Tema 4 PCYT -Tinciones generales PDF

PROCESAMIENTO CITOLÓGICO Y TISULAR TEMA 4 Aplicación de las tinciones generales  Resultado de aprendizaje 4. Aplica técnicas de tinción, caracterizando las secuencias del proceso CRITERIOS DE EVALUACIÓN a) Se han seleccionado los solventes utilizados par...

PROCESAMIENTO CITOLÓGICO Y TISULAR TEMA 4 Aplicación de las tinciones generales  Resultado de aprendizaje 4. Aplica técnicas de tinción, caracterizando las secuencias del proceso CRITERIOS DE EVALUACIÓN a) Se han seleccionado los solventes utilizados para la desparafinación y rehidratación de los cortes. b) Se han clasificado los colorantes por su composición química. c) Se han descrito los fundamentos de las técnicas de tinción. d) Se han seleccionado reactivos para la realización de la técnica de tinción especificada. e) Se han preparado las soluciones de trabajo específicas para la técnica que hay que realizar. f) Se ha aclarado y montado la preparación. g) Se han identificado posibles artefactos, su causa y la posibilidad de solución. h) Se han identificado y comprobado los criterios de calidad de la tinción. i) Se han etiquetado y archivado las preparaciones.  Clasificación de los colorantes Fundamentos de las tinciones generales Clasificación de los colorantes según la sustancia Contenidos que tiñen Ver las tinciones específicas de microorganismos Uso del contraste de microscopía electrónica  Fijación Inclusión Deshidratación Aclaramiento Contextualizar Impregnación/embeber Corte Tinción Cortes 5 uM si no tiñésemos no veríamos prácticamente nada.  Conceptos Colorante: sustancia química que aumenta el contraste entre diferentes zonas de un tejido. Formado por un cromóforo y un grupo auxocromo. Cromóforo: conjunto de átomos de una molécula responsable de su color. Son sustancias/grupos funcionales que tiene electrones capaces de absorber energía y excitarse, a diferentes longitudes de onda. - Dobles y triples enlaces de carbono - Sistemas aromáticos - Grupos Imino: NH=C Hematoxilina Eosina - Diazo N=N  Conceptos Colorante Cromóforo: Auxocromo: grupos que intensifican la acción del cromóforo, pueden unirse a ella posteriormente - Metilos -CH2 - Halógenos - Amino –NH2 - …  Conceptos Colorante Cromóforo: Auxocromo: grupos que intensifican la acción del cromóforo, pueden unirse a ella posteriormente - Metilos -CH2 - Halógenos: F, Cl, Br, I, At (astato), Ts (Teneso) - Amino –NH2 - … Acidofilas: afinidad por lo ácido Basófilas: afinidad por lo básico Mordiente: fijadores del color  1. Clasificación de los colorantes. 1.1 Según su naturaleza química: - Naturales: Hematoxilina, carmín, safranina… - Artificiales: Eosina, derivados de anilina (aminobenceno) azul de metileno. 1.2 Según el color que da a la muestra: - Ortocromático: si tiñe de su mismo color - Metacromático: si tiñe de otro color (naranja de acridina) Naranja de acridina: ADNbc: verde ARN: rojo Azul de metileno  1. Clasificación de los colorantes. 1.3 Según derivados del cromóforo  1. Clasificación de los colorantes. 1.4 Según la naturaleza del radical auxocromo Básicos: son sales cuya base aporta el color y la parte ácida es incolora. Tienen afinidad por sustancias ácidas del tejido como el ADN, coloreando el núcleo y el ARN. Por ejemplo: azul de toluidina, azul de metileno, hematoxilina, etc. Ácidos: son sales cuya base es incolora y la parte ácida es la que aporta el color. Tienen afinidad por las bases como las estructuras proteicas del citoplasma celular y el colágeno de la matriz extracelular. Por ejemplo: fucsina ácida, eosina, etc. Neutros: tanto la porción ácida como la básica pueden aportar color. Por ejemplo: eosinato de azul de metileno. Indiferentes: no se unen a elementos de los tejidos por afinidad química sino porque se disuelven en ellos. Por ejemplo: el colorante Sudán se disuelve en los lípidos.  2. Mecanismos generales de tinción/coloración 2.1 Físico: Está ligado a las propiedades de disolución (solubilidad) e impregnación (adsorción) del colorante sobre el tejido. 2.2 Histoquímico: Basado en el desarrollo de una reacción química entre el colorante y la estructura que es objeto de tinción, de modo que dicha interacción produce un nuevo cromógeno responsable del color obtenido. 2.3 Fisicoquímico: vinculado a la formación de uniones intermoleculares por atracción electrostática (la propiedad que tienen las moléculas de carga eléctrica contraria de ligarse entre ellas) o por fuerzas de tensión superficial responsables de la interacción molecular en los líquidos.  3. Tinciones histológicas de conjunto Existen diversas técnicas que permiten colorear los tejidos de manera conjunta. Hematoxilina-eosina, es la técnica más comúnmente empleada en los laboratorios de anatomía patológica. - Gran poder de resolución - bajo coste, lo que la hace altamente eficiente - facilidad de aplicación. Además de la hematoxilina-eosina, otras técnicas: azur- eosina Giemsa, azul celestina B y cromotropo 2R.  3. Tinciones histológicas de conjunto 3.1 Preparación del tejido Fijación: Puede utilizarse tejido fijado en cualquier solución fijadora, excepto aquellas que contienen tetróxido de osmio. Desparafinar: Estufa 60º 3’ Tres Baños en xilol agitando 2’ (el último baño puede ser más prolongado) Rehidratar Etanol absoluto 2’ (x2) Etanol 96º 2’ (x2) Etanol 70º 2’ (x2) (opcional) Tinción de nuestra elección Agua del grifo 2’  3. Tinciones histológicas de conjunto 3.2 Hematoxilina-Eosina Eosina: es un colorante ácido con carga eléctrica negativa, también conocido como colorante aniónico o citoplasmático, ya que tiñe las proteínas cargadas eléctricamente presentes en el citoplasma. Las sustancias que atraen los colorantes ácidos se denominan acidófilas. Hematoxilina: es un colorante básico con carga eléctrica positiva, conocido como colorante catiónico. También se le llama colorante nuclear, debido a su afinidad por los ácidos nucleicos (ADN y ARN). Las sustancias que se tiñen con colorantes básicos se denominan basófilas.  3. Tinciones histológicas de conjunto 3.2 Hematoxilina-Eosina Hematoxilina: 1. Se obtiene del palo azul, una planta originaria de Centroamérica. 2. Para que la hematoxilina sea funcional como colorante, debe oxidarse, transformándose en hemateína. Esta oxidación puede ser natural o inducida. Tipos de hematoxilina según su método de oxidación: 1. Hematoxilina de Harris: utiliza óxido de mercurio para inducir la oxidación. 2. Hematoxilina de Mayer: se oxida utilizando yoduro sódico. 3. Hematoxilina de Carazzi: emplea yodato potásico como oxidante. 4. Hematoxilina fosfotúngstica: se oxida con permanganato potásico. 5. Hematoxilina de Regaud o Ehrlich: se deja oxidar naturalmente, un proceso que tarda entre 20 y 30 días. Para mejorar la afinidad de la hemateína con los tejidos, se añaden sales metálicas a su composición.  3. Tinciones histológicas de conjunto Protocolo de la técnica de la hematoxilina-eosina (H-E): 1.Retirar restos de parafina: 1. Se utiliza un disolvente, generalmente xileno, para eliminar la parafina que recubre el tejido. 2.Hidratación de la muestra: 1. Tras eliminar la parafina, se hidrata el tejido con una serie de alcoholes de graduación decreciente: 1. Alcohol absoluto (100°). 2. Alcohol al 96°. 3. Alcohol al 70°. 3.Coloración nuclear con hematoxilina: 1. La hematoxilina tiñe los núcleos celulares de color azul o púrpura. 4.Lavar en agua corriente: 1. Se realiza para eliminar el exceso de hematoxilina.  3. Tinciones histológicas de conjunto 5. Diferenciación: 1. Se retira el exceso de hematoxilina con alcohol ácido (etanol con ácido al 1%), eliminando tinciones no selectivas de baja afinidad durante 5-30 segundos. 2. Esto permite preparar el tejido para la entrada del colorante citoplasmático (eosina). 6.Viraje (azulamiento): 1. Se realiza en agua corriente o con un agente de azulamiento durante 5 minutos (por ejemplo, carbonato de litio o solución amoniacal). 2. Si se utiliza un agente de azulamiento, se realiza un lavado abundante en agua corriente posteriormente. 7.Coloración citoplasmática con eosina: 1. La eosina tiñe el citoplasma y otros componentes acidófilos (generalmente rosa). 2. Este paso dura entre 20 y 60 segundos, evitando el exceso de eosina para lograr un buen contraste entre núcleo y citoplasma.  3. Tinciones histológicas de conjunto 8. Lavar en agua corriente: 1. En el caso de usar eosina alcohólica, lavar y diferenciar en etanol al 70% hasta alcanzar la intensidad deseada de coloración. 9.Deshidratación: 1. Se retira el agua del tejido mediante una batería de alcoholes de graduación creciente para preparar el tejido para el montaje. 10.Aclarado: Los cortes histológicos se pasan por xileno para eliminar los restos de alcohol absoluto y obtener transparencia en el tejido.  3. Tinciones histológicas de conjunto 1 minuto  Diferenciar: Viraje: eliminar las uniones de baja Agua corriente si es alcalina afinidad Carbonato de litio 1% Etanol acido 1% Solución acuosa de amoniaco al 2% 3. Tinciones histológicas de conjunto https://youtu.be/NPOqiPyaxo0  3. Tinciones histológicas de conjunto 3.3 Montaje - Deshidratar en cubetas con alcohol creciente - Xilol - Medio resinoso (eukit…) - Se pone un cubreobjetos sin que queden burbujas https://learn5.open.ac.uk/mod/htmlactivity/view.php?id=19  3. Tinciones histológicas de conjunto Valoración de resultados La tinción inadecuada en la técnica de hematoxilina-eosina suele deberse, en la mayoría de los casos, a una mala fijación tisular, que afecta la calidad de la preparación desde el inicio. Además, otras causas que deben considerarse incluyen: Exceso o defecto de oxidación de la hemateína, lo que puede alterar la intensidad y uniformidad de la tinción nuclear. Problemas en la diferenciación durante la coloración, que pueden generar resultados insuficientemente contrastados o teñidos de forma inespecífica. Uso de hematoxilina vieja o reutilizada en exceso, lo que disminuye su capacidad de tinción y la calidad final del preparado.  4. Otras tinciones Reacción de Feulgen Tinción específica de cromatina y núcleos Dos pasos Hidrólisis ácida que separa la doble cadena de ADN y la base nitrogenada Reactivo de Schiff detectar los aldehídos  4. Otras tinciones Reacción de Feulgen  4. Otras tinciones Reacción de Feulgen Hidrólisis ácida que separa la doble cadena de ADN y la base nitrogenada 6N HCl durante 60 min a 25ºC 1 Lavado en agua corriente Lavado en agua destilada 1’ (x2) Reactivo de Schiff detectar los aldehídos Reactivo de schiff 60 minutos en oscuridad a 25ºC Sin que se sequen pero con poca agua Baño sulfuroso 1’ (x3) Lavado agua corriente 10’ Deshidratar y montar  4. Otras tinciones Reacción de Feulgen Técnica semicuantitativa  tinción es proporcional a la cantidad a la cantidad de ADN Algunas enzimas Fosfatasa alcalina, esterasas y lipasas permanecen activas  5. Técnicas de tinción no histoquímicas Basadas en métodos físicos Dependen de la cantidad de la molécula que vayamos a teñir ya que quedan retenidas en ellas Tinciones: ◦ Lípidos ◦ Glucógeno ◦ Mucina-fibrina ◦ Tejido conectivo ◦ Tejido nervioso  5. Técnicas de tinción no histoquímicas Los lípidos son sustancias orgánicas insolubles en agua total o parcialmente pero solubles en acetona, alcohol, cloroformo, éter, etc.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.1 Lípidos Desde el punto de vista histoquímico, los lípidos se dividen en: Lípidos homofásicos: Son aquellos que se encuentran en los tejidos en estado puro, concentrados en una región específica de la célula, como una gota de grasa en el citoplasma. Las técnicas utilizadas para la detección de este tipo de lípidos incluyen Sudán y Oil Red O. Lípidos heterofásicos: Se encuentran mezclados con otras sustancias, como proteínas o carbohidratos. Para su detección, se emplean técnicas histoquímicas específicas como PAS (utilizada para glucolípidos) y ciertos métodos diseñados para identificar los ésteres de colesterol.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.1 Lípidos Tinciones homofásicos: - Sudan IV - Sudan III - Sudan negro B - Aceite rojo Sudan III y IV - Lípidos adquieren tono rojo intenso Sudan negro B - Lípidos y mielina adquieren tono azul negro - Núcleos rojizos - Colorante ligeramente alcalino que produce la tinción tras entrar en contacto con el grupo ácido de los lípidos. Tiñe: grasas neutras, fosfolípidos y esteroles Placa de ateroma con sudan III Aceite rojo O Propósito: Específico para teñir grasas neutras (triglicéridos) y lípidos en general. Es muy utilizado para identificar depósitos lipídicos en tejidos. Coloración: Produce un color rojo intenso en las áreas donde se encuentran lípidos neutros. Usos comunes: Detección de depósitos grasos en tejidos como el hígado (esteatosis hepática). Identificación de lípidos acumulados en lesiones ateroscleróticas. Estudios de obesidad o enfermedades metabólicas. Limitación: No distingue entre diferentes tipos de lípidos como ácidos grasos o fosfolípidos.  Azul de Nilo (método de Lillie): Propósito: Más amplio que el Aceite Rojo, ya que tiñe diferentes tipos de lípidos: Grasas neutras y ésteres de colesterol: Se tiñen de rosa a rojo. Ácidos grasos y fosfolípidos: Se tiñen de azul oscuro. Usos comunes: Estudios más detallados sobre la composición de los lípidos. Investigaciones en tejidos renales Análisis de membranas celulares y lípidos complejos.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas Lípidos heterofásicos: PAS (ácido periódico de schiff) un colorante incoloro, oxida a los grupos hidroxilo (–OH) de dos carbonos cercanos, formando de esta manera grupos aldehídos y la leucofucsina reacciona con ellos.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.2 Técnicas de glucógeno ◦ Polisácarido de reserva del reino animal ◦ Reserva hígado, músculo esquelético y cardiaco soluble en agua ◦ Tinción: ◦ Histoquímica: PAS (ácido peryodico de Schiff) ◦ No histoquímica: Carmín de Best ◦ Son selectivas de glucógeno, pero inespecíficas ◦ PAS también tiñe: lípidos no saturados, colágeno y fibras reticulares ◦ Carmín de Best: mucina, fibrina o gránulos de los mastocitos *Podemos mejorar la especificidad utilizando digestiones enzimáticas previas: - Amilasa o ptialina digiere el glucógeno - Sialidasa la mucina - Hialuronidasa el ácido hilaurónico  Intestino Izquierda: hematoxilina-eosina Derecha: PAS-Hematoxilina  Mucosa del intestino delgado tratada con PAS. Se aprecian en rojo las células caliciformes que son glándulas unicelulares.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.3 Técnicas de mucina y fibrina Las mucinas son proteínas muy pesadas que podemos encontrar en el moco del intestino, pero también en el de los pulmones y tracto genital. Forman parte de una secreción producida por diversos tipos de células epiteliales y células del tejido conectivo y su exceso de secreción se observa en reacciones inflamatorias y algunos carcinomas intestinales. Se usa para determinar el origen de un tumor primario mucosecretor cuando se detecta en un área que no es mucosecretora e infecciones de hongos encapsulados o Cryptococcus. La tinción de carmín de Mayer sirve para detectar mucinas epiteliales por un mecanismo electrostático de tinción, dado que uno de sus componentes son los mucopolisacáridos ácidos, que interaccionan con el carmín que tiene carga positiva. 5. Técnicas de tinción no histoquímicas Mucina rosa, núcleo se ve negro y el fondo amarillo  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.3 Técnicas de mucina y fibrina La fibrina es una proteína filamentosa que deriva del fibrinógeno*. En el curso de algunas enfermedades se puede observar en las paredes de los vasos sanguíneos como una sustancia denominada “fibrinoide”. Tanto la fibrina como el fibrinoide se colorean fuertemente de rojo con la eosina y de amarillo con el Van Gieson, son moderadamente PAS positivos y pueden demostrarse con la hematoxilina ácida fosfotúngstica de Mallory. Técnica de Weigert para fibrina: es una variante de la coloración de Gram para las bacterias. Es inespecífica, ya que tiñe amiloide y queratina. Interpretación: tiñe otros tejidos de rosa y las bacterias grampositivas y fibrina de azul. *proteína producida por el hígado que ayuda a detener el sangrado al favorecer la formación de coágulos de sangre. 5. Técnicas de tinción no histoquímicas Hematoxilina fosfotungstica  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.3 Técnicas de Tejido conjuntivo La función del tejido conjuntivo es dar soporte. Los elementos más frecuentes son las fibras de colágeno, que están sintetizados por diversos tipos celulares, entre ellos los fibroblastos. Además, se observan fibras elásticas que se encuentran fundamentalmente en determinados órganos dotados de especial distensibilidad (vasos sanguíneos y pulmón, etc.). Células, y fibras: ◦ Colágeno Colágeno tipo I ◦ Elásticas  elastina y proteína microfibrillar paredes de los grandes vasos sanguíneos, el cartílago elástico, los ligamentos amarillos, los pulmones y la piel vasos, pulmón ◦ Reticulares Colágeno tipo III forman redes de malla en órganos como el bazo, los riñones y los ganglios.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.3 Técnicas de Tejido conjuntivo ◦ Células, y fibras: ◦ Colágeno Colágeno tipo I ◦ Picro-fucsina de Van gienson ◦ Núcleo: azul negruzco (hematoxilina férrica) ◦ Citoplasma amarillo: acido pícrico ◦ Colágeno rojo: fucsina ácida Picrofucsina de Van gienson: colágeno de rojo Bronquio secundario de avestruz  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.3 Técnicas de Tejido conjuntivo ◦ Células, y fibras: ◦ Elásticas ◦ Método de la Orceína: La orceína se fija selectivamente pero no específicamente a las fibras elásticas. Las fibras elásticas se verán entre burdeos y castaño oscuro, mientras que las demás estructuras tisulares se tiñen de color marrón pálido. ◦ Método de la Hematoxilina de Verhoeff: diferencia las fibras elásticas (negro) de las de colágeno (rojo). Citoplasma amarillo Piel 4x: Orceína fibras elásticas de burdeos Piel 10x: Orceína  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.3 Técnicas de Tejido conjuntivo ◦ Células, y fibras: La reticulina consiste en una red de fibras ◦ Reticulina finas que dan soporte a los tejidos. Se encuentra principalmente en el hígado, el ◦ PASPAS + bazo y los riñones. ◦ Impregnación argéntica: Compuesta de colágeno tipo III, es más ◦ Un paso: Guimelius delgada que otras fibras de colágeno ◦ Dos pasos: Gomori 5.3 Técnicas de Tejido conjuntivo ◦ Células, y fibras: ◦ Reticulina ◦ PASPAS + ◦ Impregnación argéntica: ◦ Un paso: Guimelius ◦ Dos pasos: Gomori ◦ Gdfg Conectivo reticular del bazo.  https://youtu.be/5WsoZXauSW0 5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos -Astrocitos: Están en contacto con los vasos sanguíneos y se encargan de que les lleguen los nutrientes a las neuronas - Microglía: Eliminan los desechos y defienden las neuronas contra las infecciones -Cs de schwann (SNP) y -Oligodendrocitos (SNC) Recubren el axón con la mielina (aislante).  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.1 Coloración no argéntica para tejido nervioso - TINCIÓN DE NISSL: Cuerpos de Nissl La tinción de Nissl es muy usada en tejido nervioso, sobre todo en encéfalo y médula espinal, para estudiar la organización de las neuronas en núcleos y capas, aunque sirve para cualquier tejido. Tiñe estructuras ácidas como el núcleo y los cúmulos de ribosomas. El colorante en el que se basa la tinción es normalmente el azul de toluidina o el violeta de cresilo. En el citoplasma de las neuronas aparecen unas estructuras fuertemente teñidas con esta tinción denominadas cuerpos de Nissl, que se corresponden con acumulaciones de retículo endoplasmático rugoso. Aquí se tiñen el ARN ribosómico y el ARN mensajero que se está traduciendo. Estos se dañan o desplazan por traumatismos  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos Coloración: -Método de Vogt (violeta de cresilo) ◦ 5.4.1 Coloración no argéntica para tejido nervioso -Azul de metileno - TINCIÓN DE NISSL: Cuerpos de Nissl -Azul de toluidina -Método de Einarson (galocianina) Estos se dañan o desplazan por traumatismos -PAS La calidad de la tinción depende del tiempo de diferenciación durante la deshidratación final, luego los tiempos en estos alcoholes afectarán al resultado final. Si permanecen en el tejido gotas de lípidos o mielina (cortes de vibratomo, microtomo de congelación o de criostato), y no se quiere que interfieran con la tinción de los cuerpos celulares, las secciones pueden deshidratar en etanol creciente y volver a hidratar para eliminar tales lípidos.  Violeta de cresilo Núcleos: rosa ‐ violeta. Retículo endoplasmático rugoso: púrpura. Sección de corteza dorsal de ratón Imagen de motoneuronas de la médula espinal de rata teñidos con violeta de cresilo. Los grumos oscuros que aparecen en el citoplasma son los cuerpos de Nissl. Sección del hipocampo humano con tinción de Nissl. Izquierda: anatomía normal. Derecha: hipocampo de un paciente epiléptico; hay un patrón de esclerosis de hipocampo, con extensa muerte neuronal (asteriscos),y gliosis generalizada. Neuroimagen microscópica/Arellano Cabornero  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.1 Coloración no argéntica para tejido nervioso - Coloración para Mielina Luxol Fast Blue: La tinción azul rápida de Luxol (LFB), es una tinción comúnmente utilizada para observar la mielina bajo microscopía óptica, creada por Heinrich Klüver y Elizabeth Barrera en 1953. - Se utiliza para detectar mielina y cuerpos de Nissl en secciones histológicas y para visualizar la estructura básica del tejido cerebral y de la médula espinal. - La LFB también se utiliza para detectar la desmielinización en el sistema nervioso central (SNC), pero no puede discernir la mielinización en el sistema nervioso periférico  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.1 Coloración no argéntica para tejido nervioso - Visualización: Mielina - azul turquesa Núcleos de neuronas y células de la glía - rosa a púrpura Cuerpos de Nissl - rosa pálido kluver barrera( luxol fast blue)  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.1 Coloración no argéntica para tejido nervioso Axones mielinizados (azul): La mielina aparece teñida en tonos azul intenso, indicando regiones ricas en fibras nerviosas. Núcleos celulares (morado): Corresponden a neuronas y células gliales dispersas en la región. Fondo rosado: Representa el tejido conectivo y el citoplasma de las células, teñidos por la eosina. Micrografía de la protuberancia con tinción azul rápida de hematoxilina y eosina‐luxol.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.1 Coloración no argéntica para tejido nervioso Sustancia blanca (azul): Áreas mielinizadas que aparecen teñidas en tonos azules intensos, corresponden a axones mielinizados que forman vías nerviosas. Sustancia gris (clara): Áreas menos teñidas que contienen cuerpos celulares neuronales, dendritas y sinapsis. Sección coronal de un cerebro de ratón teñido con Hematoxilina & LFB neuronas de Purkinje y cuerpos de Nissl Se puede observar que hay algunas fibras mielinizadas teñidas de azul por encima y por debajo de los cuerpos celulares neuronales. https://www.photom acrography.net/forum /viewtopic.php?t=258 32 Hematoxilina-eosina: cerebelo Hematoxilina-eosina: cerebelo Luxol  5. Técnicas de tinción no histoquímicas Cerebelo Cerebelo Luxol (azul) violeta de cresilo (morado) violeta de cresilo (morado)  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.1 Coloración no argéntica para tejido nervioso - Coloración para Astrocitos: Hematoxilina fosfotúngstica de Mallory (PTAH) y el método de Holzer Es una técnica histológica para la demostración, principalmente, de la presencia de fibrina, de estriaciones musculares y de muchas estructuras del sistema nervioso central. Fundamento: Consiste en la reacción entre la hemateína y el ácido fosfotúngstico, produciendo una solución ácida fuerte que contiene tanto iones azules (más estables) como rojos. La coloración de las partículas rojas PTA, más grandes que las azules, estaría limitada a las estructuras más permeables, como son las fibras de colágeno. Las menos permeables se tiñen con las partículas azules.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.1 Coloración no argéntica para tejido nervioso - Coloración para Astrocitos: Hematoxilina fosfotúngstica de Mallory (PTAH) y el método de Holzer) - Tejido control y diana: Se utiliza con músculo esquelético o cardíaco, tejidos con contenido en fibrina o corteza cerebral. Es preferible fijar con Zenker a hacerlo con formol, y las secciones deben ser de 4 micras para músculo y de 6 para cerebro.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas ◦ Tiñe neurofibrillas y miofibrillas de azul negruzco, ◦ axones de azul pálido a negro, colágeno de rojo y ◦ astrocitos de rojo pálido. RESUMEN CON OTROS TEJIDOS Estriaciones musculares, fibras de neuroglía: azul oscuro. Fibrina: azul oscuro. Núcleos: azul. Mielina: azul claro. Colágeno, osteoide, cartílago, fibras elásticas: marrón oscuro/rojo. Citoplasmas: marrón rosáceo pálido.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.1 Coloración no argéntica para tejido nervioso - Cuerpos de lafora: citoplasma neuronal en la epilepsia de lafora (enf. rara, epilepsia con demencia progresiva) - Defecto enzima provoca acúmulos de poliglucanos en cerebro, hígado, corazón PAS  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.1 Coloración no argéntica para tejido nervioso La EL se caracteriza por la presencia de inclusiones intracelulares PAS positivas, que consisten en un depósito anormal de glucógeno llamado poliglicanos, que se acumulan en hígado, corazón, piel, músculos y neuronas. 5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.1 Coloración no argéntica para tejido nervioso  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.2 Coloración con metales pesados: ◦ ATENCIÓN a las técnicas van a depender del órgano y célula que desee estudiar ◦ Técnicas de impregnación argéntica (neurofibrillas): su fundamento radica en impregnar el tejido con un complejo argéntico y realizar luego una reducción que precipita la plata metálica y se deposita por un mecanismo físico en las neurofibrillas. ◦ Se clasifican en soluciones de nitrato de plata, complejos amonioargénticos y solución de proteinato de plata (protargol). Neurofibrillas: Delicadas fibrillas entrelazadas formadas por la reunión de neurofilamentos y neurotúbulos que van a través del CITOPLASMA del cuerpo de una NEURONA y que se extienden desde una DENDRITA a otra o hacia los AXONES.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.2 Coloración con metales pesados: ◦ Método de Bielschowsky (células nerviosas y sus prolongaciones): se identifican placas seniles de la enfermedad de Alzheimer, llamadas “placas neuríticas”. Está diseñada para resaltar estructuras patológicas específicas, como las placas amiloides y los ovillos neurofibrilares. Estas son acumulaciones anormales de proteínas: Las placas amiloides (placas seniles, neuríticas) contienen depósitos extracelulares de β-amiloide, que tienen afinidad por los complejos de plata debido a su naturaleza densa y fibrilar. Los ovillos neurofibrilares están formados por proteínas tau hiperfosforiladas, que también interactúan con los reactivos de plata utilizados en esta tinción. ◦ https://www.hipocampo.org/alzheimer-2.asp  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.2 Coloración con metales pesados: ◦ Otros métodos: ◦ Impregnación áurica de Ramón y Cajal para astrocitos (células gliales, astrocitos fibrosos y protoplásmicos de pardo-negruzco). ◦ Técnica de Golgi rápido (tiñe neuronas, astroglía y microglía de negro y las restantes estructuras no se tiñen). ◦ Impregnación argéntica de Ramón y Cajal.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.2 Coloración con metales pesados ◦ Técnicas de impregnación argénticas: Neurofibrillas (filamentos intermedios del citoesqueleto en las neuronas) Normalmente se usa: - Nitrato de plata, - Complejos amonioargénticos - Proteinato de plata o protargol  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.2 Coloración con metales pesados ◦ Técnicas de bielchowsky: para células nerviosas ◦ Tiñe los axones y dendritas de negro ◦ Fondo amarillento ◦ Amiloide: en marrón (Típico Alzehimer)  Interpretación patológica: Ovillos neurofibrilares y Alzheimer: ◦ Los ovillos neurofibrilares son uno de los dos principales marcadores patológicos de la enfermedad de Alzheimer (el otro son las placas amiloides). Estas acumulaciones anómalas de tau están relacionadas con la disfunción y la muerte neuronal. ◦ La proteína tau hiperfosforilada pierde su función normal de estabilizar los microtúbulos del citoesqueleto, lo que provoca su agregación y la formación de los ovillos. Impacto funcional: ◦ La presencia de ovillos dentro de las neuronas interfiere con el transporte intracelular y otras funciones esenciales, lo que lleva a la degeneración neuronal progresiva y, eventualmente, a la pérdida de conexiones sinápticas. Biel +luxol  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.2 Coloración con metales pesados ◦ Otros métodos: impregnación argéntica de Ramón y Cajal y Tinción de Golgi Las técnicas de tinción de Golgi y de Ramón y Cajal son métodos histológicos fundamentales en neurociencia, desarrollados para visualizar la compleja estructura del sistema nervioso. Aunque ambas emplean la impregnación argéntica, presentan diferencias significativas en sus procedimientos, aplicaciones y resultados.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.2 Coloración con metales pesados Técnica de Tinción de Golgi Procedimiento: Impregnación del tejido nervioso con bicromato de potasio. Posterior tratamiento con nitrato de plata, formando depósitos de cromato argéntico que tiñen las neuronas de negro sobre un fondo claro. Aplicaciones: Visualización detallada de la morfología neuronal completa, incluyendo soma, dendritas y axones. Estudio de la organización y conexiones neuronales en el sistema nervioso. Limitaciones: Tiñe aleatoriamente un pequeño porcentaje de neuronas, lo que puede limitar la representatividad de las muestras.  5. Técnicas de tinción no histoquímicas 5.4 Estudios neurohistológicos ◦ 5.4.2 Coloración con metales pesados Técnica de Tinción de Ramón y Cajal Santiago Ramón y Cajal, quien refinó y mejoró la técnica de Golgi. Procedimiento: Introducción de modificaciones en la técnica original de Golgi, como la doble impregnación argéntica, para mejorar la claridad y consistencia de la tinción. Aplicaciones: Confirmación de la doctrina neuronal, que establece que las neuronas son unidades individuales y no forman una red continua. Estudio detallado de la estructura y función de las neuronas, incluyendo la identificación de nuevas estructuras como las espinas dendríticas. Ventajas: Mayor precisión y reproducibilidad en la tinción de neuronas en comparación con la técnica original de Golgi. Impregnación argéntica de Ramón y Cajal y Tinción de Golgi  Impregnación argéntica de Ramón y Cajal y Tinción de Golgi https://mmegias.webs. uvigo.es/6‐ tecnicas/protocolos/p‐ impregnacion‐golgi‐ corte.php Neurona piramidal del asta de Amón del hipocampo El asta de Amón es una región del hipocampo donde se encuentran las neuronas piramidales. Esta región está involucrada en funciones como la memoria y la navegación espacial, y es una de las zonas más estudiadas en neurociencia debido a su papel en enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer. ◦ Neuronas piramidales: Las neuronas piramidales son el tipo principal de neuronas presentes en el hipocampo. Estas células tienen un soma en forma triangular o piramidal (visible en la imagen como un cuerpo celular oscuro) y una extensa arborización dendrítica. ◦ En el centro de la imagen se observa claramente el soma de una neurona piramidal, del cual emergen sus dendritas. ◦ Dendritas apicales: Una de las características distintivas de las neuronas piramidales es la presencia de una dendrita apical, que emerge del vértice del soma y se extiende hacia las capas superficiales. En la imagen, esta dendrita se ve como una prolongación que se ramifica extensamente en la parte superior. ◦ Estas dendritas son esenciales para recibir señales sinápticas desde otras neuronas. ◦ Dendritas basales: Las dendritas basales emergen de las otras partes del soma y se ramifican hacia los lados. Son visibles como las prolongaciones más pequeñas en la parte inferior de la imagen. ◦ También participan en la recepción de información sináptica. Oligodendrocitos en un sector de sustancia blanca del cerebro  6. Tinciones para identificación de microorganismos Acid-Fast (Modificación del Ziehl-Neelsen) Gram Orceína  6. Tinciones para identificación de microorganismos Acid-Fast (Modificación del Ziehl-Neelsen) Es una modificación del protocolo de Ziehl-Neelsen que sirve para detectar la presencia de Acid-Fast Bacteria (AFB), del género Mycobacterium. La cápsula de este género de bacterias contiene ácido micólico. La cápsula lipídica de estos organismos ácido-alcohol resistentes capta el reactivo carbol-fucsina y resiste frente a la decoloración con alcohol ácido. Las micobacterias no se pueden diferenciar con una tinción de Gram, pues la consistencia cérea que adquiere la cápsula lipoide a temperatura ambiente evita que las soluciones acuosas de la tinción Gram penetren.  6. Tinciones para identificación de microorganismos Acid-Fast (Modificación del Ziehl-Neelsen) ◦ Bacterias ácido-alcohol resistentes: Mycobacterias y Nocardia ◦ Lepra, Tuberculosis ◦ Cápsula tiene ácido micólico baja absorción del alcohol ácido y alta retención de la tinción (fucsina). ◦ Bacterias Rosaceas el resto azul ◦ Colorantes ◦ Carbol-fucsina (fenol+fucsina) ◦ 2,5 ml cristales de fenol derretidos Fucsina ◦ 5mL etanol absoluto ◦ 0,5 g fucsina básica ◦ 50 mL H2O d calentada ◦ Azul de metileno (1/10) ◦ 100mL etanol 95% ◦ 1,4 g azul de metileno  6. Tinciones para identificación de microorganismos Gram (variante para histología) Los grampositivos poseen una gruesa ◦ Tinción por excelencia en microbiología pared de proteínas y polisacáridos; sin ◦ Colorantes embargo, los gramnegativos tienen una pared fina recubierta por otra capa de ◦ Cristal violeta lipoproteínas. Durante la decoloración ◦ Fucsina básica con alcohol se provoca una ◦ Solución diferenciadora (2 ml formalina 37%, deshidratación de esta gruesa pared y se 1mL Acético ≥99%): Gram negativos pierden la tinción morada reduce la porosidad, atrapando entonces ◦ Solución ac. Pícrico-acetona ( 1g ácido pícrico- el complejo en el interior de la célula. Las 100mL acetona) bacterias gramnegativas poseen una delgada capa de peptidoglicano que ◦ Verá: permite la salida del complejo colorante- ◦ Gram +: moradas mordiente (cristal violeta-yodo) y es ◦ Gram -: rosa entonces fácilmente teñida por el ◦ Fondo/células: azul verdoso o amarillo colorante secundario o de contraste. 6. Tinciones para identificación de microorganismos 6. Tinciones para identificación de microorganismos  6. Tinciones para identificación de microorganismos Orceína Colorante natural obtenido de ciertos líquenes, tiñe el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, así como la proteína asociada al cobre y las fibras elásticas. Las fibras elásticas se verán entre burdeos y castaño oscuro, mientras que las demás estructuras tisulares se tiñen de color marrón pálido. Aquellos hepatocitos infectados por el virus de la hepatitis B tienen la propiedad de captar la orceína, coloreándose de color marrón. Colorante natural de color rojizo tiñe de marrón La misma que para fibras elásticas Además tiñe el antígeno de superficie del VHB, cromosomas, corpúsculos de Barr Fibras elásticas marrones/burdeos. Citoplasma de los hepatocitos grumos/puntos marones  6. Tinciones para identificación de microorganismos Orceína ◦ La misma que para fibras elásticas ◦ Además tiñe el antígeno de superficie del VHB, cromosomas, corpúsculos d eBarr ◦ Fibras elásticas marrones/burdeos. Citoplasma de los hepatocitos grumos/puntos marones Agte oxidante Contraste o/n Solución etanol-HCl-orceína Orceína es insoluble en agua  6. Tinciones para identificación de microorganismos http://www.conganat.org/7congreso/vistaImpresion.asp?id_trabajo=174 Orceína de shikata  7. Contraste de microscopía electrónica Las diferentes estructuras celulares son capaces de retener sale de metales pesados (plata, oro, osmio…) la cantidad varía según la carga electrostática Moléculas mayor carga retienen más metales pesados  no van a dejar que las atraviesen los electrones y las vamos a ver más oscuras. Dos contrastes: Tetróxido de osmio Acetato de uranilmanganeso y/o citrato de plomo o acetato de plomo 1) Se Hace el bloque con epoxiresina En metacrilato no hace falta doble contraste 2) Se hacen los cortes ultrafinos 1) Segundo contraste se hace con la rejilla montada por flotación invertida sobre una gota del contraste. 1) Acetato uranilo 2-4% 2) Deben colocarse lentejas de NaOH para que: 1) El pH básico permita disolverse bien las sales de plomo 2) Capture el CO2 que reaccionaría con el plomo formando carbonato de plomo 3) Añadir el citrato o acetato de plomo: aumenta el contraste de ribosomas, nucléolo y glucógeno. 2) Los lavados se hacen también sobre gotas  7. Contraste de microscopía electrónica Resinas epoxi son tóxicas al contacto, inhalación causa cáncer, infertilidad…. Metales pesados se acumulan y causan toxicidad--< desarrollo enfermedades neurológicas y respiratorias Se trabaja con: ◦ mascarillas ffp2 o ffp3 ◦ Doble guante de látex ◦ Gafas de seguridad Enlaces de interés https://microscopiovirtual.fmed.edu.uy/tecnicas.html#hft