Clonación de Ácidos Nucleicos PDF

Clonación de ácidos nucleicos UD.5  Clonación molecular Análisis Necesita Aplicar técnicas estructural y cantidad de biología funcional de AN suficiente molecular Amplificación Clonación molecular Tecnología del ADN recombinante...

Clonación de ácidos nucleicos UD.5  Clonación molecular Análisis Necesita Aplicar técnicas estructural y cantidad de biología funcional de AN suficiente molecular Amplificación Clonación molecular Tecnología del ADN recombinante Las enzimas de restricción (endonucleasas de restricción) bacterianas cortan moléculas de ADN en secuencias específicas de ADN llamadas sitios de restricción Una enzima de restricción generalmente hace muchos cortes Se obtienen fragmentos de restricción Las enzimas de restricción más útiles cortan el ADN generando extremos cohesivos. Tecnología del ADN recombinante Las moléculas de ADN recombinante se introducen en una célula. Y luego por multiplicación de estas células en cultivos obtenemos copias del ADN. Y por lo tanto del fragmento introducido.  Los extremos cohesivos son “pegajosos”; son muy reactivos ADN ligasa es una enzima que sella las uniones entre los fragmentos de restricción  Sitio de restricción 5 3 GAATTC ADN CTTAAG 3 5 1 Enzima de restricción corta dentro de una secuencia de ADNds 3 5 5 AATTC 3 G CTTAA G 5 Extremo 3 3 5 “pegajoso”  Sitio de restricción 5 3 GAATTC ADN CTTAAG 3 5 1 Enzima de restricción corta dentro de una secuencia de ADNds 3 5 5 AATTC 3 G CTTAA G 5 Extremo 3 3 5 “pegajoso” 5 AATTC 3 G G CTTAA 2 Fragmento de ADN de 3 otra molécula 5 cortada por la misma enzima.. 5 3 5 3 5 3 G AATT C G AATT C C TTAA G C TTAA G 3 53 5 3 5 Una posible combinación  Sitio de restricción 5 3 GAATTC ADN CTTAAG 3 5 1 Enzima de restricción corta dentro de una secuencia de ADNds 3 5 5 AATTC 3 G CTTAA G 5 Extremo 3 3 5 “pegajoso” 5 AATTC 3 G G CTTAA 2 Fragmento de ADN de 3 otra molécula 5 cortada por la misma enzima. 5 3 5 3 5 3 G AATT C G AATT C C TTAA G C TTAA G 3 53 5 3 5 Una posible combinación 3 ADN ligasa une Los fragmentos 5 3 3 Molécula de ADN recombinante 5  Proceso de clonación molecular 1. Inserción de fragmento de ADN de interés en vector. Esto se hace con la tecnología del ADN recombinante 2. Introducción del vector en un célula viva hospedadora 3. Selección y multipicación de las células que portan el ADN recombinante 4. Recuperación del fragmento amplificado  bacteria 1 Inserción del gen Célula que contiene en el plásmido el gen de interés Cromosoma Plásmido bacteriano ADN Gen de recombinante interés ADN cromosómico (vector) 2 Introducción del vector en célula hospedadora Bacteria recombinante 3 Selección y multiplicación en cultivo De las células que portan el ADN recombinante Gen de interés Expresión de la proteínas Del gen de interés Recuperación del fragmento amplificado Recolección de proteína de interés 4 Investigación Investigación básica básica Basic y aplicaciones research diversas on protein Gen de resistencia Gen utilizado para La proteína disuelveTratamiento con hormona a plagas en plantas modificar bacterias los coágulos de sangrede crecimiento humano para limpiar ;tratamiento desechos tóxicos ataque al corazón  Ventajas de la clonación Permite obtener cantidades ilimitadas de la secuencia de interés. Se pueden clonar secuencias de ADN de gran tamaño (mayores que en PCR) (1.106pb) Permite clonar el genoma entero de un organismo, fragmentándolo previamente, lo que permite crear librerías genómicas. También se pueden clonar simultáneamente todos los ARNm de una población celular en forma de ADNc, permitiendo la creación de librerías de ADNc.  Ventajas de la clonación Posibilita la expresión de genes o de secuencias de interés, de lo que se derivan aplicaciones industriales para la producción de proteínas, hormonas… pero también para la investigación, la agricultura, o en la medicina como la obtención de organismos transgénicos, la terapia génica…  Clonación molecular VS PCR Clonación molecular PCR In vivo In vitro El fragmentos de interés se El fragmento de interés se amplifica aprovechando la amplifica en un tubo de manera maquinaria de una célula viva. artificial Técnica manual, tarda varios Técnica automatiza, tarda días. horas. Permite obtener cantidades La cantidad está limitada al nº ilimitadas de la secc. de interés. de ciclos de replicación. Puede amplificar secuencias de Nivel de amplificación menor. millones de pb (hasta 3,5kb) Componentes de la clonación Células hospedadoras Vectores Los vectores de clonación Los vectores de clonación Características de los vectores de clonación Características de los vectores de clonación Tipo de vectores  Vectores Plásmidos Fagos Cósmidos Fagémidos Cromosomas artificiales Moléculas circulares de ADN bicatenario extracromosómico de origen bacteriano con capacidad autónoma de replicación. Ingeniería genética Plásmido natural Plásmido natural Existen muchos tipos de plásmidos distintos, la elección del plásmido idóneo para cada caso particular de clonación intervienen dos parámetros importantes: El tamaño del inserto que puede transportar El Nº de copias del plásmido por célula que se puede alcanzar tras su replicación en la célula hospedadora   Permite la identificación sencilla de los plásmidos recombinantes, ya que contiene un fragmento del gen bacteriano lacZ que produce colonias de color azul. Si se inserta un fragmento de ADN en el polylinker, se inactiva este gen, y da lugar a colonias de color blanco Colonias bacterianas transformadas con pUC18 Colonias blancas: Colonias azules: contienen plásmidos contienen plásmidos recombinantes no recombinantes Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan bacterias Algunos tipos de fagos insertan temporalmente su material genético en el cromosoma de la bacteria mediante recombinación, ciclo lisogénico. Este es el caso de uno de los fagos más usado como vector de clonación: el fago lambda (fago λ). En estos vectores se pueden incluir insertos de hasta 20 Kb Son vectores híbridos construidos con parte del cromosoma del fago λ y parte de un plásmido bacteriano. tamaño, de hasta 50 Kb. Son vectores híbridos compuestos por un plásmido (con su origen de replicación bacteriano) al que se le inserta el origen de replicación de un fago M13 que replica ADNss: es decir, tiene dos origenes de replicación. Cuando se introducen en una célula hospedadora, se comportan como cualquier otro vector plasmídico: Se replica dando ADNds Pero tiene la posibilidad de producir ADNss, para esto se infecta la célula hospedadora que lo contiene con M13, de manera que las proteínas del virus reconocen el origen de replicación del fagémido e inician la replicación de cadenas sencillas que salen al medio externo. Son útiles para experimentos de secuenciación y para producir sondas monocatenarias. Son vectores de clonación con capacidad de transportar fragmentos de gran tamaño. Se encuentran dentro de vectores de alta capacidad y son idóneos para la construcción de genotecas genómicas, porque permiten clonar fragmentos de ADN de gran tamaño con gran estabilidad. Los más usados son: Cromosomas artificiales bacterianos(BAC; bacterialartificial chromosome),que pueden transportar insertos de ADN extraño de hasta 300 Kb Cromosomas artificiales de levaduras (YAC; yeast artificial chromosome), que son los vectores de mayor capacidad ya que pueden transportar insertos mayores de 1 Mb. Los vectores lanzadera o vectores transbordadores son un tipo de vectores híbridos que contiene orígenes de replicación de dos hospedadores diferentes, normalmente uno de plásmido bacteriano y otro de levadura o de virus animal. Además se construyen con marcadores genéticos que permiten su selección en ambos sistemas hospedadores. Se utilizan para transportar insertos entre dos hospedadores distintos, para estudios de expresión génica. En el primero se amplifica el inserto y el segundo se expresa el gen amplificado. Las células hospedadoras son aquellas en las que se introduce el vector de clonación para su amplificación mediante replicación. Bacteria 1 Inserción del gen dentro del vector Célula con gen de interés Cromosoma Plasmid bacteriano Gen de AND recombiante interés ADN foráneo 2 Plásmido dentro de La bacteria Bacteria recombiante Figure 20.2a La célula hospedadora con el vector se cultiva en medios adecuados en los que se multiplica, dando lugar a una progenie de células hijas, todas con la misma carga genética, es decir, un clon La elección de la célula hospedadora depende del vector de clonación empleado y de la finalidad perseguida. Las células más usadas como hospedadoras para clonar plásmidos, fagos y cósmidos, fáciles de cultivar y manipular, su versatilidad y su rápido crecimiento. Cepas defectivas especiales que carecen de algunas actividades enzimáticas para favorecer la estabilidad de los vectores. Por ejemplo Carecer de exonucleasas para evitar la degradación de vectores de clonación lineales Carecer de genes que controlan la recombinación génica, para evitar la integración del vector en el cromosoma bacteriano. La bacteria más usada en clonación es E. coli, en concreto la cepa K12, pero se pueden usar otras especies, como Bacillus subtilis y especies del género Streptomyces.. Puede ser: - Levaduras - Células vegetales - Células animales de insectos o de mamíferos. LEVADURAS Eucariotas unicelulares Crecen en medio de cultivo sólidos y líquidos. Se utilizan para cultivar YAC Las más usada: Saccharomyces cerevisiae Células Vegetales y animales Se utilizan principalmente en experimentos de clonación encaminados a la inserción de genes extraños en el genoma de la célula hospedadora y su posterior expresión para obtener organismos transgénicos. - Vegetales: plásmido Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. - Animales: se utilizan vectores víricos, como los bacuolavirus que infectan células de insectos, retrovirus que infectan células de mamíferos. A. tumefaciens es una bacteria del suelo que infecta muchas especies de plantas, produciendo la aparición de tumores o “agallas”. Las cepas patógenas se caracterizan por tener un plásmido conjuga vo de gran tamaño, denominado plásmido Ti. Durante la infección, las bacterias transfieren el plásmido Ti a la célula vegetal y una parte de él se integra en el ADN cromosómico de la célula y se expresa. El plásmido Ti se usa como base para construir vectores de clonación en células vegetales, insertando genes extraños en él junto con marcdores de selección: Ejem. Gen de resitencia a la kanomicina 3 Un vector recombinante es aquel que contiene un inserto de ADN extraño Consiste en digerirlo con la misma enzima de restricción que se usó para preparar el ADN que se va a clonar. Hay varias situaciones posibles: Una diana de restricción. Dos dianas de Vector lineal con una Vector circular restricción iguales y diana de restricción próximas Dos fragmentos con extremos interiores cohesivos y externos romos. Brazo I y D Vector lineal con dos dianas de restricción Vector abierto con extremos Vector abierto con extremos cohesivos cohesivos y pequeño fragmento que estaba entre las dos dianas con Tres fragmentos. Ejem. Fago λ. Interno con extremos cohesivos extremos cohesivos , y os dos de los extremos con interior cohesivos extremos romos  Mezclando en Unión de extremos concentración cohesivos por adecuada e complementariaedad Incubación en de bases condiciones óptimas ADN ligasa Sella las Vector de clonación mellas La ligasa sella covalentemente las mellas en la doble hélice de ADN, produciendo el vector recombinate. Tras la ligación se obtiene una mezcla compleja de moléculas. - El vector recombiante específico. - Aparecen productos recombinantes no deseados que se eliminaran en fases posteriores Existen varios métodos para introducir el vector en la célula hospedadora viva, depende del tipo de vector y de la célula. Introducción del vector Transformación bacteriana Transfección Transducción Electroporación  Captación e internalización por parte de una bacteria de moléculas de ADN desnudas presentes en el medio externo. Las bacterias que pueden realizar este proceso, se denominan “competentes”.   Similar a la transformación bacteriana, pero en células eucariotas,principalmente animales. Introducción de vectores recombinantes en células eucariotas no mediadas por virus. Métodos basados en agentes químicos  Introducción de material genético extraño en una célula por la acción de un virus. En la clonación, el vector recombinante se empaqueta dentro de la cápside de un virus con el que se infecta un cultivo de células hospedadoras. Lo más habitual es la infección de cultivos bacterianos con fagos recombinantes o cósmidos empaquetados en fagos. - Fagos ƛ recombinates y cósmidos con secuencias COS en los extremos, el empaquetamiento se consigue mezclando el vector recombinante con las proteínas de la cápside del virus. De forma natural se origian partículas víricas. Al infectar el cultivo bacteriano los viriones introducen el material genético en el interior de la bacteria. - Si el vector es un fago recombiante: ciclo lítico. Si es un cósmido, en el interior de la bacteria se circuliza por los extremos cohesivos y se comporta como plásmido.  Consiste en aplicar cortos pulsos eléctricos de alto voltaje a una mezcla de células hospedadoras en suspensión y vectores recombinantes en solución. Aumenta la permeabilidad de las membranas, permitiendo el paso de los vectores al interior de la célula. Muy eficaz y se puede aplicar con todo tipo de células hospedadoras Biolística  Al introducir el vector en la célula hospedadora se obtienen tres tipos de células: 1. Células no transformadas, que no han captado ninguna molécula de ADN extraño. 2. Células transformadas que portan el vector recombinante específico. 3. Células transformadas que portan un vector no recombinante o alguna molécula de ADN no deseada producida durante la ligación. Células transformadas con vector recombinante específico  Marcadores genéticos que porta el vector: genes de resistencia a antibióticos enzimas que producen reacciones coloreadas proteínas fluorescentes Se seleccionan e genes letales… identifican los clones recombinantes Células transformadas con vector recombinante específico Detección basada en el empleo de vectores con dos genes de resistencia a l antibióticos, ampicilina y tetraciclina. El punto de inserción del ADN extraño está en el interior de la secuencia de uno de los genes de resistencia (Ej: T). En los vectores recombinantes ese gen no es funcional, al estar interrumpida la secuencia por el inserto de ADN extraño. Al introducir el vector en bacterias sensibles a A y T, se obtiene: - Células no transformadas; sensibles a A y T - Células transformadas con el vector recombinantes, resustentes a A y sensible a T. - Células transformadas con el vector no recombiante, resistentes a T y A.  Células transformadas con el vector recombinante, resistentes a la Células no transformadas, ampicilina y sensibles a la Células transformadas con el vector sensibles a ampicilina y tetraciclina no recombinante, resistentes a la tetraciclina ampicilina y a la tetraciclina  Se combinan: - Bacterias hospedadoras defectivas lactosas negativas Lac- (no pueden producir B- galactosidasa). Y además sensible al antibiótico para el que porta la resistencia el vector. - Vectores que contienen un gen de resistencia al antibiótico y el gen LacZα con un polylinker en el interior. En los vectores recombiantes este gen no es funcional , se interrumpe la secuencia con el inserto de ADN extraño. La identificación y la selección se hace de manera simultánea. Cuando se introduce el vector en bacterias sensibles al antibiótico se obtienen 3 tipos de células: - Células no transformadas, sensibles al antibiótico y lac- - Células transformadas con el vector recombiante, resistente al antibiótico y lac - - Células transformadas con el vector no recombinante, resistentes al antibiótico y lac +. En el medio de cultivo, las bacterias con el vector recombiante (lac-) producen colonias blancas y las del vector no recombiante (lac+) colonias azules.  Células transformadas con el vector recombinante, resistentes a Células transformadas con el Células no transformadas, antibiótico y lac- vector no recombinante, sensibles a antibiotico y resistentes al antibiótico y lac + lac- En este medio solo crecen las bacterias transformadas. Las bacterias con vector recombinante (lac-) son blancas y las que no (lac+) son azules color azul.  Se basa en el empleo de vectores son un gen de resistencia para la selección y un gen que codifica una proteína fluorescente para la identificación. La selección de bacterias transformadas se realiza en medios de cultivo con antibióticos y la identificación se realiza iluminado la placa con luz ultravioleta. Las colonias de bacterias transformadas con plásmidos no recombiantes tienen fluorescencia verde, y las colonias transformadas con plásmidos recombinantes no tienen fluorescencia. Proteína verde fluorescente (GFP). Medusa.  Células transformadas con el vector recombinante, resistentes a Células transformadas con el Células no transformadas, antibiótico y no fluorecente vector no recombinante, sensibles a antibiotico y no resistentes al antibiótico y fluorescentes En este medio solo crecen las bacterias transformadas. Las bacterias con vector recombinante no tienen fluorescencia y las que no son fluorescentes.  Utiliza vectores con un gen de resistencia a un antibiótico (marcador de selección) y un gen que codifica para una proteína letal para las bacterias (marcador de identificación) con un polylinker en su interior. En los vectores recombiantes la proteína letal no es funcional porque la secuencia queda interrumpida por el ADN extraño. La selección e identificación se realiza cultivando las bacterias en un medio con el antibiótico. Sólo crecen las bacterias con el vector recombiante, las otras mueren. Gen letal  Células transformadas con el vector recombinante, resistentes a Células transformadas con el Células no transformadas, antibiótico y no letales vector no recombinante, sensibles a antibiotico resistentes al antibiótico pero En este medio solo crecen las bacterias transformadas con vector recombinante. Las bacterias con vector no recombinante mueren por efecto de una proteína letal.  Tasa de transformación Mide la eficacia de la introducción del vector en la célula hospedadora Vt transformación Vs= volumen de suspensión bacteriana transformada utilizada para sembrar la placa C= cantidad de vector (volumen*concentración) UFC= unidades formadoras de colonias (en estrategia cromogénica es el nº de colonias blancas) Tasa de transformación= Nº de células transformadas/μg de vector Ejemplo  Bibliotecas de ADN Pueden ser de 3 tipos, dependiendo del tipo de ADN clonado: Genómicas. Cormosómicas ADNc.  Bibliotecas de ADN Una biblioteca genómica es una colección de vectores recombinantes clonados que incluyen el genoma completo de un organismo. Dada la complejidad del genoma de los org. superiors, se suelen usar vectores de alta capacidad, para intentar contener el genoma completo en el menor nº posible de clones. Fagos, cósmidos, BAC o YAC. Están representados todos los genes de un organismo.  Bibliotecas de ADN Al menos debe contener una copia de cualquier secuencia presente en el genoma. Se puede calcular el número de clones para tener una probabilidad del 100% de tener todo el genoma. Se calcula con base en el tamaño del genoma y el tamaño medio de los insertos clonados, que depende del vector. Ej: El genoma humano, en fago ƛ, debe contener varios cientos de miles (8.105) de clones para asegurar la representación de todo el genoma.  Genoma extraño Corte con enzimas de restricción Fragmentos o Fragmentos pequeños grandes BAC (o YAC) Inserto Grande con muchos genes Plásmidos/ (b) BAC clon fagos/ cósmidos recombiantes Clon (a) biblioteca (c) Conservación de librería genómica  Bibliotecas de ADN Una biblioteca cromosómica es una colección de vectores recombinantes clonados a partir de un único cromosoma o fracción cromosómica Se parte de un único cromosoma aislado de células mitóticas en metafase.  Bibliotecas de ADN Una biblioteca ADNc se obtiene a partir del ARNm de un tejido o una población celular, previa transcripción inversa. Representa los genes de un organismo que se están expresando en un tipo celular en un momento concreto. Cada clon porta un gen completo. Los genes carecen de intrones, promotores y secuencias reguladoras. Figure 20.6-1 ADN ARNm Figure 20.6-2 ADN ARN Transcriptasa inversa Cola Poli-Al ARNm 5 A A A A A A 3 3 T T T T T 5 Cadena Primer ADN  DNA in nucleus mRNAs in cytoplasm Reverse transcriptase Poly-A tail mRNA 5 A A A A A A 3 3 T T T T T 5 DNA Primer strand 5 A A A A A A 3 3 T T T T T 5 Figure 20.6-4 DNA in nucleus mRNAs in cytoplasm Reverse transcriptase Poly-A tail mRNA 5 A A A A A A 3 3 T T T T T 5 DNA Primer strand 5 A A A A A A 3 3 T T T T T 5 5 3 3 5 DNA polymerase Figure 20.6-5 DNA in nucleus mRNAs in cytoplasm Reverse transcriptase Poly-A tail mRNA 5 A A A A A A 3 3 T T T T T 5 DNA Primer strand 5 A A A A A A 3 3 T T T T T 5 5 3 3 5 DNA polymerase 5 3 3 5 cDNA  Análisis de una biblioteca de ADN Al final del proceso de clonación se obtiene una colección que contiene miles de clones en forma de colonias bacterianas, fagos recombinantes, colonias de levaduras o clones celulares vegetales o animales. El problema está en la forma de analizar la bibioteca. Es necesario realizar tres técnicas: La identificación del clon o clones. El paseo cromosómico. La secuenciación. 1. La identificación del clon o clones que contiene un gen o una secuencias concreta. Para ello se usan técnicas de hibridación o técnicas inmunológicas. Técnica de hibridación en colonias para las clonadas en bacterias y técnicas de hibridación en placas virales para las clonadas en fagos. En bibliotecas clonadas en vectores de expresión se pueden utilizar métodos indirectos, que consisten en detectar la proteína codificada por el gen por técnicas inmunológicas. Figure 20.7 TECHNIQUE Radioactively 5 3 labeled probe  CTCATCACCGGC molecules Gene of GAGTAGTGGCCG interest 3 5 Probe DNA Single- Film stranded DNA from Multiwell plates cell holding library clones Nylon membrane Location of Nylon DNA with the membrane complementary sequence 2. El paseo cromosómico o identificación de clones que porten secuencias consecutivas. Esto permite, dentro de una biblioteca de ADN, localizar clones que portan una secuencia adyacente a la de un clon dado. Se basa en el empleo de bibliotecas obtenidas mediante digestión parcial del ADN de partida con una enzima de restricción, de forma que se producirán fragmentos con regiones solapantes. Se identifica un clon (clon A), se utiliza el extremo de su inserto como sonda para rastrear la biblioteca. Detecta genes que contengan ese mismo gragmento de ADN (solapamiento) + una frecuencia adyacente (clon B). Se repite con el clon B y así sucesivamente. La secuenciación. El análisis definitivo de un clon cosiste en descifrar la secuencia de ADN insertado que porta el vector recombinante. La secuenciación de todos los clones de una biblioteca obtenida mediante digestión parcial del ADN permite, con ayuda del software adecuado, obtener la codificación completa del genoma clonado, alineando las distintas secuencias en base a los solapamientos.  Sus aplicaciones son innumerables. Obtener cantidades ilimitadas de gen o secuencia de interés. Posibilitar la expresión de los genes , o integrarlos en el genoma de un organismo. Las aplicaciones pueden encuadrarse en la investigación básica, como en la aplicada en medicina, industria, agricultura,...  La investigación básica es clave para descifrar las secuencias génicas completas de cualquier organismo, para estudios filogenéticos, diversidad génica y expresión génica. La investigación aplicada, tienen especial interés en : - Clonación en vectores de expresión, que posibilitan la producción a nivel industrial de proteínas recombinantes: a) De interés médico o farmacéutico. a) De interés médico o farmacéutico. Insulina, hormona de crecimiento, Factor VIII, vacunas , … b) De interés en la industria química y de la alimentación: enzimas y catalizadores c) De interés medioambiental: creación de microorganismos capaces de metabolizar petróleo, productos tóxicos,...  - Clonación mediante inserción de genes en el genoma de células vegetales o animales. Grandes avances en agricultura. Se pueden transferir directamente caracteres de interés a plantas y animales, produciendo individuos más resistentes a enfermedades o productos tóxicos, más fértiles, con mayor tasa de reproducción, …. Los organismos en los que se insertan los genes se llaman organismos transgénicos u organismos modificados genéticamente.  Investigación aplicada: Producción industrial de Clonación por inserción de genes en el genoma de células animales y vegetales :transferir caracteres de interés a plantas y animales, produciéndose, por ejemplo, individuos más resistentes a enfermedades o productos tóxicos, mayores tasas de producción…  En medicina hay dos aplicaciones de la clonación molecular que tienen actualmente interés. Creación de ratones transgéncos. Terapia génica. Ratones transgénicos Su ADN se ha modificado, ya sea por introducción de un gen nuevo o por eliminación de un gen propio. Una aplicación es el estudio de enfermedades genéticas, tanto a nivel de comprensión de la enfermedad como a nivel de tratamiento.  Ratones transgénicos  Terapia génica Transferir genes normales a células somáticas para corregir una enfermedad genética. Con esto se pretende conseguir que las células tratadas sinteticen el producto génico normal, evitando así un tratamiento farmacológico de por vida. Sometida a control legislativo y ético. Una posible terapia génica de células germinales que origina cambios en todas las células de un individuo y su descendencia se considera no ética en humanos.