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Questions and Answers
¿Cuál es la función del represor cI en la producción heteróloga de proteínas en E. coli?
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¿Qué ocurre cuando se añade triptófano al medio de cultivo en la producción de proteínas en E. coli?
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¿Cuál es la principal limitación de los sistemas de producción heteróloga en condiciones industriales?
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Al utilizar plásmidos compatibles en la producción de proteínas, ¿qué se logra inicialmente en el medio de cultivo?
Al utilizar plásmidos compatibles en la producción de proteínas, ¿qué se logra inicialmente en el medio de cultivo?
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¿Qué se requiere para que una proteína heteróloga sea secretada al medio de cultivo en E. coli?
¿Qué se requiere para que una proteína heteróloga sea secretada al medio de cultivo en E. coli?
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¿Cuál es uno de los principales desafíos de la transformación de células en la producción heteróloga de proteínas?
¿Cuál es uno de los principales desafíos de la transformación de células en la producción heteróloga de proteínas?
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En el contexto de la producción heteróloga, ¿qué es la clonación 'en fase'?
En el contexto de la producción heteróloga, ¿qué es la clonación 'en fase'?
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¿Cuál es una ventaja de utilizar Saccharomyces cerevisiae en la producción heteróloga de proteínas?
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¿Qué problema puede surgir al producir proteínas heterólogas en levaduras?
¿Qué problema puede surgir al producir proteínas heterólogas en levaduras?
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¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre Pichia pastoris es correcta?
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¿Cuál de las siguientes opciones describe mejor el vector de expresión utilizado en levaduras?
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Al considerar la producción heteróloga de proteínas, ¿cuál de las siguientes opciones es un inconveniente de usar Bacillus como sistema?
Al considerar la producción heteróloga de proteínas, ¿cuál de las siguientes opciones es un inconveniente de usar Bacillus como sistema?
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¿Cuál es la función principal de la cola de His en el contexto de la purificación de proteínas?
¿Cuál es la función principal de la cola de His en el contexto de la purificación de proteínas?
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¿Qué tipo de modificación post-transduccional es comúnmente problemático en la producción de proteínas en levaduras?
¿Qué tipo de modificación post-transduccional es comúnmente problemático en la producción de proteínas en levaduras?
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Al comparar la producción de proteínas heterólogas en eucariotas, ¿cuál de las siguientes opciones es una ventaja?
Al comparar la producción de proteínas heterólogas en eucariotas, ¿cuál de las siguientes opciones es una ventaja?
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¿Qué opción describe mejor la función de los promotores en la producción heteróloga de proteínas?
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¿Cuál es el principal método clásico para la transformación de células utilizando cationes?
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¿Qué tipo de células se pueden transformar mediante la electroporación?
¿Qué tipo de células se pueden transformar mediante la electroporación?
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¿Cuál de los siguientes elementos NO es un componente esencial en un vector de expresión para E.coli?
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¿Qué función tiene el promotor en un vector de expresión?
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¿Qué técnica puede alcanzar eficiencias de hasta $10^9$ transformantes por microgramo de DNA?
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Entre las aplicaciones de las proteínas recombinantes, ¿cuál es específicamente utilizada para la fabricación de alimentos?
Entre las aplicaciones de las proteínas recombinantes, ¿cuál es específicamente utilizada para la fabricación de alimentos?
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¿Cuál es la secuencia de terminación más eficiente en E.coli?
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¿Qué se requiere para realizar el cálculo de eficiencia en la transformación celular?
¿Qué se requiere para realizar el cálculo de eficiencia en la transformación celular?
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¿Qué proceso permite la introducción de DNA recombinante en células mediante el uso de virus?
¿Qué proceso permite la introducción de DNA recombinante en células mediante el uso de virus?
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Study Notes
Producción heteróloga de proteínas a gran escala
- Los sistemas de producción heteróloga de proteínas a pequeña escala son abordables en condiciones de laboratorio
- Los sistemas a gran escala, como la producción industrial, utilizan sistemas regulados mediante modificaciones del medio de cultivo
- Se emplean dos plásmidos compatibles para la producción a gran escala
Producción heteróloga de proteínas en E.coli
- La expresión del gen de interés se reduce en ausencia de la activación mediante la expresión simultánea del gen de la lisozima del fago
- La lisozima del fago funciona como un inhibidor competitivo de la polimerasa
Producción heteróloga de proteínas en E.coli: limitaciones
- En las escalas de producción industrial (más de 200 litros) se emplean sistemas que regulan la expresión de la proteína mediante el control del medio de cultivo.
- Se utilizan dos plásmidos compatibles para controlar la expresión en E.coli.
Optimización de la producción/purificación
- Existen diferentes estrategias para optimizar la producción y purificación de proteínas heterólogas
Producción heteróloga de proteínas en bacterias: secreción
- La secreción al medio de cultivo es una estrategia para mejorar la producción y purificación de las proteínas heterólogas.
- La fusión de la secuencia de aminoácidos del ORF con una secuencia que funciona como seña de secreción facilita la secreción de la proteína al medio.
Clonación "en fase"
- La unión de dos fragmentos de ADN codificadores debe realizarse teniendo en cuenta la fase de lectura del marco abierto de lectura (ORF) para obtener la traducción correcta.
Producción heteróloga de proteínas en bacterias: purificación
- La adición de una cola de His permite la purificación de la proteína mediante una columna de Ni.
- Otras etiquetas usadas en la purificación de proteínas:
- Fusión con la proteína de unión a maltosa (columna de amilosa).
- Fusión con glutatión S-transferasa (GST) (columna de glutatión).
Producción heteróloga de proteínas en Bacillus
- Ofrece ventajas como la capacidad de secretar proteínas y la resistencia a condiciones extremas de pH y temperatura.
- Las desventajas incluyen la existencia de una baja eficiencia de transformación y un sistema de secreción complejo.
Producción heteróloga de proteínas en Bacillus: secreción
- Bacillus posee una vía de secreción compleja que puede utilizarse para secretar proteínas al medio de cultivo.
Producción de proteínas heterólogas en eucariotas
- Los sistemas eucariotas permiten la expresión y plegamiento correctos de proteínas que requieren modificaciones postraduccionales, como la glicosilación.
Producción heteróloga de proteínas en levaduras
- Las levaduras presentan ventajas como la eficiencia de crecimiento, la genética bien caracterizada, la disponibilidad de plásmidos y promotores fuertes, la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales y la secreción de proteínas.
- Desventajas incluyen la presencia de un sistema de glicosilación complejo y un bajo rendimiento de expresión.
Producción heteróloga de proteínas en levadura: aplicaciones
- Las levaduras se utilizan en la producción de proteínas con actividad terapéutica en casos donde los sistemas procariotas no generan proteínas funcionales.
Producción heteróloga de proteínas en levadura: vectores
- Existen diversos plásmidos, como los YEp con alto número de copias, y promotores que pueden ser utilizados. Algunos son fuertes y regulables.
Producción heteróloga de proteínas en levadura: secreción
- Se han identificado secuencias que permiten la secreción de la proteína expresada, mejorando la producción y purificación.
Producción heteróloga de proteínas en levadura: problemas
- El principal problema que puede afectar la funcionalidad de la proteína es la hiperglicosilación.
Producción heteróloga de proteínas en levadura: problemas
- Las posibles soluciones incluyen:
- Utilizar otros tipos de levaduras como Pichia pastoris o Hansenula polymorpha.
- Utilizar otros eucariotas, como células de insectos o cultivos de células de mamíferos.
Producción heteróloga de proteínas en levadura: alternativas
- Pichia pastoris es una levadura metilotrófica que puede utilizarse como sistema de expresión heterólogo.
Introducción del DNA recombinante en la célula hospedadora
- Se pueden utilizar métodos como la transformación, la electroporación o la transfección para introducir el DNA recombinante en la célula hospedadora.
Introducción del DNA recombinante en la célula hospedadora
- La transformación, un proceso clásico que se basa en el uso de cationes, es efectiva en bacterias, levaduras y otros organismos.
- La electroporación utiliza pulsos eléctricos para aumentar la permeabilidad de la membrana celular, permitiendo la entrada del DNA.
- La transfección utiliza virus como vectores para introducir el DNA en células que puedan ser infectadas por estos parásitos.
La transformación: calcio y choque térmico
- Este método utiliza una solución de cloruro de calcio para hacer permeables las membranas de las bacterias y facilita la entrada del ADN.
La transformación: electroporación
- Este método utiliza pulsos eléctricos para generar poros transitorios en la membrana celular, facilitando la entrada del DNA.
- La electroporación requiere un control preciso de los parámetros del pulso eléctrico.
Cepas de E.coli para transformación
- Se utilizan cepas especiales de E. coli que son más sensibles a la electroporación y facilitan la transformación.
Vectores para la expresión HETERÓLOGA de proteínas
- Los vectores de expresión son los plásmidos que portan el gen de interés para la expresión en un organismo huésped.
- Los vectores de expresión deben contener elementos esenciales como:
- Un promotor para regular la expresión.
- Un sitio de unión al ribosoma (RBS).
- Un gen regulador que modula la actividad del promotor.
- Un sitio de poliadenilación.
- Un marcador de selección para identificar las células transformadas.
- Un multicloning site (MCS) donde se inserta el gen de interés.
Producción de proteínas recombinantes: aplicaciones
- Las proteínas recombinantes se utilizan en diversas áreas, incluidas la investigación básica, el diagnóstico, la alimentación y la medicina.
- Ejemplos de aplicaciones incluyen:
- Estudio de la estructura y función biológica de proteínas.
- Desarrollo de anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico.
- Producción de enzimas para usos alimenticios, como en la elaboración de quesos, cerveza o zumos.
-
Desarrollo de agentes terapéuticos, como interferones, vacunas y factores hemofílicos.
Producción heteróloga de proteínas: hospedadores
- Los hospedadores utilizados para la producción heteróloga de proteínas se seleccionan en función de sus características específicas, como la capacidad de expresar la proteína de interés de forma eficiente, su seguridad y la facilidad de su cultivo.
- Los hospedadores utilizados comúnmente incluyen bacterias ( E. coli, Bacillus), levaduras (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris), células de insectos y cultivos de células de mamíferos.
Producción heteróloga de proteínas: E. coli
- E. coli es una bacteria ampliamente utilizada en la producción heteróloga de proteínas.
- Las ventajas de E. coli incluyen su crecimiento rápido, su bajo costo de cultivo y la disponibilidad de herramientas genéticas bien desarrolladas.
Elementos que debe contener el vector de expresión
- Un vector de expresión debe tener un promotor para regular la expresión del gen.
- Un sitio de unión al ribosoma (RBS), llamado Shine-Dalgarno, facilita la unión de los ribosomas al ARNm.
- Un gen regulador que modula la actividad del promotor.
- Un sitio de poliadenilación que se añade al ARNm para que aumente la estabilidad y facilite la traducción.
- Un marcador de selección que permita identificar las células que han sido transformadas con el vector.
- Un multicloning site (MCS) donde se inserta el gen de interés.
Clonación "en fase"
- Al unir dos fragmentos de ADN codificadores, se debe tener en cuenta la fase de lectura del marco abierto de lectura (ORF) para evitar errores en la traducción.
Producción heteróloga de proteínas en bacterias: adición de etiquetas para su purificación
- Las etiquetas son secuencias de aminoácidos que se añaden a la proteína de interés para facilitar su purificación.
Producción heteróloga de proteínas: etiquetas
- Las etiquetas pueden añadirse en el extremo N-terminal o C-terminal de la proteína, y se pueden utilizar etiquetas de fusión o etiquetas de afinidad.
- Las etiquetas de fusión son secuencias de aminoácidos que se fusionan a la proteína de interés para crear una proteína de fusión.
- Las etiquetas de afinidad se utilizan para purificar la proteína mediante cromatografía de afinidad.
Producción heteróloga de proteínas: etiquetas
- Los vectores de expresión pueden incluir etiquetas que permiten purificar la proteína mediante cromatografía de afinidad.
- La presencia de la etiqueta permite purificar la proteína mediante cromatografía de afinidad.
Producción heteróloga de proteínas: vectores para E. coli
- Los vectores de expresión para E. coli están diseñados para la expresión de proteínas heterólogas en esta bacteria.
- Los vectores de expresión para E. coli incluyen un promotor, un sitio de unión al ribosoma (RBS), un gen regulador, un marcador de selección y un sitio de poliadenilación.
- Los vectores de expresión también pueden incluir etiquetas, las cuales facilitan la purificación de la proteína.
Clonación "en fase"
- La fusión de dos fragmentos de ADN codificadores debe realizarse teniendo en cuenta la fase de lectura del marco abierto de lectura (ORF) para obtener la traducción correcta.
Producción heteróloga de proteínas en bacterias: purificación
- La adición de una cola de His permite la purificación de la proteína mediante una columna de Ni.
- Otras etiquetas usadas en la purificación de proteínas:
- Fusión con la proteína de unión a maltosa (columna de amilosa).
- Fusión con glutatión S-transferasa (GST) (columna de glutatión).
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Description
Este cuestionario explora los sistemas de producción heteróloga de proteínas a gran escala, con un enfoque particular en la utilización de E.coli. Se analizan los métodos de optimización y las limitaciones del proceso, así como el papel de los plásmidos en la regulación de la expresión de proteínas. Perfecto para estudiantes de biotecnología y biología molecular.
