquidónico por vía de las lipoxigenasas o ciclooxigenasas) y 1 O2 (Oxígenos singletes; oxígenos con un desbalance de electrones en su capa más externa, que también tienen gran capacidad reactiva). Pasando a las ERNs, nos encontramos con el NO (Óxido nítrico) que es el principal exponente de estas, pero también existe toda una serie de derivados como lo son el ONOO - (Anión peroxinitrito; muy relevante en el contexto de la patología porque es una molécula muy reactiva), y en menor cantidad el NO - (Anión nitroxilo) y el NO2 (Dióxido de nitrógeno). LONGEVIDAD DE LAS ESPECIES REACTIVAS Especie reactiva Peróxido de Hidrógeno Hidroxiperóxidos órganicos Radicales peroxilo Óxido nítrico Peroxinitrito Anión superóxido Oxígeno singlete Radicales alcoxilos Radical hidroxilo Vida Media ~ minutos ~ segundos ~ miliseg ~ microseg ~ nanoseg Se debe prestar especial atención al tiempo de vida media de estas especies reactivas. Por ejemplo, el Peróxido de hidrógeno e Hidroperóxidos orgánicos tienen una vida media en el rango de los minutos, desde que se forman y están biodisponibles para ejercer su acción oxidante hasta que son inhibidos por los sistemas de detoxificación (el H2O2 por ejemplo por la enzima catalasa). A diferencia de lo que ocurre con los Radicales peroxilo y el Óxido nítrico, el rango de tiempo entre su formación y posterior desactivación toma segundos; para el Peroxinitrito (muy reactivo) tarda milisegundos; en el Anión superóxido, Oxígeno singlete y Radicales alcoxilos se produce en microsegundos; y finalmente en el Radical Hidroxilo (que es el + reactivo) demora solo nanosegundos (afortunadamente poco tiempo). ¡Lo anterior es de especial importancia para definir los sistemas que se contraponen a la acción de estas especies reactivas en relación con el tiempo de vida media que tienen estas moléculas! Estrés Nitrosativo En el año 1999 se reporta al termino de estrés nitrosativo precisamente en analogía con lo que se había definido unos años antes, cuando se hizo la definición de estrés nitrosativo, donde define la excesiva formación del radical óxido nítrico (NO) y obviamente todas las especies reactivas derivadas del nitrógeno, es importante destacar que a diferencia del estrés oxidativo donde si hay un importante grupo de sistemas que son capaces de detoxificar todas las especies reactivas derivadas del nitrógeno, para el caso de las especies reactivas del nitrógeno este arsenal de mecanismos o moléculas que son capaces de detoxificar estas especies es notablemente menor, por lo tanto en gran medida la producción excesiva de radical óxido nítrico de especies reactivas del nitrógeno va a tener consecuencias muy importantes. Repercusión negativa de las especies reactivas Veremos cuales son las repercusiones desde el punto de vista de las biomoléculas que forman nuestras células de las especies reactivas, tanto especies reactivas del oxígeno como del nitrógeno. - Ambas especies pueden dañar ácidos nucleicos y por lo tanto en términos de ese daño directo sobre ácidos nucleicos pueden inducir eventos mutacionales y en consecuencia estos eventos mutacionales, como en algún momento veremos en fisiología, tienen consecuencias importantes en los procesos de iniciación y progresión del proceso de carcinogénesis, ósea es decir de la transformación de una célula desde un fenotipo normal a un fenotipo maligno. - Por otro lado, estas especies reactivas también atacan las membranas celulares, a través de una reacción que es conocida como peroxidación lipídica, es decir todos los ácidos grasos que forman parte de la membrana celular son extraordinariamente susceptibles a las especies reactivas tanto del oxígeno como del nitrógeno. - Observemos que las proteínas también son blanco importante de estas especies ya sean enzimas, receptores, transportadores, etc. Y estas moléculas, proteínas, especies reactivas obviamente producen la oxidación de algunos aminoácidos dentro de la estructura aminoacídica de la secuencia aminoacídica de estas proteínas y por ende sea este daño en termino de este proceso de oxidación puede llevar a la pérdida total o parcial en dependencia de la magnitud del daño de la funcionalidad de estas proteínas y por lo tanto podemos ver enzimas que dejan de funcionar o receptores que funcionan a mitad de capacidad o trasportadores que funcionan también de forma inequívoca, por lo tanto el impacto que tienen las especies reactivas del oxígeno o del nitrógeno sobre el proteoma celular, sobre su dotación de proteínas de la célula, es extraordinariamente importante porque afecta de manera directa la funcionalidad de estas moléculas. - Por otro lado, estas especies también son capaces de producir daño estructural a carbohidratos, y otro elemento que es extraordinariamente importante sobre todo en mantener un estatus de equilibrio y de restablecer este concepto de estrés oxidativo, es que las especies reactivas cuando están producidas en grandes cantidades puede conllevar al agotamiento de los sistemas de detoxificación, y esto es extraordinariamente relevante porque una condición que genere una condición patológica que genere un estrés oxidativo dentro del manejo de esa patología debería también evaluarse sistemas que de alguna forma también estén dirigidos a evitar que se agoten los sistemas de detoxificación, y recordemos que una buena parte de nuestro sistema de detoxificación no solamente están vinculados con sistemas enzimáticos, hay también toda una serie de elementos que por ejemplo son parte del consumo de nuestra dieta como todas las vitaminas, principalmente la vitamina C, la cual los seres humanos somos incapaces de sintetizarla, y la única vitamina C disponible es la que consumimos en nuestra dieta. Daño de proteínas En términos al daño de proteínas y en esencia estas especias reactivas tanto del oxígeno como del nitrógeno pueden formar aductos, es decir, modificaciones, sean generar nuevos grupos estructurales dentro de la secuencia de estas proteínas que obviamente pueden alterar la estructura y funcionalidad. Otro elemento no menor es que se pueden generar rupturas en las estructuras proteicas, y eso cuando se producen rupturas en general en todas las biomoléculas, pueden generarse enlaces cruzados que pueden ser de naturaleza homofílica, es decir, entre moléculas iguales, o pueden generar algo todavía más grave de naturaleza que es de naturaleza heterofílica, entre moléculas distintas, obviamente eso conlleva a que se formen agregados de biomoléculas que en esencia inhiben de forma completa su funcionalidad. El otro punto importante es hay toda una serie de aminoácidos dentro de los aminoácidos esenciales que son extraordinariamente susceptibles a la reacciones de oxidaciones, por lo tanto, cuando están presentes en un ambiente oxidante obviamente se va a oxidar, y en consecuencia ese aminoácidos va a perder su capacidad funcional si estos aminoácidos se encuentran dentro o en las cercanías del sitio activo de una enzima o en las cercanías de un enlace importante como los enlaces disulfuro entre cisteínas relativamente cercanas, etc. Y por otro lado, y no menos relevante, es que el estrés oxidativo en su capacidad de inducir todas esta modificaciones en biomoléculas son capaces de activar el sistema de la ubiquitina proteosoma, y muchas de estas moléculas que son o que sufren los cambios por reacciones de oxidación tanto por especies reactivas del oxígeno o nitrógeno, son ubiquitinadas, y por lo tanto son derivadas hacia el proteosoma, degradadas y de esta forma empieza a disminuir la biodisponibilidad de esas moléculas en el contexto intracelular. Daño a ácidos nucleicos Como se mencionó anteriormente en términos de los daños a ácidos nucleicos estas especies pueden generar rupturas de simple cadena, rupturas de doble cadena que es la lesión más letal que se puede generar en la molécula de ácidos nucleicos, pero también por reacciones de oxidación o tanto por especies reactivas del oxígeno como es el caso de la 8-hidroxiguanina, o por especies reactivas derivadas del nitrógeno como es el caso de la 8-nitroguanina, obviamente eso representa un evento, siendo el basamento para que se genere en la próxima replicación un evento mutacional porque probablemente como ya no hay de estas guaninas modificadas, ya no van a generar el apareamiento ni van a ser reconocidas como tal dentro del contexto de un codón en particular Y lo otro también relevante para el caso de las proteínas, es la formación de enlaces cruzados, cuando hay disponibilidad de un nuevo enlace que queda libre por la ocurrencia de una ruptura, por ejemplo, se pueden generar enlaces cruzados entre moléculas de ácidos nucleicos, pero también entre moléculas de ácidos nucleicos y proteínas. Daño a lípidos En el caso de los lípidos, todos los ácidos grasos polisaturados que son muy importantes en la membrana celular son muy susceptibles a ser oxidados por las especies reactivas derivadas del oxígeno a través del proceso llamado peroxidación lipídica y que en esencia generan moléculas de estos derivados oxidados que han sido utilizados como biomarcadores de estrés oxidativo, como fue inicialmente el malonil aldehído (MDA) y que han sido desplazados por otra molécula también producto de la oxidación de lípidos como es la F2-Isoprostanos, que parecen ser biomarcadores mucho más sensibles del estrés oxidativo en términos del impacto que producen en la peroxidación lipídica, y obviamente desde el punto de vista de la funcionalidad, todo estos lípidos que son oxidados y que obviamente se convierten en estos derivados oxidados tienen consecuencias importantes en una de las propiedades más relevantes de las membranas celulares y que es la fluidez de las membranas. Daño a carbohidratos En el caso del daño a los carbohidratos tenemos que las especies reactivas pueden oxidar la glucosa y por lo tanto ya este proceso es un proceso interesante donde ya vamos a ver más adelante cuan relevante puede ser, pero lo más relevantes por ejemplo se sabe de hace muchos años que es parte el proceso de envejecimiento de la degradación de los polisacáridos, particularmente de ácidos hialurónicos que es uno de los componentes esenciales de la matriz extracelular y por lo tanto es uno de los componentes importantes en términos de la turgencia de la piel, para que no se formen arrugas. Y precisamente este concepto en términos de inhibir los procesos de degradación de polisacáridos asociados a matriz extracelular es una de las áreas más intentas desde el punto de vista de desarrollo de la industria cosmética actual, precisamente con todos estos preparados cosméticos, cremas, ungüentos, que en esencia están de alguna forma dirigidos a evitar esa degradación de matriz y lo hacen previniendo el proceso de degradación por las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, por lo tanto la gran mayoría de todo estos compuestos cosméticos tienen a su modo de acción el aportar toda una serie de elementos que refuerzan los mecanismos antioxidantes. Especies reactivas derivadas del oxígeno (ERO) - Producción celular de especies reactivas del oxigeno Vemos cuan diversa es la formación, sean los sistemas que son capaces de formar especies reactivas del oxígeno. Tenemos por ejemplo todos los citocromos P-450 sea durante el proceso de conversión metabólica de este sistema enzimático se generan especies reactivas del oxígeno, existen sistemas enzimáticos como es el caso de la NADPH oxidasa cuya principal función es generar anión superóxido, también todas las oxidasas flavoproteínas que están dentro del peroxisoma, la lipoxigenasa y la ciclooxigenasa como se había mencionado anterior en término del catabolismo de ácido araquidónico la cadena respiratoria que como se había mencionado, donde todo lo que es cadena respiratoria a nivel mitocondrial es una de las principales fuentes de especies reactivas del oxígeno, el sistema de la xantina deshidrogenasa, xantina oxidasa, y no menos importantes son los metales de transición tanto sea hierro (Fe) como cobre (Cu) en términos de sus variaciones de valencia en +2 o +3, o 1 o +2, que son muy importantes en gatillar una reacción que favorece la formación del radical hidroxilo (es el radical más reactivo que existe). Mitocondria como fuente de especies oxidantes En esencia las mitocondrias, las cadenas respiratorias son una fuente muy relevante anión superóxido, sin embargo, también de especies reactivas del nitrógeno porque existe una oxido nítrica sintasa de localización estrictamente mitocondrial, por lo tanto, en la mitocondria también se produce óxido nítrico. La cadena respiratoria Aquí se tiene un diagrama más o menos simple de la cadena respiratoria, donde se observa como a nivel de complejo 1 se forma el anión superóxido, este es convertido en peróxido de hidrogeno, y ultimo en presencia de hierro con valencia +2 puede ser convertido en un radical hidroxilo, pero observen que también a nivel del complejo 3 también se forma anión superóxido y obviamente con la capacidad de transformación de anión superóxido hacia peróxido de hidrogeno tal como se vio en complejo 2 de la matriz, por lo tanto los complejos 1 y el complejo 3 de la matriz representan fuentes muy relevantes de producción de especies reactivas del oxígeno. NADPH oxidasa Otro elemento muy importante es la NADPH oxidasa, que es un complejo multimérico formado por unidades reguladoras y catalíticas que presenta altos niveles de expresión en células fagocíticas, linfocitos T, en todas las células epiteliales y en células endoteliales, o sea, tiene una distribución amplia en diferentes células de nuestro organismo. Su principal función es producir anión superóxido, además en cuanto a la funcionalidad del sistema inmune (particularmente de la inmunidad innata) se ha descubierto una patología, llamada Granulomatosis crónica, donde los pacientes están afectados por infecciones recurrentes, generalmente de naturaleza bacteriana, y que en esencia genera mutaciones en diferentes componentes de la NADPH oxidasa, lo que disminuye importantemente la producción del anión superóxido y por ende se ve afectada nuestra inmunidad innata. Entre el 50-70% de todos los pacientes con Granulomatosis crónica, responden a una mutación en la unidad gp91, que es una unidad catalítica, y entre el 30-40% y el 10%, responden a unidades que son consideradas reguladoras (30-40%-->p47 y 10%-->p67/p22) Xantina Oxidorreductasa Es extraordinariamente importante, porque en el contexto metabólico normal, la Xantina a través de la Xantina deshidrogenasa es convertida en NADH y ácido úrico, sin embargo, en presencia de hipoxia (baja biodisponibilidad de oxígeno a nivel tisular) o en presencia de mediadores inflamatorios como las citocinas, esta Xantina deshidrogenasa es transformada en una proteína de menor peso molecular por acción de proteasas y se forma una nueva proteína de menor peso molecular, pero con otra actividad enzimática, que es la Xantina oxidasa, que convierte la Xantina en anión superóxido, por lo tanto en condiciones de hipoxia o inflamatorias, el metabolismo o catabolismo de las bases nitrogenadas no tiene un curso normal y se desvía hacia la producción de especies reactivas del oxígeno, particularmente de anión superóxido. El pool endógeno de metales de transición es extraordinariamente importante en el contexto de la producción de especies reactivas del oxígeno, ya que a finales de la década de los 70, se definió que existía un mecanismo, a través de la participación de hierro, sobre todo por los desbalances entre Fe+2/+3, para producir radical hidroxilo desde la conversión de anión superóxido hacia peróxido de hidrogeno (este radical hidroxilo, es probablemente la especie reactiva del oxígeno más peligrosa por la alta reactividad que posee). Esta formación es conocida como la vía de Fenton/Haber-Weiss, porque fueron los 3 investigadores que participaron en la definición de este mecanismo netamente químico, pero que tiene gran relevancia en el contexto de patologías humanas, puesto que algunas de ellas están vinculadas con el proceso de acumulación de Fe, como la Hematomacrosis o el aumento de depósitos de hierro a nivel hepático, etc. Especies reactivas del nitrógeno Para hablar de las especies reactivas derivadas del nitrógeno tenemos que hablar del sistema enzimático que es la formadora de la principal y más relevante de las especies que es el óxido nítrico. Existen 3 grandes grupos de isoformas de Óxido Nítrico Sintasa: 1. Óxido Nítrico sintasa endotelial: que tiene un papel muy relevante en la fisiología cardiovascular, porque es uno de los elementos más relevantes en términos del control vasomotor. 2. Óxido nítrico sintasa neuronal: es muy importante en SNC, puesto que funciona como un neurotransmisor, en este sentido se definieron la presencia de las conocidas vías de inervación nitrinergicas, es decir, donde el neurotransmisor es precisamente el óxido nítrico. 3. Óxido nítrico sintasa inducible: Los grupos Óxido Nítrico sintasa endotelial y neuronal, están catalogadas como isoformas constitutivas, aunque la isoforma endotelial también ha sido recientemente catalogada como posiblemente inducible por determinados estímulos, pero en el caso de la Óxido nítrico sintasa inducible está presente mayoritariamente en células de nuestro sistema inmune y particularmente aquellas vinculadas con la inmunidad innata como las células fagocíticas, sobre todo los macrófagos que tienen altos niveles de expresión de óxido nítrico sintasa inducible y de esta enzima produce cantidades muy importantes de óxido nítrico en comparación con la óxido nítrico sintasa neuronal y la endotelial. La óxido nítrico sintasa inducible tiene una actividad catalítica notablemente superior a las otras 2 isoformas Ahora bien, en el contexto patológico, es factible que se forme una nueva especie que pertenece a la especie reactiva derivada del nitrógeno, que es el radical peroxinitrito, el cual es extraordinariamente importante porque es muy reactivo contra proteínas, lípidos y ácidos nucleico, de hecho hay una modificación de la Tirosina por parte del peroxinitrito, donde forma lo que se conoce como nitrotirosina y la cuantificación de nitrotirosina ha sido utilizada como un biomarcador de estrés Nitrosativo. Quiero que se fijen que en el lado central tenemos el anión superóxido, que puede ser transformado en peróxido de hidrogeno por la superóxido inmutasa a una constante de velocidad de 2 x 10 9 M-1 s-1, sin embargo si coexiste en algún momento anión superóxido, superóxido inmutasa y óxido nítrico, la velocidad de reacción del anión superóxido con el óxido nítrico, es un poco más de 3 veces superior, es decir, de 2 x 10 9 a 6.7 x 109, por lo tanto, esta formación de peroxinitrito va a ocurrir 3 veces más rápido que la detoxificación del anión superóxido por parte de la superóxido inmutasa. Esto quiere decir, que en cualquier contexto en donde se produzcan cantidades importantes de anión superóxido y de óxido nítrico, se van a transformar irremediablemente en radical peroxinitrito y eso obviamente tiene consecuencias importantes en la patología humana. Hace algunos años, poco más de 10 años, se descubrió que las óxido nítrico sintasa no solo podían producir óxido nítrico, sino que en determinados estados, conocidos como óxido nítrico sintasas disfuncionales o desacopladas, este sistema enzimático también podía producir anión superóxido lo que se genera cuando existe una baja disponibilidad de su cofactor, que es la Tetrahidrobiopterina (BH4) y es extraordinariamente importante porque hay una serie de patologías que dentro de sus características tiene una disminución importante de la tetrahidrobiopterina (BH4) y por lo tanto tiene repercusiones relevantes en aumentar el estrés oxidativo y disminuir un mediador importante en la fisiología como lo es el óxido nítrico. 1. Estabilización de la unión de la L- arginina con el sitio activo de la enzima (recordemos que la formación del óxido nítrico parte con el aminoácido arginina9. 2. Formación de un homodímero estable que es la forma activa de la óxido nítrico sintasa, cualquiera de las 3 formas son homodímero. 3. Transferencia de electrones desde el dominio reductasa hacia la oxidasa y por lo tanto favorecer la conversión de L- arginina a óxido nítrico 4. Mantiene la forma redox del grupo Hemo, porque las óxido nítrico sintasas son hemoproteínas Hay una serie de condiciones, como el hipercolesterolemia, hiperglicemia, diabetes, hipertensión, ateroesclerosis y la inflamación que están vinculadas con disminuciones importantes de la biodisponibilidad de BH4, por lo tanto, es de esperar que todos los pacientes afectados por estas patologías tengan disminuciones en el óxido nítrico biodisponible y un impacto en el desacoplamiento de las óxido nítrico sintasas. Estrés Nitrosativo Está vinculado particularmente con la formación desmesurada de peroxinitrito, que es el radical más reactivo de las especies reactivas derivadas del nitrógeno, y este estrés Nitrosativo, produce modificación de proteína, que puede conllevar a la pérdida de su funcionalidad o a la activación del sistema de la Ubiquitina. Presencia de estrés oxidativo y patologías Condiciones clínicas con participación de estrés oxidativo: 1. inflamatorio/respuesta inmune - Glomerulonefritis - Vasculitis - Artritis reumatoidea - Lupus - (todas las enfermedades autoinmunes) 2. Isquemia-reperfusión: - Post-infarto de miocardio - Post-shock cerebrovascular - Trasplante de órganos 3. Sobrecarga de hierro/cobre: - Hemocromatosis 4. Shock séptico y similares: - Síndrome de inflamación sistémica (SIRS) - Shock séptico - Falla multiorgánica (MOF) 5. Alcoholismo: - Hepatopatía alcohólica 6. Pulmón: - Hiperoxia - Hábito de fumar - Enfermedad obstructiva crónica 7. Sistema cardiovascular: - Aterosclerosis - Toxicidad de adriamicina - Enfermedad de Keshan (Se): inicialmente se pensó que era patología de origen genético y posteriormente se descubrió que es una patología que se genera como consecuencia de una baja biodisponibilidad de Selenio, el cual se adquiere exclusivamente a través de la dieta. Por lo tanto, el Selenio es parte de los sistemas antioxidantes importantes que tiene nuestro organismo. - Síndrome metabólico - Disfunción endotelial 8. Riñón: - Síndrome nefrótico autoinmune (en las enfermedades autoinmune el stress oxidativo tiene mucho que ver) - Nefrotoxicidad de Pb, Cd y Hg (metales pesados) 9. - Sistema Nervioso central: Enfermedad de Parkinson Enfermedad de Alzheimer Esclerosis múltiple (Las enfermedades neurodegenerativas están muy vinculadas con aumento de stress oxidativo) 10. Ojos: - Cataratas - Degeneración macular 11. Hepatotoxicidad de: - Hidrocarburos halogenados (Tetracloruro de Carbono Cl4C, Bromo benceno: Los cuales generan daño hepático a través de stress oxidativo) 12. Daño por radiaciones: - Exposiciones accidentales - Radioterapia (Las reacciones ionizantes generan importantes niveles de especies reactivas del oxígeno) Daño por isquemia y reperfusión: Normalmente la conversión de Hipoxantina a Xantina, esta mediado por Xantina Oxidasa y esta conversión va a llevar a que se genere una cantidad importante de anión superóxido O2-, siempre y cuando haya biodisponibilidad de Oxigeno O2. Cuando hay un proceso isquémico, es decir proceso de perfusión del órgano se ve afectado porque ocurre por ejemplo obstrucción de un vaso, inicialmente ese proceso va a llevar a que caiga la biodisponibilidad de oxígeno y por consecuencia se genere la activación de proteasa dependiente de calcio, porque precisamente uno de los elementos que más rápido ocurre en el cambio de la biodisponibilidad intracelular cuando hay un evento de naturaleza hipóxica es el desbalance del pool endógeno de calcio, lo cual conlleva a la activación de las Ca-dependiente proteasa(s), que lleva la conversión de Xantina Deshidrogenasa a Xantina Oxidasa. En estas condiciones la Xantina oxidasa comienza a producir anión superóxido (O2-) ¿La isquemia funciona en situaciones hipóxicas? - La isquemia no es más que la falta o disminución del aporte de oxígeno a través de la circulación de un tejido en particular. La disminución de oxígeno genera evento Hipóxico. La isquemia define el proceso más macro. La hipoxia es un proceso que habla de la biodisponibilidad de oxígeno, que puede ser por ejemplo en este caso en particular, porque se produce el taponamiento de una arteria, se interrumpe el flujo sanguíneo, por lo tanto, el oxígeno que venía con la hemoglobina se ve interrumpido, por lo que el oxígeno biodisponible en ese tejido cae y eso es una condición de hipoxia. Después de que se produce este proceso isquémico, ocurre un proceso activo de reperfusión, ósea se vuelve a restablecer ese flujo y aumenta abruptamente la concentración de oxígeno biodisponible. Entonces el sistema de la xantino oxidasa, va a producir cantidades importantes de anión superóxido (O2-). Entonces en el proceso de isquemia-reperfusión, se restablece la oxigenación, como hay más producción de O2-, también puede estar asociado con un mayor daño en el tejido, por lo tanto, los procesos de manejo de eventos isquémicos también tienen que ser manejados para un balance lo más correcto posible. Esto también es muy importante por ejemplo en el transporte de órganos que van a ser trasplantados. Cuando ese órgano del donante que primero se extrae, va a estar en condición de isquemia porque va a haber disminuido la biodisponibilidad de oxígeno por el torrente sanguíneo o porque el órgano obviamente se ha resecado y llevado a una condición en donde no hay un flujo normal de oxígeno. Por eso se han desarrollado una serie de métodos y soluciones acuosas que favorecen el proceso de reperfusión. Una vez que el órgano se instale en el receptor y cuando se restablezca la circulación sanguínea, este órgano no se vaya a dañar precisamente por este daño por isquemia y reperfusión. Estas son condiciones tomadas en cuenta durante un manejo clínico de un accidente vascular y también son condiciones consideradas en el diseño de soluciones especiales para el transporte de órganos, sobre todo cuando implica tiempos importantes de transportación, por lo que las condiciones isquémicas de ese órgano son prolongadas Aterosclerosis. Modificaciones oxidativas de la LDL: Este es otro elemento relevante en el contexto de la patología humana y el estrés oxidativo. Hoy se tiene total certeza que las LDL oxidadas juegan un papel muy relevante en el contexto de la formación de placa ateromatosa, porque precisamente a través de la captación de las LDL oxidada por parte de macrófagos tisulares, por parte de receptores de scavenger los macrófagos se convierten en las células espumosas que son precursores de la placa ateromatosa. Teoría modificación oxidativa de la aterosclerosis: Aquí vemos lo relevante que pueden ser las LDL oxidadas cuando este proceso de las partículas se produce mayoritariamente porque se ha instalado una condición de estrés oxidativo particularmente de especies reactivas derivadas del oxígeno, particularmente anión superóxido O2-, que conlleva que la LDL se oxide y sea captada por el sistema monocito macrófago residente tisular a través de los receptores scavenger mayoritariamente SR36 y entonces cuando empieza a incorporarse la LDL oxidada dentro del macrófago, este último se convierte en célula espumosa y esta tiene consecuencias importantes dentro de la vasculatura hacia la formación de la placa ateromatosa EROs y ERNs poseen diversos orígenes Orígenes como mitocondrias, células endoteliales, células sistema inmune. Entonces no hay que perder de vista que estas especies reactivas tanto del oxígeno como del nitrógeno tienen los más diversos orígenes. Desde sus organelos celulares hasta sistema inmunidad innata, mecanismos de defensa como proceso inflamatorio. Por lo tanto, es de esperar que nuestro organismo que posea mecanismos de defensa importantes hacia los efectos nocivos que pueden generar las especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno (NO; O2-; H2O2; ONOO-) Estrés oxidativo y cáncer El estrés oxidativo esta estrictamente vinculado con el desarrollo de cáncer a través de múltiples mecanismos. Particularmente el estrés oxidativo a través de la generación de eventos mutacionales o de daño en las moléculas de ADN, como por ejemplo desaminación o nitración de bases, formación de ruptura de doble o simple cadena, puede conllevar a la activación de oncogenes, ósea la conversión de protooncogenes a oncogenes o inactivación de genes supresores de tumores. Estos 2 procesos transcurren por eventos mutacionales que tienen impacto importante en el desarrollo del proceso de transformación maligna. El estrés oxidativo entonces es capaz de aportar a este proceso de transformación celular y así generar cáncer. Enfermedad pulmonar obstructiva crónica y estrés oxidativo Es conocido que los pacientes que sufren de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en algún momento fueron fumadores intensos. Precisamente esta descrito que el mecanismo a través del cual el humo del cigarrillo en primer lugar es capaz de generar activación de un proceso inflamatorio de todo el epitelio en las vías aéreas. Por otro lado, todas las especies reactivas que vienen de parte del humo del cigarrillo o por el proceso inflamatorio, conllevan a que empiecen a disminuir mecanismos importantes de protección, por ejemplo, las antiproteasas alfa 1 antitripsina a nivel del árbol bronquial o se empiecen a activar factores transcripcionales vinculados estrictamente con actividad inflamatoria. Eso conlleva a que se produzca un incremento en la secreción de mucus, aumente permeabilidad vascular de toda la red de vasos que están irrigando el pulmón por lo tanto empieza a formarse edema. Y por otro lado todos estos compuestos son capaces de mediar eventos de broncoconstricción particularmente a través de formación de isoprostanos que son derivados de ácidos grasos polinsaturados que han sido oxidados tanto de especies reactivas del oxígeno como del nitrógeno. Y eso es lo que conlleva a esta condición de enfermedad pulmonar obstructiva crónica La interconexión entre el estrés oxidativo y el estrés carbonílico A fines de la década de los 90 se acuño a un 3 termino de estrés celular y que está muy vinculado con el estrés oxidativo, el cual es llamado Estrés Carbonílico . Termino descrito por primera vez en 1997 en la revista Diabetes Reviws por Lyons y Jenkins El estrés carbonílico no es más que un exceso persistente de moléculas que poseen en su estructura dos grupos carbonílicos, es decir, el estrés carbonílico está gatillado por la presencia excesiva de moléculas conocidas como D-carbonilo son muy reactivos con residuos libres tanto de lisina como de arginina, induciendo la formación irreversible y la acumulación de estructuras denominados productos avanzados de la glicación (AGEs) Los productos avanzados de la glicación son productos inicialmente descritos durante un par de siglos por un químico francés que se dedicaba a estudiar el porqué del proceso de la caramelización de los alimentos cuando se sometían a altas temperaturas, a lo largos de los años se sabe que las altas temperaturas favorece la reacción entre los grupos aminos de las proteínas con azúcares reductoras como la glucosa o fructosa, este proceso genera primero una estructura conocida como base de Schiff, posteriormente se forma el producto de Amadori y luego este es reconvertido a estructuras más complejas que son los productos avanzados de glicación (AGEs por sus siglas en inglés), sin embargo, tanto la glucosa, como lípidos y aminoácidos pueden a través de reacciones de oxidación, formar los dicarbonilos (que están representados con esta molécula de glioxal) también pueden interactuar con los grupos aminos de las proteínas y formar AGEs, pero de una forma más directa, o sea, la reacción inicial conocida como reacción de Millard en una fase más tardía. ¿Por qué son tan importantes los productos avanzados de la glicación en la patología humana? Porque estas mismas reacciones ocurren en los pacientes diabéticos o episodios de hiperglicemia , esta reacción se acelera porque hay una mayor biodisponibilidad de glucosa, es la principal característica de la diabetes y el desbalance del metabolismo de la glucosa y por tanto se empiezan a formar estos productos en los que la hemoglobina glicada (que es un marcador de hiperglicemia) es un producto de Amadori, lo relevante es que no solamente por el estrés oxidativo es capaz de aumentar este proceso de formación de AGEs, sino también el estrés oxidativo que es un elemento basal importante en el contexto de la diabetes. Puede producir por ejemplo en esencia aumento en toda la vía del sorbitol, la vía de la proteinasa C y en esencia todo eso va a llevar a elementos que convergen en lo que se conoce como la patología vascular diabética. Hay que recalcar que el estrés oxidativo y el estrés carbonílico es muy relevante en la patología humana y en particular de la diabetes. Los AGEs han estado vinculados al estrés oxidativo porque precisamente las especies reactivas del oxígeno favorece la formación de AGEs, durante este proceso se generan especies reactivas de oxígeno, por lo que hay una relación indisoluble entre formación de AGEs y estrés oxidativo. Se han visto como impactos importantes que producen los AGEs en el contexto de la fisiopatología están mediados por el aporte de especies reactivas del oxígeno y como el uso de antioxidantes de alguna forma pueden minimizar los efectos nocivos de AGEs en contexto de la salud humana. En tal sentido los AGEs son reconocidos por un receptor que se conoce como Receptor de los Productos Avanzados de Glicación (RAGE). Cuando se produce este reconocimiento se produce inicialmente un elemento que es trascendental en el establecimiento de la condición de estrés oxidativo, que es la activación de la NADPH oxidasa, si uno de los eventos postreconocimiento ligando-receptor en el caso de los AGEs y RACE como su receptor es la activación de la NADPH oxidasa empieza a producir importantes cantidades de anión superóxido, esto tiene implicaciones importantes sobre el endotelio vascular aumentando un desbalance vasomotor porque disminuyen los vasodilatadores endógenos (producción de óxido nítrico y prostaciclina), sin embargo la activación de este receptor favorece la producción de endotelina I y por lo tanto la vasoconstricción, aumenta todo lo que sea un número importante de moléculas de adhesión que tienen que ver con el proceso de adherencia y migración de leucocito, se activa factores transcripcionales que son dependiente del estado redox y por lo tanto como es el sistema NF B y haciendo la salvedad es importante vinculado con muchos genes que sus productos génicos están relacionados con la respuesta inflamatoria, por lo tanto el impacto que tienen los AGEs en la patología humana es importante considerando que todas las complicaciones vasculares y microvasculares renales de la diabetes están vinculados muy cercanamente con la fisiopatología que subyace a la activación de este sistema del receptor. Radicales libres: ¿amigos o enemigos? Se ha estigmatizado los radicales libres como una forma nociva que puede afectar nuestra salud, por lo que esta pregunta debe responderse de forma cautelosa porque los radicales libres tienen un papel importante en la fisiología, con en la señalización intracelular. El efecto de radicales libres en procesos vitales en el contexto de la fisiología: Estos sistemas relacionados con señalización tienen respuestas diferentes (activación o desactivación) o incluso en las cantidades disponibles en las especies reactivas en diferentes formas, que son esenciales en la fisiología humana. Por lo que hablar de radicales libres no es 100% negativo, lo negativo debe ser en el contexto de estrés que implica el desbalance. Bajo ningún concepto se puede entender que estrés oxidativo es lo mismo que desbalance redox, el desbalance redox es una consecuencia del estrés oxidativo y porque el estrés va a disminuir estos sistemas de detoxificación, ya que estos sistemas están definidos por el pool de tioles (particularmente por el sistema glutatión) y por el pool intracelular de NADPH/NADP+ y por el NADH/NAD+, son los principales elementos intracelulares que actúan como detoxificadores, o sea, elementos no enzimáticos en términos de mantener la producción de especies reactivas intracelulares en un contexto que no sea un estrés oxidativo, cuando se produce estrés oxidativo se produce a expensas del agotamiento de estos sistemas y ahí es cuando se produce un desbalance en el estatus redox intracelular. ¿Qué es un antioxidante? Toda sustancia que hallándose presente a bajas concentraciones respecto a las de un sustrato oxidable (biomoléculas), retarda o previene la oxidación de dicho sustrato. Eso es lo que hoy en día se conoce como una molécula antioxidante. ¿Qué características debe tener una molécula para actuar como antioxidante? Alta biodistribución: Debe estar presente, en el lugar crítico y en las concentraciones adecuadas, en las condiciones apropiadas, ya que, los radicales libres tienen una vida media muy corta. (si se forma un radical que puede ir desde los minutos hasta milisegundos, si no está disponible un antioxidante puede causar un daño en particular) Inespecífico: Preferiblemente deberían de reaccionar con cualquier clase de radical libre. Debe de ser sintetizado por la célula o bien incorporado en la dieta como es el caso de la vitamina C. Debe ser reciclado, para que pase a una forma oxidada para que vuelva a su forma luego de realizada su inactivación, su forma reducida es la forma en la cual puede volver a reaccionar con una especie reactiva. Si es una molécula sintética, no debe de ser tóxica. Mecanismos de defensa antioxidante Sistemas enzimáticos SOD Catalasa Glutatión peroxidasa Sistemas no enzimáticos Tocoferol -carotenos flavonoides Ascorbato Urato Glutatión y otros tioles Oligoelementos (Zn, Mn, Se, etc) Proteínas con capacidad de formar enlaces coordinados con metales metalotioneína y ceruloplasmina (Cu++) ferritina, transferrina, lactoferrina (Fe++) Esas proteínas también son capaces, al tener estos metales en su estructura, de interaccionar con especies reactivas y así inactivar esta especie radicalaria. Hemos visto que nuestro organismo tiene una serie de mecanismos para responder ante el estrés y particularmente en esta clase, el estrés oxidativo. Sin embargo, con el cursar de los años, se ha visto que todas nuestras células son capaces de responder al estrés de una forma mucho más refinada que simplemente tener biodisponibles en su citoplasma u organelos elementos que sean capaces de contrarrestar, de alguna forma, los elementos que están generando estrés (en este caso particular, las especies reactivas). En cierto sentido, estos nuevos mecanismos que se han descrito están agrupados en lo que se conoce como ¿Cuáles son los elementos de una vía clásica de respuesta a estrés? - La señal de estrés - Un transductor, que de cierta forma es el que traduce esa señal externa a un lenguaje común intracelular - Un sensor del transductor, que ha detectado la presencia de estrés - Un factor transcripción al que se ha activado por el sistema de sensores y que es capaz, en su forma activada, de viajar hacia el núcleo y reconocer en la molécula de ADN (y regiones promotoras de algunos genes), elementos de respuesta antiestrés. En esencia, son secuencias de consenso de unión para estos factores transcripcionales que son activados a través de una vía de respuesta a estrés. Por lo tanto, se activará la transcripción de genes antiestrés (que van a producir proteínas vinculadas a tratar de amortizar esta respuesta a estrés) Aquí se pueden observar diferentes sistemas de respuesta a estrés. Se observa que no solamente hay sistema de respuesta a estrés oxidativo, sino que también hay sistema de respuesta a estrés genotóxico, hipoxia, choque térmico, inflamación y a metales. El estrés oxidativo, más allá de estos elementos de naturaleza enzimática y no enzimática que responden y serán importantes para contrarrestar el efecto nocivo de especies reactivas. También hay un sistema de respuesta a estrés que implica transcripción génica. En este sistema, el inductor son las especies reactivas, el sensor es una proteína conocida como keap-1 y el factor transcripcional es el Nrf-2. En este sistema, cuando se han desarrollado una serie de sistemas experimentales y cuando se puede generar un animal o célula, y este no posee (está apagado) el gen que codifica el sensor, esto será incompatible con la vida. No puede existir un animal que no posea activo el gen del sensor de la vía de respuesta a estrés oxidativo. Si se generara un embrión, este no se desarrollaría. Aquí tenemos la vía clásica de respuesta a estrés oxidativo que es el sistema Nrf2 / Keap1. Este sistema se encuentra normalmente asociado al citoesqueleto celular, por lo tanto tiene una amplia distribución dentro del citoplasma .También es activado por especies reactivas del oxígeno, que en presencia de estrés oxidativo, van a activar este sensor capaz de activar el factor transcripcional Nrf2 (el que ira hacia el núcleo para detectar las regiones de consenso (regiones conocidas como elementos de respuesta antioxidante/electrofílica) favoreciendo así, que se transcriban genes que en esencia van a ser elementos que contrarrestarán el estrés oxidativo. El sistema Nrf2 es capaz de activar aproxima 500 genes de nuestro genoma, produciendo una respuesta extraordinariamente diversa y amplia para trata de contrarrestar este estrés oxidativo. Por muchos años, el ozono ha sido utilizado en la práctica clínica como por ejemplo en la ozonoterapia. Este ha sido efectivo en ensayos clínicos y ha mostrado efectividad a pesar de haber tenido muchos detractores, todo esto debido a que no entendían cómo era posible administrar una molécula altamente oxidante que se ha demostrado tener efectos tóxicos sobre el sistema respiratorio. No entendían como podía gatillar algo beneficioso en el organismo humano. Un farmacólogo italiano, Lamberto Re, promotor de la ozonoterapia y con la colaboración de Morales-Segura de la universidad de Chile, hicieron un estudio en pacientes donde demostraban que la ozonoterapia activa el sistema Nrf2 (capaz de activar una respuesta antioxidante muy potente). Por ende, postulaban que, bajo ciertas consideraciones, la ozonoterapia podría ser una terapia beneficiosa. En esencia, según lo que se ha visto en esta clase, la mantención del balance es realmente lo importante. No podemos ver a las especies reactivas del oxígeno y nitrógeno como enemigos si aquí lo importante es impedir el establecimiento de un estrés (ya sea oxidativo, nitrosativo o carbonílico). La única forma, que es de fácil acceso y que es parte de la gran mayoría de las políticas públicas, es mantener un estilo de vida saludable, precisamente en términos de mantener el balance de lo que es salud y enfermedad, el aporte a la dieta, no fumar, evitar el consumo en exceso de bebidas alcohólicas y obviamente el ejercicio físico (hay sistema de respuesta a estrés, especialmente el Nrf2 que se activa en respuesta a ejercicio físico intenso). Esto será lo que mantendrá el balance necesario entre especies reactivas del oxígeno y nitrógeno con nuestra salud. Preguntas al final de la clase No me quedo claro lo que hacía el estrés oxidativo en relación con la modificación de bases R: Las especies reactivas del oxígeno como por ejemplo los radicales hidroxilos pueden generar la 8 hidroxiguanina y también el peroxinitrito puede generar la nitroguanina. Esos son eventos mutacionales porque se está cambiando la conformación de la base. Cuando se produzca una próxima replicación del ADN, la polimerasa se preguntará ¿qué base le pongo a una 8 nitroguanina? Eso será un error y por un mecanismo de bypass se va a producir un corrimiento de Marco de lectura que puede tener consecuencia en la secuencia aminoacídica, o simplemente se pone una base que no corresponda y ahí se genera una mutación puntual. La Granulomatosis es una enfermedad que no me quedó claro cómo funcionaba y como se había formado R: La Granulomatosis crónica es una enfermedad genética en donde la característica de los pacientes es que tenían infecciones bacterianas de forma recurrente. Eso no es normal ya que nuestro sistema inmune es suficientemente potente a no ser que nos encontremos con un patogeno altamente potente. Estamos expuestos a un sin número de patogenos de manera cotidiana. Por lo tanto, estos pacientes tienen una susceptibilidad muy alta a enfermedades de naturaleza bacteriana. Cuando se empieza estudiar a estos pacientes, el mecanismo molecular de la patología se define como mutaciones en algunos de los componentes del sistema de la NADPH oxidasa. Este es un sistema esencial en la inmunidad innata y es precisamente porque a través de la producción de súper óxido, nuestras células del sistema inmune (sobretodo las fagociticas) son capaces de eliminar las bacterias fagocitadas una vez que se produce la fusión del fagosoma con el lisosoma celular. No entendí la relación entre el estrés oxidativo y las personas con diabetes R: el estrés oxidativo y la diabetes están estrechamente vinculadas porque la diabetes se produce cuando se instaura una condición de hiperglicemia (evento que gatilla las repercusiones orgánicas celulares de la diabete). Esta hiperglicemia puede generar diversos mecanismos de activación de estrés oxidativo lo que conlleva a la activación de vías de producción de especies reactivas como puede ser la NADPH oxidasa. Pero también se activa la producción de productos avanzados de glicacion porque hay hiperglicemia, entonces uno de los reactantes está en mayor concentración, por lo tanto, la velocidad de la reacción va a transcurrir a mayor velocidad. Por otro lado, esa misma condición de hiperglicemia, puede generar la formación de dicarbonilos que en esencia van a producir más productos avanzados de glicacion y por ende todos estos compuestos al interaccionar con el receptor RAGE, el primer elemento que se activa después del reconocimiento del receptor con el producto avanzado de glicacion, va a ser la activación del sistema NADPH oxidasa que va a producir cantidades muy altas de ánimo súper óxido. Eso genera un ciclo virtuoso en términos de producir cada vez más estrés oxidativo.