Producción Microbiana de Enzimas, Pigmentos y Vitaminas - PDF

Tema 7 - Producción microbiana de enzimas, pigmentos y vitaminas 1. Enzimas microbianas Son las más importantes. Se producen para la industria alimentaria; la industria química en detergentes y como biocatalizadores y en la industria farmacéutica. Las enzimas producidos por microorganismos son...

Tema 7 - Producción microbiana de enzimas, pigmentos y vitaminas 1. Enzimas microbianas Son las más importantes. Se producen para la industria alimentaria; la industria química en detergentes y como biocatalizadores y en la industria farmacéutica. Las enzimas producidos por microorganismos son amilasas, proteasas, lipasas, pectinasas, L-asparaginasas, penicilina y cefalosporina acilasas, lactasas.. a. Amilasa Es una enzima que hidroliza el almidón, que es un polímero formado por unidades de glucosa unidas mediante enlaces glucosídicos ⍺ (1, 4). Hay diferentes tipos de amilasas: - ⍺ - amilasas: endoenzimas que hidrolizan los enlaces ⍺ (1, 4) en el interior de la molécula - B – amilasas: hidrolizan el enlace glucosídico en el extremo de la cadena (liberan maltosa) - Glucoamilasas: hidrolizan el enlace glucosídico liberando monómeros del glucosa en el extremo no reductor Las amilasas tienen diferentes aplicaciones, en general se usan para la hidrólisis del almidón en cualquier proceso; aunque particularmente son muy importantes en la producción de jarabes edulcorantes como son el jarabe de glucosa o de fructosa. Respecto a los microorganismos productores de amilasa, estos varían en función de la amilasa que se busque: - ⍺ - amilasas Producido por bacterias, entre otros, del género Bacillus (B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis) y por hongos, entre otros, del género Aspergillus, Penicillium, Mucor. - B – amilasas Son generalmente de origen vegetal, aunque también las producen algunos microorganismos como Bacillus polymyxa, Streptomyces sp - Glucoamilasas Producidos por hongos, preferentemente especies del género Aspergillus (A. niger, A. oryzae) y Rhizopus (R. niveus). La producción es inducible por sustrato y sometida a represión catabólica - Glucosa isomerasa Para la producción de jarabes edulcorantes el uso de amilasas se complementa con la glucosa isomerasa que causa la isomerización de glucosa a fructosa. Los microorganismos productores son especies del género Bacillus y Streptomyces. La enzima es realmente una xilosa isomerasa que tiene actividad adicional sobre la D-glucosa. La producción es inducible por xilosa, (que se puede sustituir por xilano o “miga de pan”) y sometida a represión catabólica. Para Streptomyces existen mutantes que no requieren xilosa Obtención de jarabes edulcorantes b. Proteasas Son enzimas que hidrolizan proteínas, y sus principales aplicaciones son en la industria de los detergentes y la industria láctea. Existen diferentes tipos de proteasas: - Proteasas alcalinas: son las proteasas de interés para incluir en los detergentes. Los organismos productores son especies del género Bacillus (B. licheniformis) y Arpergillus. Deben reunir las siguientes características: - Estables a elevadas temperaturas - Estables a pH 9-11 - Estables en presencia de agentes quelantes y perboratos - Proteasas ácidas: son de e interés para la industria láctea las que actúa sobre la caseína de forma similar a la quimosina animal y los microorganismos productores son los hongos Rhizomucor miehei (Mucor miehei) y Cryphonectria parasitica (Endothia parasitica). Tienen las siguientes características: - Coagulación de la caseína - Baja proteólisis para impedir el desarrollo de amargor durante la maduración - Baja actividad lipásica para evitar el desarrollo de sabor rancio  c. L-asparaginasas Es una enzima intracelular. Se usa en industria farmacéutica como agentes antitumorales para leucemias y linfomas. Su mecanismo de acción es que el metabolismo de las células tumorales requiere asparagina, la cual por acción de esta enzima se hidroliza a ácido aspártico y NH4+ (amonio) que conlleva a la destrucción de las células malignas. Los microorganismos productores son mutantes de E. coli, Serratia, Erwinia. d. Pectinasas Se usan en la industria alimentaria para la obtención y clarificación de zumos de frutas, maceración de vegetales y extracción de aceite de oliva (en algunos países, no permitido en España). Hay diferentes tipos: - Pectin metil esterasas: liberan los grupos metilo. - Poligalacturonasas (endo- y exo-): despolimerizantes, cortan en cualquier lugar. Los microorganismos productores son Aspergillus niger (más utilizado) y Erwinia carotovora. Su producción es inducible por sustrato (pectina en el medio) y reprimible por glucosa. e. Penicilina y cefalosporina acilasas Se usan en la industria farmacéutica para obtención de penicilinas semisintéticas (antibióticos β- lactámicos) a partir de la penicilina G. - Penicilina G: núcleo 6-aminopenicilánico (6-APA) + radical ácido fenilacético. Mejor que la natural, menos sensible al ácido estomacal. Las distintas penicilinas difieren en el radical de la natural. Se pueden obtener por producción de penicilina G y utilización de la penicilina acilasa para eliminar el radicar dejar libre el núcleo para añadir otro radical químicamente. Es producida por E. coli, su producción es inducible por ácido fenilacético y reprimible por glucosa. Es una enzima intracelular - Cefalosporina: ocurre del mismo modo, la natural es la cefalosporina C con su radical característico que se elimina con la cefalosporina amilasa, y se añade otro radical químicamente. Es producida por Pseudomonas f. Lactasas Son β-galactosidasas que hidrolizan la lactosa en glucosa y galactosa. Se utilizan en la industria farmacéutica y alimentaria. Se trata de enzimas digestivas en casos de intolerancia a la lactosa; se usan como aditivos para piensos animales, ya que aumenta el valor nutritivo cuando van suplementados con lactosa. Son usados para la preparación de leche y derivados con bajo contenido en lactosa. Los microorganismos productores son muchas bacterias (acumulan intracelularmente la enzima) y hongos (secreción extracelular, preferible, Aspergillus oryzae y A. niger.) Se producen mediante mecanismos regulatorios. Es inducible por lactosa y reprimible por glucosa (fuente de C que podría estar utilizando el organismo en el proceso industrial para crecer). 2. Obtención de cepas mejoradas/hiperproductoras por mutagénesis Se trata de la obtención de mutantes constitutivos (mutagénesis) que producen constantemente sin que interfiera el mecanismo regulatorio. Es la estrategia más clásica. La producción de enzimas está regulada por mecanismos de inducción y mecanismos de represión, que puede ser represión por producto final o represión catabólica (ejercida normalmente por la fuente de C que suele ser glucosa). Ejemplo: β-galactosidasa (lactasa) que hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa. a. Regulación por mecanismos de inducción La lactasa hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa. La síntesis de esta enzima se produce cuando aparece lactosa en el medio. Se sintetiza además lactósido permeasa que permite la entrada de la lactosa. El mecanismo de acción se produce de manera secuencial, siendo la lactosa el 1º inductor y la galactosa el 2º. Los genes que codifican estas proteínas, así como sus reguladores (moléculas represoras), se organizan en un operón denominado operón lactosa. - Medio sin lactosa: el gen I sintetiza el represor activo que se une al operador, por lo que no hay transcripción de los genes estructurales. - Medio con lactosa: la lactosa se une al represor inactivándolo por lo que este no se une al operador y sí se produce la transcripción. Hay dos tipos de mutantes de interés: - Mutantes del gen I: sintetizan un represor inactivo. - Mutantes en el operador (O): no es reconocido por el represor por lo que no se produce la unión.  b. Regulación por mecanismos de represión - Por catabolito: - Crecimiento diáuxico: hay dos fuentes de C, la glucosa y la lactosa. Mientras haya glucosa en el medio esta será consumida por los microorganismos realizando una primera curva de crecimiento. Esta reprime la síntesis de las enzimas que permiten utilizar la lactosa como fuente de C (degradarla). Cuando es consumida, se activan las enzimas que permiten utilizar la lactosa y se realiza una segunda curva de crecimiento. - Control adicional: a nivel de ARNpol regulado por el AMPc. Si se añade glucosa al medio disminuye la [AMPc], si se añade AMPc la represión es suprimida. - Medio con lactosa y sin glucosa: la lactosa se une al represor para inactivarlo. Además se requiere de la proteína CRP que se une al AMPc formando un complejo que se fija a la región promotora permitiendo la fijación de la ARN polimerasa para que se transcriban los genes estructurales. - Medio con glucosa (y lactosa): la glucosa inhibe la adenilato ciclasa responsable de transformar el ATP en AMPc. No se forma AMPc por lo que tampoco el complejo CRP-AMPc y no se fija la ARNpol por lo que no hay transcripción de los genes. - Mutantes hiperproductores: los mutantes desregulados son difíciles de obtener, es mejor actuar a nivel del proceso fermentativo. - Desregulados para la glucosa (no sensibles). - Sustituir la fuente de C por otra represora. - Añadir la fuente de C en pequeñas cantidades durante toda la fermentación. - Adición de AMPc al medio. - Por producto final - Presencia del producto: el producto final se une al represor activándolo, formando un complejo represor-correpresor, este se une al operador e impide la transcripción. - Ausencia del producto: el represor se encuentra inactivo y no se une al operador por lo que hay transcripción. - Mutantes: alterados en el operador (no es reconocido por el complejo represor-correpresor). 3. Obtención de cepas mejoradas/hiperproductoras por expresión heteróloga a. Genes de microorganismos conocidos y previamente aislados - De organismos superiores: animales y plantas. Ej: gen de la insulina (Homo sapiens), gen de la quimosina (Bos taurus) y gen de la quitinasa (Vitis vinífera; degrada la quitina de las paredes celulares de hongos) - De microorganismos: virus. bacterias y hongos; los mayoritarios. Ej: gen de la proteína S / antígeno S (virus hepatitis B), genes de pectinasas (Erwinia carotovora y Aspergillus niger) y genes de lipasas (Candida lipolítica). b. Genes obtenidos con nuevos métodos de bioprospección (metagenómica). Nos permite obtener los genes del medio ambiente independientemente de los microorganismos. - Metagenoma: genoma colectivo de la microbiota total que se encuentra en un determinado hábitat. - Metagenómica: análisis genómico de las comunidades de microorganismos de un determinado ambiente sin emplear técnicas de cultivo. Es un término utilizado por primera vez por Jo Handelsman. Consiste en determinar qué microorganismos hay en una muestra, qué hacen y qué podrían hacer (acción que nos interesa) sin necesidad de cultivarlos (algunos no son cultivables). Los objetivos son: - Estudiar la biodiversidad microbiana de un determinado hábitat sin necesidad de cultivar a los microorganismos (empleando el genoma mixto de la comunidad microbiana). Se estudian los genes que codifican el ARNr 16S que permite determinar, por lo menos a nivel de género, todos los microorganismos de la muestra. - Identificar genes funcionales y/o grupos de genes implicados en nuevas rutas metabólicas. El proceso que se usa es: - Extracción del ADN directamente del ambiente (muestra ambiental).  - Construcción de una biblioteca (librería) metagenómica con este genoma mixto. Una biblioteca metagenómica es un conjunto de moléculas recombinantes (se fragmentan en trozos y se clonan en un vector) que contienen el ADN microbiano presente en un determinado ambiente o muestra. Genómica microbiana vs Metagenómica: la mayor parte de los microorganismos y de productos microbianos de interés aplicado están todavía por descubrir, para lo cual es más útil la metagenómica Genómica Metagenómica Los microorganismos pueden ser estudiados individualmente Estudia el genoma de las comunidades microbianas como un Requiere el cultivo de los microorganismos todo Apenas el 1% de los microorganismos puede ser cultivado en el No es necesario el cultivo de microorganismos laboratorio Permite identificar nuevas especies y/o nuevos genes/moléculas Las muestras se obtienen de plantas, animales, suelos, agua de mar (o dulce), ambientes extremos microbiota humana (bucal o intestinal). Los tipos dependen del enfoque de trabajo. - Metagenómica basada en la secuencia: pretende determinar cuáles son los genes, es decir, la identificación de genes y rutas metabólicas y su comparación con otras comunidades. - Muestra natural: extraer el ADN microbiano presente en la muestra: si lo hacemos migrar como un ADN de alto peso molecular. - Fragmentación del ADN: en trozos más pequeños mediante enzimas endonucleasas de restricción: migran más en el gel, en forma de arrastre debido a los diferentes fragmentos. - Clonación en un vector: cada uno de los fragmentos en un plásmido. - Biblioteca metagenómica: se obtiene un conjunto de plásmidos, cada uno con su fragmento de ADN metagenómico (molécula recombinante). Lo más común es introducir los plásmidos en células de E.coli para poder trabajar con ellos por separado, por lo que también conforma una biblioteca metagenómica. - Secuenciación: extraer la secuencia de cada fragmento de ADN. - Análisis bioinformático: se compara la secuencia obtenida con las incluidas en las bases de datos.ADNr 16S: nos dice a qué se parece (género). Otros genes nos dan información de qué productos de interés sintetiza el gen (su función). - Metagenómica basada en la función: pretende determinar qué hacen los genes, es decir, buscar funciones de interés (producción de enzimas, vitaminas, antibióticos…) y determinar qué genes participan en dichas funciones. - Muestra natural: extraer el ADN microbiano de la muestra. - Fragmentación del ADN: enzimas endonucleasas de restricción. - Clonación en un vector: en este caso ya es un vector de expresión que nos permita expresar los genes presentes en el ADN clonado. - Biblioteca metagenómica: conjunto de plásmidos. Introducción de los plásmidos en células de E. coli. - Detección de funciones: se pueden preparar cultivos concretos para sembrar la biblioteca metagenómica y detectar funciones. Ej: genes que codifican para amilasas se siembra en medio con almidón, se añadiría a la placa una solución de yodo que tiñe el almidón observándose una zona sin teñir (halo transparente) alrededor de las células productoras de amilasas (almidón degradado). - Secuenciación: extraer la secuencia de cada fragmento de ADN. - Análisis bioinformático: para saber si el gen ya se conoce o es un gen nuevo que codifica para una amilasa diferente. Existen diferentes proyectos de metagenómica: - Estudio metagenómico de los microorganismos del Mar Sargasso (publicado en la Revista Científica Science en 2004): Craig Venter (búsqueda de nuevos microorganismos de interés industrial). - Estudio del metagenoma de la cavidad bucal: científicos de la Universidad de Stanford (detección y tratamiento de las enfermedades buco dentales). - Metagenoma de los microorganismos residentes en el cuerpo humano: Centro de Secuenciación en la Escuela de Medicina Baylor, en Houston. - Otros: distintos ambientes extremos, drenaje ácido de minas, suelos… c. Genes quiméricos (evolución dirigida) De diseño en laboratorio, se obtienen por evolución dirigida (planteamiento técnico de la biología molecular que permite generar nuevas variantes de un gen artificialmente en laboratorio y seleccionar las de mayor interés). - Error prone PCR (PCR propensa a error): en condiciones normales se pretende obtener una copia lo más fiel posible (polimerasa con errores mínimos), en cambio, en esta técnica nos interesa que se obtengan variantes del gen de interés para ver si se obtienen algunas de mayor importancia/interés.  - Amplificación del gen de interés (PCR) en condiciones que favorezcan la introducción de errores en las copias amplificadas. Se usa ADN-pol de baja fidelidad de copia. Se produce un desbalance de dNTPs (no se añaden en la misma concentración) y se realiza un alto nº de ciclos de PCR para ampliar la posibilidad de cometer errores. - Se genera un pool de variantes del gen amplificado: copias con mutaciones. - Se hace un estudio de cada una de las copias mutadas para ver qué producen. - Clonación en un vector de expresión. - Biblioteca genómica con todas las variantes. - Se expresan en E. coli y se observa la producción de productoanalizando sus propiedades comparativamente con el producto del gen original. - La mayoría dará lugar a productos aberrantes, no funcionales o peores que el original… pero alguno puede poseer propiedades mejoradas (más estable a ciertos pHs, que funcione a otras T o pH…). - DNA shuffling (barajado de ADN): más complicada, no se parte de un solo gen. Se parte de varios genes que codifican productos (enzimas) con diferentes propiedades. Se fragmentan mediante digestión con una ADNasa (endonucleasas de restricción) obteniéndose un pool de fragmentos de los genes originales. Se someten a ciclos de PCR (desnaturalización, hibridación y extensión) sin cebadores, por lo que los propios fragmentos funcionan como cebadores uniéndose a cadenas que reconozcan y se generan moléculas híbridas. Las moléculas híbridas se someten también a amplificación (PCR) utilizando cebadores que flanquean los extremos del gen. Se obtienen amplificaciones de genes completos del mismo tamaño que los iniciales, pero constituidos por regiones de ADN que proceden cada una de los genes iniciales. Se produce la ligación a un vector de expresión y se introducen en E. coli para su expresión y comprobación de las enzimas híbridas. La mayoría dará lugar a productos aberrantes, no funcionales (se altera mucho más la estructura del gen que en el proceso anterior), peores que el original… pero alguno de ellos puede dar propiedades mejoradas o híbridas entre los genes de partida. Ejemplos de mejora de enzimas microbianas: subtilisina para detergentes Son proteasas utilizadas en la industria de los detergentes. Deben combinar una alta actividad proteolítica con una baja especificidad de sustrato. Además, deben permanecer activas durante prolongados períodos de tiempo en las condiciones adversas del proceso de lavado: - Temperaturas de hasta 70ºC (o superiores) - Resistencia pH 9-11 - No requerimiento de metales para la actividad catalítica (todos los detergentes contienen agentes quelantes como el EDTA) - Resistencia a agentes oxidantes como hipocloritos y perboratos (que se usan como blanqueadores) Estos requerimientos son mayoritariamente satisfechos por las proteasas conocidas como subtilisinas. Los microorganismos productores son especies del género Bacillus (B. licheniformis). Las subtilisinas son miembros de las “serin proteasas”. En la catálisis está implicada la tríada de aminoácidos: Ser-221, His-64 y Asp-32 Mejora de la subtilisina de B. licheniformis Su actividad desciende muy lentamente en presencia de perborato. Sin embargo, la enzima es muy sensible a la oxidación mediante peróxido de hidrógeno (que se libera a partir del perborato a temperaturas por encima de los 60ºC). La oxidación de la Met-222 (adyacente a la Ser-221 del centro activo) resulta en una pérdida del 90% de la actividad de la enzima. La solución es que puesto que la Met-222 no está directamente implicada en la catálisis, mediante mejora genética, se sustituyó este aminoácido por Ala-222. La enzima modificada retuvo el 53% de la actividad catalítica de la silvestre y fue totalmente resistente a H2O2 1M durante 1 hora. 4. Vitaminas/pigmentos Son imprescindibles para la vida. En la actualidad se producen en gran cantidad para la industria alimentaria (animal o humana), y en menor medida para la farmacéutica. Hay muchas vitaminas que pueden ser producidas por microorganismos: las más importantes son la cianocobalamina (B12), riboflavina (B2), ácido ascórbico (vitamina C) y en menor medida el β- caroteno (provitamina A). Otras pueden ser: tiamina (B1), ácido fólico, ácido pantoténico, piridoxal (B6), biotina, ergosterol (provitamina D2). a. Vitamina B12 (cianocobalamina) En 1926 se describió su importancia debido a que Minot y Murphy curaron la anemia perniciosa con extractos de hígado. En 1948, Ricke y Smith la aislaron de extracto de hígado. En la naturaleza es sintetizada por microorganismos. Es necesaria para los animales pues está presente en los tejidos animales en concentraciones muy bajas (1 ppm en el hígado). Su deficiencia produce anemia perniciosa. Los animales (hombre) obtienen una pequeña parte de los alimentos, pero la mayoría se obtiene por absorción de la producida por los microorganismos del intestino. Tiene diversos usos en la industria farmacéutica (60% de la producción) y en la alimentación animal (40% de la producción). Ej: piensos de pollos y cerdos con proteína vegetal se suplementan con 10-15mg de B12/tonelada. Las fuentes para la producción industrial son: - Tejidos animales: concentraciones muy bajas. - Síntesis química: requiere 70 etapas de reacción (muy cara).  - Fermentación microbiana: única fuente actual o único proceso viable. Es subproducto de otras fermentaciones con estreptomicetos (estreptomicina, cloranfenicol, neomicina) para la obtención de antibióticos, se puede purificar del medio de cultivo: 1 mg/L. La fermentación con Pseudomonas denitrificans: 60 mg/L. Respecto a la producción industrial, la patente la tiene Merck y la cepa es Pseudomonas denitrificans MB2436. El mantenimiento del microorganismo se hace mediante el liofilizado. El cultivo para inóculo (cepa de trabajo) se hace en un tubo en agar inclinado con medio a (96h/28ºC). - Medio a: melaza de remolacha (6 g/L), extracto de levadura (1 g/L), N-Z amina (1 g/L), (NH4)2HPO4 (2 g/L), MgSO4x7H2O (1 g/L), MnSO4xH20 (0,2 g/L), ZnSO4x7H2O (0,02 g/L), Na2MoO4x2H2O (0,005 g/L), agar (25 g/L); pH 7,4. El cultivo para el preinóculo se hace en un matraz Erlenmeyer de 1L con 15 mL de medio b ( medio sin agar 72h/28ºC con agitación). El cultivo para la producción se hace en un fermentador de 5L con 3,3L de medio c (90 h/29ºC con agitación 420 rpm o aireación 1 vvm). - Medio c: melazas de remolacha (100 g/L), extracto de levadura (2 g/L), (NH4)2HPO4 (5 g/L), MgSO4x7H2O (3 g/L), MnSO4xH2O (0,2 g/L), Co(NO3)2x6H2O (0,118 g/L), 5,6-dimetilbenzimidazol (precursor de la vitamina B12), ZnSO4x7H2O (0,02 g/L), Na2MoO4x2H2O (0,005 g/L); pH 7,4. b. Vitamina B2 (riboflavina) Descubierta en 1933 por Kuhn, György y Wagner-Jauregg. Presente en la leche como riboflavina libre o en otros alimentos (hígado, corazón, riñón, huevos) como parte de flavoproteínas. Su deficiencia produce arriboflavinosis. Entre sus usos se encuentra el tratamiento contra la arriboflavinosis (1 mg/día) y como suplemento de alimentos y dietas. Para su producción industrial hay dos métodos distintos, la síntesis química (20%), la biotransformación (50%, proceso mixto) y la fermentación directa (30%) - En la biotransformación, la glucosa es transformada en ribosa por Bacillus pumilus y la ribosa es transformada químicamente en riboflavina. - La síntesis química es asequible dado que es una molécula con estructura mucho más sencilla. - En la fermentación directa participan Mycobacterium smegmatis (58 mg/L); Clostridium acetobutylicum (97 mg/L.), Candida flareri (567 mg/L.), Eremothecium ashbyii (2480 mg/L.) y Ashbya gossypii (6420 mg/L.) Las cepas actuales sobrepasan estas cantidades. El medio de cultivo es un líquido de maceración del maíz (2,25%), peptona (3,5%), aceite de soja (4,5%). El proceso fermentativo se hace durante 7 días/28ºC; aireación a 0,3 vvm. El rendimiento es de 10-15 g/L con la cepa A. gossypii NRRLY-1056. c. Vitamina C (ácido ascórbico) Se usan en la industria farmacéutica y en la industria alimentaria (vitamina y antioxidante). La producción industrial sigue varios pasos: - Síntesis química: 2 enantiómeros, solo el L-enantiómero es activo biológicamente por lo que posteriormente han de ser separados. - Síntesis con microorganismos mejorados. - Bioconversión: proceso mixto, es el preferible. Proceso más antiguo, tiene 5 pasos, interviene solo un microorganismo. - D-glucosa → reducción catalítica, proceso químico →D-sorbitol. - D-sorbitol → L-sorbosa por sorbitol deshidrogenasa al ser fermentado por Acetobacter suboxidans (proceso biológico). - L-sorbosa →oxidación química →ácido 2-ceto-L-gulónico (2KLG). - Ácido 2-ceto-L-gulónico (2KLG)→ 2-ceto-L-gluconato (sal sódica de la forma enólica químicamente). - 2-ceto-L-gluconato → ácido ascórbico. En el proceso posterior intervienen 2 microorganismos: - D-glucosa → ácido 2,5-diceto D-glucónico (2,5 DKG) por actividades enzimáticas de Erwinia herbicola. - Ácido 2,5-diceto D-glucónico (2,5 DKG) → ácido 2-ceto –gulónico (2KLG) por 2,5 DKG-reductasa de Corynebacterium sp. - Ácido 2-ceto –gulónico (2KLG) → 2-ceto-L-gluconato (sal sódica de la forma enólica, químicamente). - 2-ceto-L-gluconato → ácido ascórbico. Proceso de Genetech: el gen de que codifica para la 2,5 DKG-reductasa de Corynebacterium se clona en Erwinia por lo que esta lleva a cabo ambos pasos reduciendo el proceso a tres pasos. La reducción de un paso de síntesis química es muy importante en reducción de costos. d. β-caroteno (provitamina A) Es fuente de la vitamina A, que se sintetiza para su obtención. La vitamina A se obtiene de la dieta en forma de retinol y carotenoides. El β-caroteno (provitamina A) por escisión da lugar a dos moléculas de retinol (vitamina A). Se transforma en vitamina A en la membrana de la mucosa intestinal y se almacena en el hígado. Su deficiencia produce ceguera nocturna (vitamina esencial). Su exceso da lugar a hipervitaminosis A (acumulación en el hígado). Se usa en la industria farmacéutica y cosmética (el retinol para deficiencias, acné, arrugas) y en la industria alimentaria (β-caroteno como colorante). Se obtienen a partir de plantas y por microorganismos, el hongo Blakeslea trispora presenta un buen rendimiento, aunque se puede obtener económicamente de las plantas y no ser necesaria la producción microbiana. Respecto a su producción industrial, la patente la tiene Upjohn (nacida en la universidad de Michigan, pasó por varias empresas. La cepa es un hongo Blakeslea trispora (3000 mg/L) de dos tipos sexuales (+ y -). El mantenimiento del microorganismo se hace mediante esporas. Respecto al cultivo para el inóculo (cepa de trabajo) se cultivan los dos tipos sexuales por separado en tubos de agar inclinado (168h/27ºC). En el cultivo del preinóculo se siembran los tipos sexuales por separado en Matraz Erlenmeyer de 2L con 400 mL de medio (48h/26ºC con agitación). En los preinóculos mezclados se mezclan a partes iguales los preinóculos de ambos tipos sexuales en un fermentador de 170L con 120L de medio A (líquido de maceración de maíz, almidón de maíz, tiamina, KH2PO4, MnSO4.) En el cultivo de producción, se usa el medio B de producción al cual se le añade β-ionona a las 48 h y se alimenta con glucosa hasta el final de la fermentación. - Medio B: productos solubles de destilería, almidón de maíz, harina de soja, aceite de semillas de algodón, antioxidante, MnSO4, tiamina, isoniacida. Respecto al proceso de obtención, se retira el micelio de los hongos, se filtran, se deshidrata con metanol y por último se extrae con cloruro de metileno.