Tema 3 Vectores básicos de clonación PDF

Tema 3. Vectores básicos de clonación Principales vectores de clonación para microorganismos - Plásmidos - Características - Plásmidos como vectores de clonación: requerimientos. - Plásmidos de primera generación: el pBR322 - Plásmidos de segunda generación: pUC18 y pBlues...

Tema 3. Vectores básicos de clonación Principales vectores de clonación para microorganismos - Plásmidos - Características - Plásmidos como vectores de clonación: requerimientos. - Plásmidos de primera generación: el pBR322 - Plásmidos de segunda generación: pUC18 y pBluescript - Selección de transformantes con inserto mediante complementación  - Bacteriófagos - El fago  - Ciclo lítico y ciclo lisogénico - Estructura: brazos, “stuffer” y extremos cohesivos - Vectores para la obtención de ssDNA: el fago M13 - Fagémidos - Cósmidos - Cromosomas artificiales: BACs - Plásmidos para Ingeniería Genética en levaduras - Transformación de microorganismos - Vectores bifuncionales (“shutle vector”) - Marcadores de selección de auxotrofías - YIps, YEps, YCps y YACs  Tema 3. Vectores básicos de clonación Expresión heteróloga en E. coli Vectores Promotores regulables El promotor T7 Sistemas para la producción de proteínas heterólogas a gran escala Problemas en la producción de proteínas heterólogas Optimización para la producción y purificación de proteínas heteróloga Clonación en fase Etiquetas Expresión heteróloga en eucariotas Expresión heteróloga en S. cerevisiae y P. pastoris Expresión heteróloga en insectos Baculovirus y bácmidos  Tema 3. Vectores básicos de clonación Vectores de clonación en bacterias Tema 6. Técnicas de Ingeniería Genética, pp.177-198. Apartados que veremos 6.3; 6.4; 6.5 (fagémidos, cósmidos, vectores lanzadera); 6.6 (BACs y YACs) Transformación en bacterias. Tema 4. Técnicas de Ingeniería Genética, pp. 103-111 Apartado que veremos: 4.2 Expresión heteróloga Tema 11. Técnicas de Ingeniería Genética, pp. 359-373  Principales tipos de vectores de clonación Plásmido - una molécula de DNA circular extra-cromosómico que se replica autónomamente dentro de la célula bacteriana; límite de clonación: 100 a 10.000 pares de bases o 0,1-10 kilobases (kb). Fago – en su mayoría derivados de bacteriófago lambda; moléculas de DNA lineales, una región puede ser reemplazado con DNA extraño sin interrumpir su ciclo de vida; límite de clonación: 8-20 kb. Cósmidos - una molécula de DNA circular extracromosómico que combina características de plásmidos y fagos; límite de clonación 35-50 kb. Cromosomas artificiales bacterianos (BAC) - basados en plásmidos bacterianos mini- F; límite de la clonación: 75-300 kb. Cromosomas artificiales de levadura (YAC) - un cromosoma artificial que contiene los telómeros, origen de replicación, un centrómero de levadura, y un marcador seleccionable para la identificación en células de levadura; límite de clonación: 100-1000 kb. Plásmidos: definición y características Plásmidos: Moléculas circulares de DNA de doble cadena con una replicación independiente a la del cromosoma bacteriano. Incluyen uno o más genes que, a menudo, confieren una característica útil para la bacteria huésped. Por ejemplo, la capacidad de ciertas bacterias para sobrevivir en concentraciones tóxicas de antibióticos como la ampicilina o el cloranfenicol se debe a la presencia de un plásmido que lleva genes de resistencia a estos antibióticos.  Plásmidos: definición y características Plásmidos: Poseen, al menos, una secuencia de DNA que actúa como origen de replicación Los plásmidos más pequeños utilizan las enzimas de replicación del DNA de la célula huésped para hacer copias de sí mismos. Los plásmidos más grandes llevan genes que codifican enzimas específicos para la replicación de dicho plásmido.  Plásmidos como vectores de clonación: requerimientos 1. Debe de 2. Debe de poder mantenerse en la “abrirse” para bacteria (tendrá colocar el inserto que tener un origen (tendrá que tener de replicación) un sitio de restricción único que permita su apertura) 3. Debe poder ser detectada cuando se encuentre en la bacteria (tendrá que tener un “marcador”)  Plásmidos como vectores de clonación Para poder ser utilizados como vectores de clonación los plásmidos deben de incluir:  Plásmidos como vectores de clonación Ventajas: – pequeños, fácil de manipular – Estrategias de selección directas – Útiles para clonar pequeños fragmentos de DNA (< 10 kbp) Desventajas: – Poco útiles para clonar grandes fragmentos de DNA (> 10 kbp)  Plásmidos: pBR322 El prototipo de plásmido de primera generación fue el pBR322. Tenemos dos marcadores de selección. Uno proporciona resistencia al antibiótico ampicilina y el otro a tetraciclina. Incluye, al menos, 11 sitios de restricción únicos dentro de los genes marcadores que pueden utilizarse para insertar DNA pasajero. pBR322: estrategia de selección de plásmidos con inserto Clonación deun fragmento de DNA usando el sitio PstI de pBR322. Cortamos tanto el plásmido y el inserto (amarillo) con PstI, a continuación, se unen los extremos cohesivos con DNA ligasa. Transformamos bacterias con el DNA y seleccionamos para las células resistentes a la tetraciclina pero sensibles a ampicilina. El plásmido recombinante ya no confiere resistencia a la ampicilina debido a la interrupción del gen de resistencia (azul). La técnica del “replica plate”  Plásmidos basados en pUC18: multicloning sites y complementación  El prototipo de plásmidos de segunda generación son los de la serie pUC (pUC18, pUC19….). Estos plásmidos tiene el mismo tipo de origen de replicación que el pBR322, pero con una mutación que les permite alcanzar un mayor número de copias.  Plásmidos como vectores de clonación El origen de replicación determina el número de copias del plásmido en la bacteria. What exactly is the copy number of plasmid? - Quora 600× 214  Plásmidos basados en pUC18: multicloning sites y complementación  Incluye una secuencia sintética que contiene las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción más habituales en los procesos de clonación: es lo que se denomina el MultiCloning Site. Esta secuencia forma parte (más bien, está integrada) de la región codificadora del gen lacZ de E. coli.  Plásmidos: multicloning site / complementación  El MCS está insertado en la región codificadora de la porción N-terminal de la -galactosidasa, lacZ’. Se conoce como el fragmento   Complementación  Complementación α: El gen lacZ’ del plásmido codifica los primeros 146 aminoácidos (el fragmento α) de la -galactosidasa El cromosoma del huésped también se ha modificado. Las cepas donde funciona esta selección contienen una versión alterada del gen lacZ que codifica una -galactosidasa que carece de la porción codificada por el gen LacZ’ presente en el plásmido y que no es funcional- Si el plásmido es capaz de producir el fragmento  (es decir, es un plásmido sin inserto en el MCS), el fragmento α producido por el gen lacZ’ y la parte producida por el cromosoma se complementan entre sí y producirán una enzima β-galactosidasa fun-cional.  Selección de transformantes con inserto La selección de las células transformadas con cualquiera de las formas del plásmido se hace por su capacidad de crecer en un medio con ampicilina. Si el medio contiene, además, IPTG y X-Gal podemos diferenciar (A PRIORI) las colonias portadoras de plásmido con y sin inserto. Las colonias azules tendrán un plásmido que expresará el fragmento  de la - galactosidasa y, por tanto, serán azules. La presencia del inserto rompe el gen del fragmento  de la - galactosidasa y las colonias serán blancas.  Complementación  A tener en cuenta: El promotor que controla el gen lacZ no se expresa constitutivamente y es inducido por IPTG. Se debe utilizar IPTG (isopropil-β-D-tio-galactósido) como inductor. Pequeñas inserciones en fase pueden no inactivar péptido α, dando colonias azules (a menudo más claras por la menor actividad). SIEMPRE HAY QUE COMPROBAR MOLECULARMENTE QUE EL PLÁSMIDO CORRESPONDE A LA CONSTRUCCIÓN QUE HEMOS DISEÑADO.  Plásmidos de segunda generación pBS (pBluescript) -Origen de replicación de alto número de copias. -MCS con muchos sitios de restricción. -MCS flanqueado por los promotores de las RNA pol de los fagos T3 y T7 -Incluye el origen de replicación del fago M13 (f1)  Vectores de clonación: fagos (BACTERIO)FAGOS Ventajas: – Utiles para clonar fragmentos largos de DNA (10 - 23 kbp) – Selección de largos insertos inherente al sistema Desventajas – Menos fácil de manipular Vectores de clonación: fago  Vectores de clonación: fago  Vectores de clonación: fago   Vectores de clonación: fago  El genoma del fago es un DNA duplex lineal de 48,5 kb con unos extremos de cadena sencilla de 12 nt de secuencia complementaria (extremos cos). Las secuencias cos son necesarias y SUFICIENTES para empaquetar un DNA de tamaño adecuado (entre 38 y 52 kb) en la cabeza del fago. El empaquetamiento se realiza in vitro Vectores de clonación: fago  Podemos diferenciar tres regiones, con funciones diferentes Brazo izquierdo: – Proteínas estructurales de la cabeza y la cola Brazo derecho: – Síntesis de DNA – Regulación – Lisis hospedador Región central (delecionable): – Regula la integración y escisión, siendo necesaria para la lisogénesis, pero no para  Clonación en fago  (a) obtención del DNA recombinante. (b) empaquetamiento e infección. Mezclamos el DNA recombinante obtenido en (a) con un “extracto de empaquetamiento” que contiene la cabeza y cola del fago λ y todos los otros factores necesarios para empaquetar el DNA recombinante en partículas de fago funcionales. Finalmente, se infectan células de E. coli y se siembra la mezcla en placa formadas.  Clonación en el fago  selección de transformantes El inserto provoca la inactivación del gen cI, de forma que ya no tiene lugar la lisogénesis y los fagos con inserto darán lugar a placas de lisis (calvas) mientras que los que no hayan tomado inserto dan lugar a regiones donde las bacterias crecen más lentamente dando lugar a regiones más claras dentro del césped de bacterias Clonación por sustitución de la región central en el fago  Vectores de clonación para la obtención de ssDNA (cadena sencilla): el fago M13  Utilidad de los vectores de clonación de cadena sencilla La secuenciación por el método de dideoxy (Sanger) requería originalmente el uso de DNA de cadena sencilla. Algunos métodos de mutagénesis dirigida utilizan como molde DNA de cadena sencilla. Algunos experimentos (como la determinación de los sitios de inicio de transcripción) requieren sondas de cadena sencilla. Actualmente han ganado relevancia porque se utilizan como vectores para la técnica del “phage display” Vectores de clonación: fago M13 Utilidad de los vectores de clonación de cadena sencilla Utilidad de los vectores de clonación de cadena sencilla Podemos trabajar in vitro con la forma de DNA de doble cadena como si fuera un plásmido e introducirlo en la célula por TRANSFORMACIÓN Vectores de clonación: fago M13 Vectores de clonación: fago M13. Pgage display  Vectores de clonación: fagémidos Características de fagos y plásmido. Diseñados para producir DNA de cadena sencilla en presencia de un fago “helper”. Dos promotores de la RNA polimerasa (T7 y T3)  Vectores de clonación: fagémidos Características de fago (M13) y plásmido. Diseñados para producir fagos de DNA de cadena sencilla en presencia de un fago “helper”. En el caso del pBluescript, contiene, además, dos promotores de la RNA polimerasa (T7 y T3) que flanquean el MCS y permite la selección de clones con inserto por complementación alfa.  Vectores de clonación: fagémidos En el sistema del phage display, que veremos más adelante, el objetivo e obtener fagos M13 que “expongan” un péptido o proteína en su cubierta. Para eso se fusionan con una de las proteínas que se encuentran en la cubierta, normalmente la pIII  Vectores de clonación: fagémidos Esto se puede hacer de dos formas  Vectores de clonación: fagémidos Podemos clonar el péptido o proteína en el DNA del fago “dentro” del gen que codifica la pIII. Si lo hacemos bien, se obtendrán fagos donde todas las proteínas pIII expondrán nuestro péptido, ya que las únicas proteínas pII son proteínas de fusión con nuestro péptido  Vectores de clonación: fagémidos Una segunda y mejor opción es utilizar un fagémido. Recordad que los fagémidos llevan un origen de replicación, que es lo único que necesita el DNA de cadena sencilla para replicarse y empaquetarse en partículas fágicas. Obviamente necesitaremos otro fago que permita la producción de todos los elementos estructurales que tienen el fago. Es el fago helper, que es un fago “normal”, excepto que tiene un origen de replicación defectuoso. Cuando los dos están en el interior de la célula de E. coli. se expresan todas las proteínas de fago helper y también la proteína pIII modificada, que se expresa en el fagémido bajo el control del promotor de elección. De los dos DNAs, sólo el fagémido puede replicarse y empaquetarse. Además , contendrá una proporción pIII silvestre/  Cósmidos Los cósmidos son plásmidos que incluyen sitios “cos” del fago  La presencia de sitios cos permite el empaquetado in vitro de este DNA en partículas  Combinan las propiedades de los plásmidos con las propiedades del  Ventajas: Útil para la clonación de grandes fragmentos de DNA (32 - 47 kpb). Selección de grandes inserciones es inherente al sistema. Se manejan como plásmidos Desventajas: No es fácil manejar grandes plásmidos (~ 50 Kbp)  Cósmidos Los cósmidos se empaquetan in vitro y se mantienen en solución como partículas de fago Para la entrada del DNA quimérico en el huésped de E. coli se realiza por un proceso de infección en lugar de la transformación. Pero los cósmidos son plásmidos: por lo tanto no forman placas sino colonias  BACs, PACs y YACs PACs: Cromosomas artificiales basados en el fago P1 BACs : Bacterial Artificial Chromosomes YACs : Yeast Artificial Chromosomes Ventajas: Útil para la clonación de fragmentos extremadamente grandes de DNA (100 - 2000 Kbp) Son herramientas básicas para los proyectos de secuenciación y análisis de genomas, así como para la síntesis de cromosomas artificiales Desventajas: No son fáciles de manejar al ser moléculas de DNA muy grandes  BACs Estas moléculas de DNA quiméricas que utilizan un origen de replicación bacteriano natural de bajo número de copias, tales como el del plásmido F- de E. coli. Puede ser clonado como un plásmido en un huésped bacteriano, y su estabilidad natural generalmente permite la clonación de grandes piezas de inserción de DNA, es decir, hasta unos pocos cientos de kb. Por ejemplo, el pBAC108L tiene 6900 pb y puede incorporar más de 300 kb ⚫ oriS y repE median la replicación ⚫ parA y parB mantienen el número de copias en uno ⚫ CloramfenicolR como marcador  BACs Un ejemplo de utilización (más allá de la … construcción de genotecas en proyectos de... secuenciación, como el del genoma humano) es. la clonación del genoma del adenovirus de chimpancé Y25. … …... Para clonar fragmentos completos y.. específicos de gran tamaño no es posible. utilizar enzimas de restricción. Se recurre. a la clonación por recombinación de. secuencias (lo veremos en el tema 5). ….... Para ello se introducen dos flancos de homología, uno con el extremo izquierdo del Y25 (LF1) y otro con el extremo derecho del genoma (RF). Se co-transforman las células de E. coli con el vector BAC y el DNA del adenovirus y se seleccionan los transformantes por la resistencia a cloramfenicol  Vectores de clonación Plásmidos para ingeniería genética en levaduras La comunicación entre células  El plásmido de 2 micras: un plásmido eucariota La levadura Saccharomyces cerevisiae contiene de forma natural un plásmido que se conoce como plásmido de 2 m. Se encuentra en decenas de copias (40-60). Su función no está del todo clara, aunque hay evidencias que apoyan que se asocian físicamente a los cromosomas, favoreciendo su segregación. Los primeros plásmidos para Ingeniería Genética en levaduras se construyeron utilizando el origen de replicación de este plásmido y añadiendo un marcador de selección apropiado  El plásmido de 2 micras: un plásmido eucariota La levadura Saccharomyces cerevisiae contiene de forma natural un plásmido que se conoce como plásmido de 2 m. Se encuentra en decenas de copias (40-60). Su función no está del todo clara, aunque hay evidencias que apoyan que se asocian físicamente a los cromosomas, favoreciendo su segregación. Los primeros plásmidos para Ingeniería Genética en levaduras se construyeron utilizando el origen de replicación de este plásmido y añadiendo un marcador de selección apropiado  Marcadores de selección en levadura Para levaduras, aunque también existen marcadores de resistencia a antibióticos, los marcadores más habituales son los de auxotrofía. Este marcador codifica una enzima de una ruta metabólica que está ausente en la cepa que queremos transformar. La selección de transformantes portadores del plásmido es por COMPLEMENTACIÓN DE LA MUTACIÓN que da lugar a la auxotrofía 0 Marcadores de selección en levaduras Marcadores de selección para Ingeniería Genética en levaduras Selección negativa  Vectores de clonación bi-funcionales El problema con cualquier organismo diferente a E. coli en Ingeniería Genética es que no es fácil trabajar con ellos. Su transformación es menos eficiente y es más difícil recuperar cantidades suficientes de los plásmidos para su análisis. El paso por E. coli para la amplificación y obtención de un DNA tras su manipulación es un paso prácticamente obligatorio. Esto determina que un vector de clonación, además de contener los elementos que permiten su replicación y selección en el organismo al que está destinado, deba de contener, además, elementos que permitan su replicación y selección en E. coli. Hablamos de vectores bi-funcionales o “shuttling vectors” Vectores de clonación bi-funcionales Vectores de clonación bi-funcionales  Vectores de clonación bi-funcionales Podemos trabajar con estos plásmidos tanto en E. coli (para hacer la construcción, insertando el o los fragmentos necesarios) y en levadura (para analizar los efectos de las secuencias que lleva el plásmido).  Vectores de clonación en levadura Plásmidos para levaduras Integrativos (YIp): se integran en el genoma por recombinación, son estables. Episomales (YEp): basados en el plásmido (2 μm), de replicación autónoma, no estables, alcanzan de 10 a 50 copias por célula Centroméricos (YCp): presentan un origen de replicación cromosómico (ARS; autonomously replicating sequence) y un centrómero, lo que dirige una copia a cada célula cuando hay división. Cromosomas artificiales (YAC): lineal, presenta las características mínimas de un YACs  YACs Con características comunes en todos ellos, existen YACs con diferentes diseños que permiten diferentes estrategias de clonación. Así, el que se muestra en la figura tiene dos marcadores de auxotrofía diferentes, de forma que sólo aquellas moléculas donde las dos partes se han unido a través de la inserción del DNA genómico pueden complementar las dos mutaciones que lleva la cepa de levadura que transformamos Aunque no se indican el plásmido de partida también lleva los elementos que permiten trabajar en E. coli Introducción del DNA recombinante en la célula hospedadora Introducción del DNA recombinante en la célula hospedadora Transformación: bacterias, levaduras, otras. – Método clásico con cationes – Electroporación Transfección: uso de virus (fagos). En cualquier célula que tenga estos parásitos. Cálculo de eficiencias: transformantes por microgramo de DNA. Hasta 109 en las mejores técnicas La transformación: Calcio y choque térmico La transformación: electroporación Cepas de E. coli para transformación Vectores para la expresión HETERÓLOGA de proteínas  Producción de proteínas recombinantes: aplicaciones Estudio y análisis de la estructura y función biológica Diagnóstico Investigación básica Alimentación Enzimas para la Anticuerpos fabricación de Enzimas…. quesos, cerveza, zumos… Proteínas recombinantes Enzimas Agentes terapéuticos industriale Vacunas Interferones DNasaI, s Factor Detergentes hemofílico Enzimas Somatostatina restricción… Interleucina Activador del plaminógeno  Producción heteróloga de proteínas : hospedadores Una posible clasificación la tenemos en función del organismo donde se va a producir la proteína de interés Producción heteróloga de proteínas: E. coli  Elementos que debe contener el vector de expresión Un promotor (P) que dirige la expresión. Puede ser de diferentes clases El sitio de unión al ribosoma (RBS) consiste en la secuencia Shine-Dalgarno (SD). Le sigue un espaciador traduccional rico en AT con una longitud óptima de aproximadamente ocho bases. Los tres codones de inicio tienen frecuencias de su uso diferentes en E. coli y de los tres codones de parada, UAA seguido de U es la secuencia de terminación traduccional más eficiente en E. coli. A menudo en vector contiene un gen regulador (R) que modula la actividad del promotor.  Origenes de replicación De forma general, los factores que van a determinar el grado de expresión son -el origen de replicación -el promotor origin Replicon copy number pBR322 pMB1 15-20 colE1 colE1 15-20 pUC mod pMB1 500-700 pMOB45 pKN402 15-118 pACYC p15A 18-22 pSC101 pSC101 5  Promotores: clases En cuanto a los promotores, los podemos clasificar según el nivel de expresión y si la exporesión es constitutiva o está regulada Fuerte vs. débil Regulable /constitutivo Inducible / reprimible  Promotores: clases Los más interesante son los promotores fuertes y de expresión regulada  El operón lac Uno de los más habituales es el promotor lac lacI operon lac Operon Pl lacI Plac lacO lacZ lacY lacA lac repressor Beta-galactosidase Beta gal- (cleavage of lactose) Beta gal- transacetylase permease (function?) (import of lactose) Pl lacI Plac lacO lacZ lacY lacA  Promotores: clases En los plásmidos de expresión es más habitual el promotor híbrido tac. Se regula igual que el promotor lac. Para que la regulación funcione, dado que el plásmido va a estar presente en muchas copias, no basta con la cantidad de represor que proporciona el gen lacI cromosómico, por lo que el plásmido incluye también el gen lacI  Promotores de fagos Otro tipo de promotores muy habituales son los promotores de fagos. Son promotores muy sencillos, de pequeño tamaño. El más utilizado es el del fago T7 Estos promotores son reconocidos por las RNA polimerasas de los fagos. Por lo tanto, su utilización requiere que la cepa de E. coli exprese dicha polimerasa  Inducción del promotor T7 La expresión regulada de nuestro gen (bajo el control del promotor del fago T7) se consigue regulando la expresión del gen que codifica la RNA polimerasa del fago. Por ejemplo, expresando dicha polimerasa bajo el control del promotor Plac. Podemos reducir la expresión residual del gen de interés (en condiciones de no activación) expresando simultáneamente el gen de la lisozima del fago que es un inhibidor competitivo de la polimerasa  Producción heteróloga de proteínas a gran escala Estos sistemas son abordables en condiciones de laboratorio (volúmenes entre 1 y 5 litros de medio) pero no son viables económicamente condiciones de planta piloto (entre 20 y 200 litros) o industrial (más de 200 litros). En estas escalas se suelen utilizar sistemas cuya regulación se obtiene modificando el medio de cultivo. El más utilizado incluye dos plásmidos compatibles. Inicialmente se crecen las células en un medio basado en melazas de bajo contenido proteico. La ausencia de triptófano induce la represor expresión del represor cI que bloquea la expresión del promotor del fago lambda PL Cuando se añade triptona, la presencia de triptófano reprime el promotor trp, no se produce el represor y el promotor PL puede expresarse. Producción heteróloga de proteínas en E. coli: limitaciones Producción heteróloga de proteínas en E. coli: limitaciones Producción heteróloga de proteínas en E. coli: limitaciones Producción heteróloga de proteínas en E. coli: limitaciones Producción heteróloga de proteínas en E. coli: limitaciones Producción heteróloga de proteínas en E. coli: limitaciones Producción heteróloga de proteínas en E. coli: limitaciones Producción heteróloga de proteínas en E. coli: limitaciones Producción heteróloga de proteínas en E. coli: limitaciones Producción heteróloga de proteínas en E. coli: limitaciones Optimitación de la producción/purificación  Producción heteróloga de proteínas en bacterias: secreción En ocasiones la producción y purificación de la proteína heteróloga mejora cuando la célula de E. coli la secreta al medio de cultivo. Para ello es necesario fusionar la pauta abierta de lectura (ORF) con una secuencia de aminoácidos que funcione como seña de secreción La proteína empieza por esta secuencia que permite su secreción Clonación “en fase” Cuando se tienen que unir dos fragmentos de DNA “codificadores” no se pueden unir de cualquier forma. Es necesario que el segundo esté en “fase” con el primero (éste es el que marca la pauta) para que en la traducción se obtenga una proteína de fusión. Por lo tanto, teneos que sabe la pauta de la región del MultiCloning Site Clonación “en fase” Cuando se tienen que unir dos fragmentos de DNA “codificadores” no se pueden unir de cualquier forma. Es necesario que el segundo esté en “fase” con el primero (éste es el que marca la pauta) para que en la traducción se obtenga una proteína de fusión. Por lo tanto, teneos que sabe la pauta de la región del MultiCloning Site En la información relativa al plásmido veremos los tripletes con la misma fase de la secuencia N- terminal, en este caso la señal de secreción Producción heteróloga de proteínas en bacterias: adición de etiquetas para su purificación  Producción heteróloga de proteínas: etiquetas Muchos vectores incluyen etiquetas 5.6 kb “tags”que puedo añadir a mi proteína, en N- o/y C-terminal, para ayudar a su purificación y/o detección Esquema general de un vector para expresar proteínas de fusión Producción heteróloga de proteínas : etiquetas  Producción heteróloga de proteínas : etiquetas Podemos añadir la etiqueta fusionando nuestro fragmento de restricción a un plásmido o, si la etiqueta es pequeña, como extensión del cebador en una reacción de PCR  Producción heteróloga de proteínas: etiquetas La presencia de la etiqueta permite purificar mi proteína mediante cromatografía de afinidad  Producción heteróloga de proteínas: vectores para E. coli Algunos ejemplos GST región codificadora con su RBS (SD) interno GST: glutatión S-transferasa  Producción heteróloga de proteínas en bacterias: purificación Adició Adición de una cola de His - purificació purificación en columna de Ni Otros ejemplos: Fusión con proteína de unión a maltosa - columna de amilosa Fusión con glutatión S- transferasa (GST) - columna de glutatión Producción heteróloga de proteínas en bacterias: purificación Producción de proteínas heterólogas en Bacillus Ventajas Inconvenientes Producción heteróloga de proteínas en Bacillus Producción heteróloga de proteínas en Bacillus: secreción Producción de proteínas heterólogas en eucariotas Producción heteróloga de proteínas en levaduras Ventajas Inconvenientes  Producción heteróloga de proteínas en levaduras Saccharomyces cerevisiae: – Organismo unicelular – Bien caracterizado genética y fisiológicamente – Promotores fuertes disponibles – Plásmido natural (2µm) – Eucariotas, ocurren modificaciones post-transduccionales – Secretan algunas proteínas – No patógeno Producción heteróloga de proteínas en levadura: aplicaciones Las levaduras se han utilizados para la producción de muchas con actividad terapéutica en aquellos casos donde los sistemas procariotas no producen proteínas funcionales  Producción heteróloga de proteínas en levadura: vectores Tenemos multitud de plásmidos diferentes (los YEp con un alto número de copias) y muchos promotores que pueden ser utilizados, algunos fuertes y regulables  Producción heteróloga de proteínas en levadura: secreción También se han identificado secuencias que permiten la secreción de la proteína expresada  Producción heteróloga de proteínas en levadura: problemas El principal problema que puede hacer que nuestra proteína no sea funcional es la “hiperglicosilació n” Producción heteróloga de proteínas en levadura: problemas Las posibles soluciones Usar otro tipo de levaduras distinta a Saccharomyces cerevisiae – Pichia pastoris – Hansenula polymorpha Usar otros eucariotas – Células de insectos – Cultivos de células de mamíferos  Producción heteróloga de proteínas en levadura: alternativas Pichia pastoris es una levadura metilotrófica y se puede utilizar como un sistema de expresión heterólogo. Este microorganismo no es tan fácil de manipular como Escherichia coli, pero tiene muchas de las ventajas de expresión eucariota (por ejemplo, el procesamiento de proteínas, plegamiento, y modificaciones posteriores a la traducción), y es más rápido, más fácil y más barato de usar que otros sistemas la expresión eucariótica, tales como baculovirus o cultivo de tejidos de mamíferos. También, por lo general, produce mayores niveles de expresión. Producción heteróloga de proteínas en insectos Producción heteróloga de proteínas en células de insecto Ventajas Inconvenientes Producción heteróloga de proteínas en células de insecto  Producción heteróloga de proteínas en células de insecto -Los baculovirus infectan células de insectos. Durante la infección, las partículas víricas se empaquetan en grupos formando los cuerpos de inclusión localizados en el núcleo celular, compuestos mayoritariamente de la proteína poliedrina. - La expresión del gen de la poliedrina supone aproximadamente el 60% de las proteínas totales del baculovirus. Su promotor se puede usar para expresar genes foráneos.  Producción heteróloga de proteínas en células de insecto: vectores Se inserta el DNA heterólogo en un vector Llevan secuencias repetidas del simple llamado donador que lleva el transposón Tn7 para recombinar con un promotor de expresión, tras el que se segundo elemento inserta el gen de interés.  Producción heteróloga de proteínas en células de insecto: etapas En la bacteria existe otro plásmido llamado “bácmido” que incluye todos los genes estructurales y para la replicación del baculovirus, también con secuencias repetidas del transposón Tn7 para recombinar. En la bacteria se genera la molécula recombinante con la que se transforman las células de insecto para producir los baculovirus primarios. El rendimiento no es muy grande, pero los baculovirus producidos se pueden utilizar para infectar otras células, amplificando su producción.  Producción heteróloga de proteínas en células de insecto Usos: Para expresar genes heterólogos en células de insectos en cultivo y en larvas de insectos. Se pueden usar cultivos de células de insectos en biorreactores parecidos a los empleados con los microorganismos. Los medios de cultivo permiten el escalado, esencial para la producción de grandes cantidades de proteínas terapéuticas recombinantes. - Ejemplo: la producción de vacunas de subunidades víricas, debido a su enorme capacidad de expresión. Se han usado para virus animales como el de la lengua azul, el parvovirus porcino y canino. Incluso se han logrado expresar varias proteínas a la vez en forma semejante a del virión ("Virus like particles” VLP) como es el caso de la lengua azul, produciéndose un producto de gran capacidad inmunogénica.