Tema 5. Estrategias de Clonación PDF

Tema 5. Estrategias de clonación  Tema 5. Estrategias de clonación Generación y unión de fragmentos de restricción a vectores Extremos romos y protuberantes Clonación direccional y no direccional Conversión de extremos protubera...

Tema 5. Estrategias de clonación  Tema 5. Estrategias de clonación Generación y unión de fragmentos de restricción a vectores Extremos romos y protuberantes Clonación direccional y no direccional Conversión de extremos protuberantes en romos Digestiones completas y parciales Genotecas de DNA genómico Caracterización de las genotecas Construcción de genotecas en plásmidos: genotecas de levadura Construcción de genotecas en fago λ Construcción de genotecas en BACs Clonación de cDNAs: genotecas de cDNA Clonación de productos de PCR Clonación de productos romos y con extensiones 3’A Introducción de sitios de restricción mediante PCR  Tema 5. Estrategias de clonación Estrategias específicas de clonación User assembly SLIC y Gibson assembly Golden Gate cloning Clonación por recombinación GAP repair TAR (Transformation associated recombination) Clonación por recombinación sitio-específica Gateway cloning Genómica sintética Diseño de genomas sintéticos Estrategias de ensamblaje  Tema 5. Estrategias de clonación Generación y unión de fragmentos de restricción. Tema 4. Técnicas de Ingeniería Genética, Apartado 4.3 pp. 111-116. Nos limitaremos a ver la unión de fragmentos de restricción. La utilización de otras estrategias que implican adaptadores o colas homopoliméricas las veremos en el Tema 6. Genotecas de DNA genómico Tema 9. Técnicas de Ingeniería Genética, pp. 281-290 Apartados 9.1, 9.2. Genotecas para la secuenciación de genomas completos (obtención de genomas de referencia) Técnicas de Ingeniería Genética p. 332 Estrategias de clonación Tema 4. Técnicas de Ingeniería Genética, pp. 111-122 Apartado 4.3, 4.4  Definiciones Ya hemos visto cómo obtener un fragmento “clonable” de DNA mediante diferentes aproximaciones. También hemos visto diferentes “vectores de clonación”, es decir moléculas con capacidad de replicarse dentro de la célula La clonación es el proceso que nos va a permitir “producir” muchas copias de un fragmento de DNA El vector de clonación es la molécula que llevará nuestro el segmento de DNA a una célula huésped donde se replicará y producirá muchas copias de sí mismo y del segmento DNA de insertado en él. Unión (ligamiento) de fragmentos de restricción  Obtención de fragmentos de DNA Fragmentos de restricción Necesitamos que el fragmento de DNA y el vector (normalmente un plásmido) linealizado (abierto) tengan extremos compatibles.  Fragmentos de restricción Los extremos puedes ser protuberantes o romos  Fragmentos de restricción Los extremos romos del fragmento y el vector han podido ser generados por enzimas diferentes. Por ejemplo, podemos obtener un fragmento con EcoRV e introducirlo en un vector abierto en el MCS con SmaI  Fragmentos de restricción En el caso de los extremos protuberantes, es necesario que los extremos del fragmento y el vector estén generados por las mismas enzimas de restricción o enzimas compatibles. Además, los extremos protuberantes del fragmento de restricción pueden ser iguales o diferentes.  Clonación no direccional Este tipo de clonación se conoce como NO DIRECCIONAL  Clonación no direccional Algo similar tenemos cuando los extremos de los fragmentos tienen extremos romos. En este caso la eficiencia de la ligación es más baja que cuando tenemos extremos cohesivos  Clonación no direccional Inconvenientes de la clonación no direccional 1) El DNA se puede insertar en dos direcciones 2) Se puede encontrar copias en tándem de los insertos 3) Se puede re-circularizar el vector Clonación no direccional Clonación no direccional: fosfatasa alcalina Fosfatasa alcalina La fosfatasa alcalina elimina grupos fosfato 5’ de DNA y RNA. También elimina los fosfatos de “Calf Intestinal Phosphatase” los nucleótidos y proteínas. Estas enzimas son más activas a pH alcalino Clonación no direccional: fosfatasa alcalina Fosfatasa alcalina La fosfatasa alcalina elimina grupos fosfato 5’ de DNA y RNA. También elimina los fosfatos de los nucleótidos y proteínas. Estas enzimas son más activas a pH alcalino  Clonación direccional con enzimas de restricción l Se logran mejores eficiencias de ligación de DNA cuando tanto el vector y el inserto se cortan con 2 enzimas de restricción diferentes que dejan extremos de cadena sencilla (extremos cohesivos) no compatibles. l El DNA se introduce en una sola dirección, y sólo hay un bajo fondo de plásmidos no recombinantes l Por ello se conoce como CLONACIÓN DIRECCIONAL. Clonación direccional  Clonación ¿Qué pasa cuando no tenemos sitios de restricción compatibles en el inserto y en el vector?  Blunting Una posibilidad es convertirlos en romos: “blunting”  Clonación: generación de extremos romos Conversión de extremos protuberantes en romos l T4 DNA polimerasa tiene actividad 3’-5’ exonucleasa l En presencia de un exceso de dNTPs convierte extremos 3’ protuberantes en romos l El producto puede ser ligado a otro extremo romo Clonación de productos fragmentos: adaptadores y acopladores  Clonación de productos fragmentos: adaptadores y acopladores Como alternativa tras la conversión a extremos romos, se pueden añadir (ligar) fragmentos de DNA para generar extremos cohesivos a nuestra elección. Tenemos dos clases: adaptadores y acopladores Ambos son oligonucleótidos de doble cadena sintetizados químicamente. Los adaptadores tienen un extremo romo y otro protuberante. El extremo protuberante tiene la secuencia correspondiente al extremo cohesivo generado por la enzima que vamos a utilizar El acoplador (linker) es un fragmento romo que incluye la secuencia de un sitio de restricción fragmento + fragmento DNA ligasa + DNA ligasa Restricción adaptador acoplador (linker) Clonación “masiva” de fragmentos de restricción: Construcción de genotecas Genotecas de DNA genómico  Genotecas Las (buenas) genotecas de DNA genómico incluyen todos los genes del organismo con sus promotores e intrones, así como elementos reguladores. En el caso de bacterias pueden contener un operón completo en el inserto clonado en el vector La clonación de fragmentos de restricción en vectores (plásmidos o fagos) es el método clásico que se utiliza para la obtención de genotecas  Construcción de genotecas de DNA genómico Tres factores a considerar sobre cómo vamos a fragmentar nuestro DNA. 1) Digestión completa o parcial 2) Utilizamos enzimas con secuencias de reconocimiento de 4, 6 u 8 pb Construcción de una genoteca de DNA genómico  Genotecas: caracterización Dado que una genoteca contiene una población aleatoria de fragmentos genómicos, necesitamos utilizar un enfoque estadístico para determinar cuántos plásmidos o fagos recombinantes independientes se necesitan para garantizar que todas las secuencias genómicas estén representadas en la biblioteca. Se utilizan dos enfoques estadísticos para estimar el número de recombinantes necesarios. La primera es la 'regla empírica del biólogo molecular perezoso': Primero, calculamos el número de recombinantes individuales que contienen suficiente secuencia de DNA genómico para representar un genoma completo: el genoma equivalente. Tamaño del genoma Número de recombinantes para 1 equivalente = Tamaño medio inserto  Genotecas: caracterización Tamaño del genoma Número de recombinantes para 1 equivalente = Tamaño medio inserto En S. cerevisiae con un genoma de 12.000.000 pb, si el tamaño medio de los insertos es de 10.000 pb 1 equivalente 12.000.000/10.000 = 1.200  Genotecas: caracterización El genoma equivalente asume que los insertos genómicos no se superponen. En realidad, los fragmentos se superponen y cada secuencia está presente en varios fragmentos Para aproximar esta distribución, la 'regla empírica' estipula que: “Se necesitan 5 equivalentes de genoma para asegurar que todas las secuencias genómicas estarán representadas con un 95% de probabilidad” “Se necesitan 10 equivalentes de genoma para asegurar que todas las secuencias genómicas estarán representadas con un 99% de probabilidad”  Genotecas: caracterización El segundo enfoque utiliza la fórmula estadística simple: ln (1 - p) N= ln (1 - f) donde p = probabilidad (0,95 o 0,99) f = fracción del genoma contenida en un solo inserto promedio f= Tamaño medio inserto en pb Tamaño del genoma en pb  Construcción de nuestra genoteca de DNA genómico Materia prima: DNA genómico de levadura Tamaño: aprox: 12.000.000 pb f = Tamaño medio inserto en pb 10.000 = 8,3 x10-4 Tamaño del genoma en pb f= 12.000.000 N = ln(1-P) P= 99,99 ln(1-f) f= 8,3 x10-4 Es un número razonable de clones, podemos N=11.092 clones utilizar plásmidos para construir nuestra genoteca La regla empírica del biólogo molecular “se pasa” con el número de recombinantes necesarios para dar una representación completa del genoma, pero mejor. Nunca se pueden tener DEMASIADOS plásmidos recombinantes  Vector de clonación para la genoteca de levadura En el caso de organismos con genomas menos complejos como la levadura S. cerevisiae podemos utilizar genotecas de DNA genómico construidas sobre plásmidos, que además puedan ser funcionales en el organismo en cuestión  Construcción genoteca DNA genómico DNA de levadura YEp13 Sau3A BamHI (parcial) (completa) Selección fragmentos 10 kpb Fosfatasa alcalina Plásmido digerido DNA ligasa (T4) Construcción genoteca DNA genómico Construcción genoteca DNA genómico Construcción de nuestra genoteca de DNA genómico Materia prima: DNA genómico de levadura Tamaño: aprox: 12.000.000 pb f = Tamaño medio inserto en pb 10.000 = 8,3 x10-4 Tamaño del genoma en pb f= 12.000.000 N = ln(1-P) P= 99,99 ln(1-f) f= 8,3 x10-4 Es un número razonable de clones, podemos N=11.092 clones utilizar plásmidos para construir nuestra genoteca Humanos 3.3x109 pb f=3,03x10-6 N=3.039.711 clones  Vectores para genotecas de DNA genómico Tipo de vector Tamaño del Ventaja Desventaja inserto (Kb) Plásmido 0.5-8 Fácil clonación y Puede tener eficiencias de rastreo transformación bajas Lambda ins. 0.5-7 Fácil rastreo y Inserto pequeño almacenaje Lambda reempl. 9-20 Fácil de propagar Inserto relativamente y amplificar pequeño Cósmido 30-45 Mayor tamaño de Más difícil de rastrear inserto PAC (Fago P1) 50-100 Muy estable Empaquetamiento variable BAC (Factor F’) 50-300 Muy estable Dificultad para transformación YAC (levadura) 200-1000 Genoma humano Reordenaciones en 5000 clones Genotecas para la secuenciación de genomas completos (genoma de referencia) Genotecas para la secuenciación de genomas completos (genoma de referencia) Clonación de cDNAs: construcción de genotecas de cDNA Clonación de cDNAs  Genotecas de cDNA Genotecas de cDNA La colección de cDNAs correspondiente a todos los mRNAs en un tipo celular dado. Muchos de los genes en eucariotas superiores son demasiado grandes para ser incluidos en un solo clon λ a causa de sus grandes intrones. En contraste, los cDNAs de longitud completa, que contiene toda la secuencia codificante de la proteína, se pueden incluir en un solo clon λ. Sin embargo, debido a las dificultades metodológicas, no todos los clones de cDNA contienen la totalidad de la secuencia complementaria del mRNA; para obtener un cDNA de longitud completa es necesario, a menudo, aislar varios clones de cDNA hasta encontrar el que tenga toda la longitud  Genotecas Las genotecas de cDNA proceden de la transcripción reversa de mRNA. Por lo tanto, además de la región codificadora contienen las regiones 5’ y 3’ UTRs, pero no promotores ni intrones. Son además, específicas de tejido o de una condición dada Genotecas cDNA Genotecas cDNA Obtención de fragmentos de DNA 1. Fragmentos de restricción 2. cDNA 3. Fragmentos de PCR Clonación de productos de PCR Clonación de productos de PCR Clonación de productos de PCR  Clonación directa de productos de PCR Normalmente, el vector para el TA cloning es comercial. Se obtiene mediante la apertura del vector y la adición de timidinas en el extremo 3’ mediante TdT  El sistema TOPO TA para clonar productos de PCR Por PCR se genera el fragmento de gen que queremos clonar. El vector contiene la secuencia de reconocimiento de la DNA topoisomerasa y lleva a la enzima covalentemente unida al extremo 3’. Cuando los extremos 3’ de los productos de PCR se aparean con las T protuberantes del vector, la topoisomerasa cataliza el ligamiento, que tiene lugar a temperatura ambiente La clonación es altamente eficiente (tan alta como 90%).  El sistema TOPO TA para clonar productos de PCR Hay sitios EcoRI que flanquean el sitio de inserción del producto de PCR para facilitar la extracción de insertos. Genes de resistencia a ampicilina kanamicina para su selección en E. coli Selección azul / blanco de las colonias recombinantes Promotores de fagos para la transcripción in vitro  Adición de sitios de restricción por PCR Introducción de sitios de restricción para clonación de secuencias de DNA Clonación de fragmentos de DNA obtenidos por PCR  PCR: ejercicio Dada la secuencia 5’ATGGCAGATCAAGTACCAGTTACAACACAACTACCACCAATAAAACCTGAACATGAGGTA 3’ 3’TACCGTCTAGTTCATGGTCAATGTTGTGTTGATGGTGGTTATTTTGGACTTGTACTCCAT 5’ Diseña una pareja de cebadores para introducir un sitio EcoRI a la izquierda y un sitio HindIII de las posiciones indicadas por las flechas. Considera que tienen que hibridar con 16 nucleótidos de la secuencia a amplificar EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT  PCR: ejercicio 5’ATGGCAGATCAAGTACCAGTTACAACACAACTACCACCAATAAAACCTGAACATGAGGTA 3’ 3’TACCGTCTAGTTCATGGTCAATGTTGTGTTGATGGTGGTTATTTTGGACTTGTACTCCAT 5’ Diseña una pareja de cebadores para introducir un sitio EcoRI a la izquierda y un sitio HindIII de las posiciones indicadas por las flechas. Considera que tienen que hibridar con 16 nucleótidos de la secuencia a amplificar EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT  PCR: amplificación agatGAATTC  PCR: ejercicio 5’ATGGCAGATCAAGTACCAGTTACAACACAACTACCACCAATAAAACCTGAACATGAGGTA 3’ 3’TACCGTCTAGTTCATGGTCAATGTTGTGTTGATGGTGGTTATTTTGGACTTGTACTCCAT CAAGTACCAGTTACAA CAAGTACCAGTTACAA 5’ Diseña una pareja de cebadores para introducir un sitio EcoRI a la izquierda y un sitio HindIII de las posiciones indicadas por las flechas. Considera que tienen que hibridar con 16 nucleótidos de la secuencia a amplificar EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT  PCR: clonación 5´AGATGAATTCCAAGTACCAGTTAACAA 3’ 5’ATGGCAGATCAAGTACCAGTTACAACACAACTACCACCAATAAAACCTGAACATGAGGTA 3’ 3’TACCGTCTAGTTCATGGTCAATGTTGTGTTGATGGTGGTTATTTTGGACTTGTACTCCAT CAAGTACCAGTTACAA CAAGTACCAGTTACAA 5’ Diseña una pareja de cebadores para introducir un sitio EcoRI a la izquierda y un sitio HindIII de las posiciones indicadas por las flechas. Considera que tienen que hibridar con 16 nucleótidos de la secuencia a amplificar EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT PCR: amplificación PCR: amplificación TTCGAAtagc  PCR: ejercicio 5’ATGGCAGATCAAGTACCAGTTACAACACAACTACCACCAATAAAACCTGAACATGAGGTA 3’ 3’TACCGTCTAGTTCATGGTCAATGTTGTGTTGATGGTGGTTATTTTGGACTTGTACTCCAT 5’ TGGTTATTTTGGACTT Diseña una pareja de cebadores para introducir un sitio EcoRI a la izquierda y un sitio HindIII de las posiciones indicadas por las flechas. Considera que tienen que hibridar con 16 nucleótidos de la secuencia a amplifica EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT  PCR: ejercicio 5’ 3’ CGATAAGCTTTTCAGGTTTTATTGGT 5’ATGGCAGATCAAGTACCAGTTACAACACAACTACCACCAATAAAACCTGAACATGAGGTA 3’ 3’TACCGTCTAGTTCATGGTCAATGTTGTGTTGATGGTGGTTATTTTGGACTTGTACTCCAT 5’ TGGTTATTTTGGACTT Diseña una pareja de cebadores para introducir un sitio EcoRI a la izquierda y un sitio HindIII de las posiciones indicadas por las flechas. Considera que tienen que hibridar con 16 nucleótidos de la secuencia a amplificar EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT  PCR: ejercicio 5´AGATGAATTCCAAGTACCAGTTAACAA 3’ 5’ CGATAAGCTTTTCAGGTTTTATTGGT 3’ CAAGTACCAGTTACAA 5’ATGGCAGATCAAGTACCAGTTACAACACAACTACCACCAATAAAACCTGAACATGAGGTA 3’ 3’TACCGTCTAGTTCATGGTCAATGTTGTGTTGATGGTGGTTATTTTGGACTTGTACTCCAT 5’ TGGTTATTTTGGACTT AGATGAATTCCAAGTACCAGTTACAACACAACTACCACCAATAAAACCTGAAAAGCTTATCG TCTACTTAAGGTTCATGGTCAATGTTGTGTTGATGGTGGTTATTTTGGACTTTTCGAATAGC  PCR: ejercicio 5´AGATGAATTCCAAGTACCAGTTAACAA 3’ 5’ CGATAAGCTTTTCAGGTTTTATTGGT 3’ 5’ATGGCAGATCAAGTACCAGTTACAACACAACTACCACCAATAAAACCTGAACATGAGGTA 3’ 3’TACCGTCTAGTTCATGGTCAATGTTGTGTTGATGGTGGTTATTTTGGACTTGTACTCCAT 5’ AGATGAATTCCAAGTACCAGTTACAACACAACTACCACCAATAAAACCTGAAAAGCTTATCG TCTACTTAAGGTTCATGGTCAATGTTGTGTTGATGGTGGTTATTTTGGACTTTTCGAATAGC HindIII + EcoRI AATTCCAAGTACCAGTTACAACACAACTACCACCAATAAAACCTGAAA GGTTCATGGTCAATGTTGTGTTGATGGTGGTTATTTTGGACTTTTCGA Estrategias específicas de clonación Con lo que hemos visto hasta ahora ¿cómo uniríais los fragmentos A (promotor) y B (región codificadora)? Promotor Región codificadora (ORF) Con lo que hemos visto hasta ahora ¿cómo uniríais los fragmentos A (promotor) y B (región codificadora)? Promotor Región codificadora (ORF) Podría, simplemente, añadir DNA ligasa y unir los extremos romos Podría dirigir la unión para que la unión de los dos fragmentos se produjese en la forma que yo quiero añadiendo un sitio de restricción por PCR Promotor RI Región codificadora (ORF) RI PCR PCR Restricción (RI) Ligasa El problema es que la unión de dos fragmentos mediante la introducción de un sitio de restricción generado por enzimas tipo IIP siempre deja una “marca” o “huella” Promotor RI Región codificadora (ORF) RI PCR PCR Restricción (RI) Ligasa Sin embargo, al unir los dos fragmentos he introducido nucleótidos extra. Vamos a ver procedimientos mediante los cuales podemos unir fragmentos sin dejar “cicatrices” (“SCARLESS”) a diferencia de lo que ocurre cuando utilizamos enzimas de restricción Además, con el procedimiento anterior he generado extremos cohesivos que mejoran la unión de los fragmentos respecto a la unión de extremos romos, pero estos extremos protuberantes son muy cortos (2-4 b). Los procedimientos que veremos van a crear extremos cohesivos más largos, que facilitan la interacción y ligamiento entre fragmentos o entre fragmentos y el vector. Estrategias específicas de clonación User Assembly SLIC y Gibson assembly User Assembly  User Assembly Estos extremos cohesivos relativamente largos, pero no demasiado (entre 6 y 15 nucleótidos) se pueden crear en cualquier fragmento mediante PCR En su primera versión, se utilizó para clonar un fragmento de PCR a un vector al que se había unido una secuencia sintética que permite crear extremos cohesivos de longitud más larga a la que generan las enzimas de restricción  Enzimas de restricción. Tipo IIA Secuencia de reconocimiento: asimétricas Estructura heterodímero. Cada subunidad es responsable del corte de una cadena Cofactores y Activadores: Mg2+ Sitio de corte: Dentro de la secuencia conocida o próximo a ella Ejemplo: Bpu10 I: CCTNAGC GGANTCG Se han utilizado para generar “nicking enzymes” que cortan sólo en una de las cadenas del DNA Enzimas de restricción. Tipo IIA User Assembly  User Assembly ¿cómo generamos extremos cohesivos compatibles con los extremos cohesivos del vector? El fragmento lo amplificamos por PCR añadiendo unas colas con los mismos extremos en La particularidad que tiene el vector es que en vez de la T última ponemos una U  User Assembly ¿cómo generamos extremos cohesivos compatibles con los extremos cohesivos del vector? El fragmento lo amplificamos por PCR añadiendo unas colas con los mismos extremos que La particularidad tiene el vector es que en vez de la T última ponemos una U  User Assembly GGC TTA AU NNNNNN> NNNN Síntesis química de oligonucleótidos  User Assembly Tratamos el producto de PCR con la “User enzyme” que en realidad es una mezcla de enzimas User Assembly  User Assembly Pero lo que hace más interesante al “USER assembly” es que nos permite unir, en general dos fragmentos de PCR simplemente duplicando los extremos e introduciendo una sustitución de una “T” por una ”U”, siempre que esté situada entre 6 y 15 nucleótidos del principio del fragmento User Assembly User Assembly Estrategias específicas de clonación SLIC y Gibson assembly Estrategias específicas de clonación Gibson assembly  SLIC y Gibson assembly La técnica del Gibson assembly (Gibson 2009), es similar al SLIC, excepto que usa tres enzimas: # una exonucleasa específica una polimerasa termoestable una ligasa para sellar los nicks. SLIC y Gibson assembly SLIC y Gibson assembly SLIC y Gibson assembly  SLIC y Gibson assembly El vector de destino linealizado y el producto 3’ de PCR se mezclan con la 5’>3’ exonucleasa T5 que 3’