CFGS Anatomía patológica y citodiagnóstico Módulo Biología molecular y citogenética PDF

Profesor: Rubén Flor Garcillán CFGS Anatomía patológica y citodiagnóstico Módulo Biología molecular y citogenética UD 2 Ácidos nucleicos y enzimas asociadas  2.1. Los ácidos nucleicos. Índice de la unidad 2.1.1. Estructura y composición química....

Profesor: Rubén Flor Garcillán CFGS Anatomía patológica y citodiagnóstico Módulo Biología molecular y citogenética UD 2 Ácidos nucleicos y enzimas asociadas  2.1. Los ácidos nucleicos. Índice de la unidad 2.1.1. Estructura y composición química. didáctica 2.1.2. Propiedades fisicoquímicas. 2.2. El ADN. 2.2.1. Estructura del ADN. 2.2.2. Otras organizaciones de las moléculas de ADN. 2.3. El ARN. 2.3.1. Estructura del ARN. 2.3.2. Tipos y organización del ARN. 2.4. El flujo de la información genética. 2.4.1. Replicación del ADN. 2.4.2. Transcripción del ADN a ARN. 2.4.3. Traducción del ARNm. 2.5. Enzimas empleadas en biología molecular. 2.5.1. Nucleasas. 2.5.2. Endonucleasas de restricción. 2.5.3. ADN polimerasas. 2.5.4. Retrotranscriptasas. 2.5.5. Desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt) 2.5.6. Ligasas. 2.5.7. Topoisomerasas. 2.1 Los ácidos nucleicos. qCélulas procariotas Ø No tienen núcleo celular ni orgánulos (salvo excepciones ¡, algunas tienen ribosomas). Ø El ADN se encuentra habitualmente de forma circular único en el citoplasma. Ø Poseen pared celular. Ø Pertenecen a los dominios taxonómicos de Archaea y bacteria. 2.1 Los ácidos nucleicos. qCélulas eucariotas Ø Tienen un núcleo rodeado por una membrana, orgánulos celulares. Ø El ADN se encuentra dentro del núcleo, pero el ARN tiene mayor posibilidad de movimiento (habitualmente citoplasma). Ø Su tamaño es mayor. Ø Pertenecen al reino Eukarya. 2.1 Los ácidos nucleicos. 2.1.1. Estructura y composición química. Ácidos nucleicos Son macromoléculas poliméricas encargadas de almacenar, transmitir y expresar la información genética de los seres vivos. Se encuentran bajo dos formas: ADN y ARN ▪ Ácido desoxinucleico (ADN) → almacena la información hereditaria ▪ Ácido ribonucleico (ARN) → se encarga de la expresión de la información genética mediante la síntesis de proteínas 2.1 Los ácidos nucleicos. 2.1.1. Estructura y composición química. ARN y ADN se diferencian en estructura y composición química, pero ambos están formados por largas cadenas de monómeros denominadas nucleótidos Cada nucleótido se encuentra conformado por una Base nitrogenada (compuestos cíclicos de C y N), un ácido fosfórico (fosfato, aporta la carga negativa) y una ribosa (glúcido de 5C) Base nitrogenada: púricas y pirimidínicas 2.1 Los ácidos nucleicos. 2.1.1. Estructura y composición química. ARN y ADN se diferencian en estructura y composición química, pero ambos están formados por largas cadenas de monómeros denominadas nucleótidos Cada nucleótido se encuentra conformado por una Base nitrogenada (compuestos cíclicos de C y N), un ácido fosfórico (fosfato, aporta la carga negativa) y una ribosa (glúcido de 5C) Ribosa Desoxirribosa La ausencia del oxígeno en el C2 determina la flexibilidad de la molécula y es responsable de la estructura de doble hélice del ADN 2.1 Los ácidos nucleicos. 2.1.1. Estructura y composición química. Un enlace fosfodiéster es un tipo de enlace covalente que se produce entre el grupo fosfato (PO43− ) unido al C5 de un nucleótido y el grupo hidroxilo (OH-) del C3 del siguiente. La unión de varios nucleótidos recibe el nombre de oligonucleótidos, cuando el número es pequeño, y polinucleótidos cuando las cadenas tienen un número elevado. 2.1 Los ácidos nucleicos. 2.1.1. Estructura y composición química. q Nucleósido Ø Es la unión entre una base nitrogenada (A, C, T, G o U) y la pentosa à ausencia de grupo fosfato. Ø En función de la pentosa que se una se forman ribonucleósidos o desoxirribonucleósidos. Ø La unión entre ambos se da mediante enlaces N-glucosídicos y da lugar a compuestos con la siguiente nomenclatura: ü -osina: se añade a bases púricas (adenosina y guanosina). ü -idina: se añade a bases pirimidínicas (citidina, timidina y uridina). 2.1 Los ácidos nucleicos. 2.1.1. Estructura y composición química. 2.1 Los ácidos nucleicos. 2.1.1. Estructura y composición química. q Nucleótido: Ø Es la unión de un anión fosfato al nucleósido mediante un enlace de tipo éster. Ø Esta unión da lugar a: ü Ribonucleótidos (en ARN, contienen ribosa como pentosa). ü Desoxirribonucleótidos (en ADN, contienen desoxirribosa como pentosa). Ø Para nombrarlo químicamente se elimina la –a final y se añade 5’ fosfato à ejemplo + + Timidin 5’ = = fosfato 2.1 Los ácidos nucleicos. 2.1.1. Estructura y composición química. q Nucleótido: Ø Polinucleótidos: cadenas lineales de nucleótidos (ADN o ARN)(más 50 bases). Ø Oligonucleótidos: cadenas lineales de nucleótidos más cortas (50 bases o menos). Ø Tanto en el ADN como en el ARN, los nucleótidos se unen por el grupo fosfato mediante enlaces fosfodiéster entre el carbono 5’ de la pentosa y el carbono 3’ de la siguiente. Ø Las cadenas comienzan en el carbono 5’ de la primera pentosa con un grupo fosfato, y terminan con el 3’ de la pentosa final (-OH). 2.1 Los ácidos nucleicos. 2.1.2. Propiedades fisicoquímicas. Ø Son fuertemente ácida en solución acuosa debido a los grupos fosfato. Ø Presentan elevada viscosidad incluso a concentraciones bajas. Ø Presenta un pico de absorción de luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nm (nanómetros), esto resulta útil para determinar su concentración. Ø Las dos cadenas de ADN se pueden separar elevando la temperatura o aumentando el pH. Esto se denomina desnaturalización, se debe a una rotura de puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias. Es un proceso reversible, renaturalización Ø Dos cadenas de ácidos nucleicos con una secuencia de bases complementarias unidas en condiciones adecuadas de temperatura y pH, por puentes de hidrógeno en un proceso denominado hibridación. 2.2 El ADN. 2.2.1. Estructura del ADN. El ADN tiene 4 niveles de organización progresivos. q Estructura primaria. Ø Consiste en una cadenasencilla de nucleótidos unidos entre sí mediante enlace fosfodiéster. Ø Almacena información genética que se interpreta mediante el código genético. 2.2 El ADN. 2.2.1. Estructura del ADN. q Estructura secundaria. Ø Es la disposición espacial de la molécula de ADN en forma de modelo tridimensional de doble hebra propuesto por Watson y Crick (1953) basados en los estudios de cristalografía y difracción de rayos X de Rosalind Franklin. Ø Se basa en la complementariedad de bases que permite sostener la doble hélice dextrógira. Ø Las dos cadenas de ADN son antiparalelas à los enlaces 5’-3’ están orientados en sentidos opuestos de manera que las bases nitrogenadas son complementarias. 2.2 El ADN. 2.2.1. Estructura del ADN. q Estructura secundaria. Ø Las cadenas de bases complementarias se mantienen unidas mediante enlaces de tipo puentes de hidrógeno. Ø Toda esta estructura se enrolla alrededor de un eje imaginario con las bases nitrogenadas hacia el interior y las Las cadenas se Las cadenas son La secuencia de BN pentosas y los grupos fosfato hacia el antiparalelas es complementaria mantienen unidas por puentes de H exterior. Las BN se Ø La complementariedad de bases se encuentran hacia el El giro de la doble El enrollamiento es establece entre A-T y C-G. dextrógiro interior y el grupo P y la ribosa en el hélice equivale a 10 nucleótidos exterior 2.2 El ADN. Una molécula bicatenaria contiene un 30% de G. Calcula el % del resto de bases 2.2 El ADN. 2.2.1. Estructura del ADN. q Estructura terciaria. Ø Es una forma de ADN circular (en bacterias o mitocondrias). Ø La fibra de ADN se retuerce sobre sí misma formando una superhélice à ADN superenrollado. 2.2 El ADN. 2.2.1. Estructura del ADN. q Estructura cuaternaria. Ø El ADN se asocia a proteínas (histonas) para compactarse en el núcleo formando cromosomas. Histonas: tienen función estructural. No histonas: grupo heterogéneo de proteínas reguladoras, estructurales y enzimáticas. Ø La unión de ADN e histonas da lugar a la cromatina que se va uniendo en forma de collar de perlas, donde cada perla recibe el nombre de nucleosoma. Nucleosoma: estructura cilíndrica formada por un octámero de histonas y ADN. 2.2 El ADN. 2.2.2. Otras organizaciones de las moléculas de ADN. q ADN de organismos procariotas. Ø Cromosoma bacteriano: molécula de ADN bicatenaria y circular de gran tamaño denominado cromosoma bacteriano, que se encuentra en el citoplasma sin membrana nuclear que lo separe de él. Ø Plásmidos: algunas bacterias además del cromosoma bacteriano, contienen pequeñas moléculas circulares bicatenarias de ADN, denominados plásmidos. ü Se replica independientemente del cromosoma bacteriano. ü Habitualmente contiene genes de resistencia a antibióticos y factores de virulencia. 2.2 El ADN. 2.2.2. Otras organizaciones de las moléculas de ADN. q ADN mitocondrial de células eucariotas: las células eucariotas presentan también ADN en sus mitocondrias. El ADN mitocondrial (ADNmt) consiste en una molécula bicatenaria y circular de ADN de unos miles de nucleótidos. Se hereda de la madre. 37 genes codificantes: de ARN ribosómico (2), ARN de transferencia (22) y enzimas empleadas en el metabolismo mitocondrial (13). Replicación independiente del ADN nuclear. Número de copias por mitocondria variable. 2.3 El ARN. 2.3.1. Estructura de ARN. Ø Es el ácido ribonucleico (ARN) que controla la síntesis de proteínas a partir de la información contenida en el ADN. Ø En organismos eucariotas se encuentra en el núcleo, citoplasma y ribosomas. Ø Su misión fundamental es ser el intermediario en la biosíntesis de proteínas mediante dos procesos consecutivos: ü Transcripción de la información genética de ADN celular a la secuencia complementaria de ARN. ü Traducción, mediante el uso del código genético, del ARN a la secuencia de aminoácidos correspondiente. 2.3 El ARN. 2.3.1. Estructura de ARN. Ø Es monocatenario (salvo en algunos virus), aunque en algunas regiones se puede plegar formando horquillas de doble hélice. Ø Se fundamenta en la complementariedad de bases idéntica del ADN a excepción de timina (T), que se cambia por uracilo (U). Ø Es más inestable que el ADN, pues el grupo OH de la ribosa es polar y tiene afinidad por el agua. 2.3 El ARN. 2.3.2. Tipos y organización del ARN. Existen distintos tipos: ü Funcionales (no se traducen a proteínas): ARNr, ARNt. ü Informativos (se traducen a proteínas): ARNm. q ARN mensajero (ARNm) Son moléculas lineales de ARN que portan información para la síntesis de proteínas. Una vez hecha la transcripción, el ARNm sale del núcleo y desempeña su función en el citoplasma. En función de las bases nitrogenadas que lleve se obtendrá una secuencia de aminoácidos distinta. Su función es servir de molde para identificar el aminoácido que se debe unir en la síntesis proteica en los ribosomas. 2.3 El ARN. 2.3.2. Tipos y organización del ARN. q ARN mensajero (ARNm) En procariotas son moléculas policistrónicas à en una misma región hay información genética de varias proteínas que se forman de manera simultánea. En eucariotas son monocistrónicas à en una determinada región hay información para una única proteína. 2.3 El ARN. 2.3.2. Tipos y organización del ARN. q ARN ribosómico (ARNr) Es el más abundante en las células y, junto a las proteínas, compone los ribosomas que son los orgánulos encargados de la síntesis proteica. Tienen una estructura secundaria compleja con horquillas y bucles. Funciona como catalizador de la síntesis proteica (ribozimas). 2.3 El ARN. 2.3.2. Tipos y organización del ARN. q ARN de transferencia (ARNt) Transporta aminoácidos activados hasta los ribosomas para que se incorporen a la cadena proteica que se está sintetizando. Es corto, con forma de trébol en su estructura secundaria con el extremo 3’ ocupado por CCA donde se une un aminoácido característico. Tiene 3 lazos y el central (anticodón) contiene las 3 bases que son complementarias al ARNm (codón).  2.3 El ARN. 2.3.2. Tipos y organización del ARN. q Otros tipos de ARN ARNhn: heterogéneo nuclear, precursor de ARNm. Requiere proceso de maduración. ARNsn: pequeño nuclear, con actividad enzimática sobre ARNhn provocando su maduración. Participa en la eliminación de intrones y unión de exones. ARNsno: pequeño nucleolar, precursor de varios ARN ribosómicos. ARNsc: citoplasmático pequeño, participa en el envío de proteínas a su destino final. 2.4 El flujo de la información genética. § El ADN contiene la información genética y esta es transmitida a la descendencia à para ello antes debe duplicarse mediante el proceso de replicación. § Además, es necesario que se dé la transformación de ADN a ARNm para que pueda viajar del núcleo al citoplasma donde sucede la síntesis de proteínas à transcripción. § Por último, la secuencia de bases nitrogenadas debe transformarse en una secuencia de aminoácidos que forman la proteína à traducción. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.1. Replicación del ADN. Replicación Proceso por el cual una molécula de ADN se duplica para dar lugar a dos moléculas de ADN hijas idénticas, que conservan la misma secuencia de bases que la molécula inicial. Es semiconservativa, bidireccional, secuencial, gradual , repetitiva y semidiscontinua. Gradual y repetitiva Bidireccional y secuencial Se añaden desoxirribonucleótidos uno a A partir del origen de replicación las cadenas de uno y mediante el mismo mecanismo ADN se separan y la síntesis de nuevas moléculas continuamente. sucede en ambas direcciones (2 horquillas de replicación Semiconservativa Semidiscontinua Cada molécula “hija” contiene una de las La síntesis siempre se da en dirección 5’ à 3’ lo hebras originales y otra de nueva cual es un problema para una de las hebras por lo síntesis. Hay un origen de replicación que se sintetiza con fragmentos de Okazaki. definido único en procariotas y múltiple Una se sintetiza de manera continua (adelantada) y en eucariotas (multifocal). la otra discontinua (retardada). 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.1. Replicación del ADN. q Enzimas del proceso de replicación. Ø Helicasa ü Enzima que desenrolla y separa las cadenas de doble hélice a partir del origen de replicación en ambos sentidos. ü Rompe los puentes de hidrógeno que unen ambas cadenas. Ø Proteína de unión a cadena sencilla (SSBP) ü Enzima que estabiliza las cadenas sencillas impidiendo la formación de la doble hélice. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.1. Replicación del ADN. q Enzimas del proceso de replicación. Ø Girasa y topoisomerasa ü Relajan la tensión del resto de la molécula de ADN mediante cortes y empalmes. Ø ADN polimerasa ü Se encarga de la síntesis de la nueva cadena añadiendo desoxinucleótidos complementarios al extremo 3’ de una cadena en crecimiento. ü También elimina nucleótidos desde un extremo (exonucleasa) pudiendo corregir errores en la replicación. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.1. Replicación del ADN. q Enzimas del proceso de replicación. Ø Primasa ü Se encarga de la síntesis de fragmentos cortos de ARN llamados cebadores (o primers) necesarios para empezar con la elongación. ü En la hebra adelantada basta con uno pero en la retardada se requiere uno por cada fragmento de Okazaki. Ø Ligasa ü Se encarga de unir los fragmentos de Okazaki para dar continuidad a la hebra en formación. 2.4 El flujo de la información genética. El llamado origen de replicación, que es el sitio donde debe iniciar la copia del material genético, 2.4.1. Replicación del ADN. en cada ciclo celular. En los organismos q Fases de la replicación. procariontes, cuyos genomas son relativamente 1. Iniciación sencillos, hay un solo origen de replicación, en tanto Las helicasas reconocen el origen de que en los eucariontes, con genomas más amplios y complejos, se encuentran varios orígenes de replicación con una secuencia de bases replicación, según algunos autores, existen 330 característica y rompen los puentes de orígenes. hidrógeno entre las hebras de ADN, creando una burbuja de replicación. § Las SSBP estabilizan las cadenas abiertas mientras la topoisomerasa y la girasa relajan la tensión. § Como resultado se crean dos regiones con forma de Y en los extremos de la burbuja llamadas horquillas de replicación. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.1. Replicación del ADN. q Fases de la replicación. 2. Elongación La primasa sintetiza los cebadores en dirección 5’à 3’, uno en la hebra adelantada y varios en la hebra retardada en función de los fragmentos de Okazaki. La primasa se separa y comienza a actuar la ADN polimerasa III incorporando nucleótidos en la posición 3’ libre de manera continua en la hebra adelantada y discontinua en la retardada. La ADN polimerasa I elimina los cebadores y los sustituye por desoxinucletidos. La ligasa une los fragmentos de Okazaki consecutivos dando continuidad. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.1. Replicación del ADN. q Fases de la replicación. 3. Terminación Las horquillas se han ido desplazando hasta el extremo contrario al origen de replicación. El final de la replicación se produce cuando la ADN polimerasa se encuentra con una secuencia de terminación. Se produce entonces el desacople de todo el replisoma (complejo de replicación) y la finalización de la replicación. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.1. Replicación del ADN. q Fases de la replicación. Existen algunas particularidades en eucariotas: La replicación se realiza en el núcleo y no en el citoplasma. Mayor complejidad y mayor tamaño del ADN. Orígenes de replicación múltiples, iniciándose de manera simultánea en varios puntos del cromosoma a velocidad lenta. Cinco polimerasas en vez de tres con funciones de elongación, exonucleasa y corrección de errores. Se deben deshacer las histonas y después reconstruir el nucleosoma. Los fragmentos de Okazaki son más cortos. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.2. Transcripción del ADN a ARN Transcripción Proceso por el cual se sintetiza una molécula de ARN utilizando como molde una cadena de ADN. Requiere de una ARN- polimerasa o transcriptasa. q Enzimas en el proceso de trascripción: ARN polimerasa-ADN dependiente o transcriptasa y existen 3 tipos en eucariotas: ü ARN polimerasa I: síntesis de ARNr. ü ARN polimerasa II: síntesis de ARNm. ü ARN polimerasa III: síntesis de ARNt. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.2. Transcripción del ADN a ARN 1. Iniciación La ARN polimerasa reconoce y se une a la región promotor en el ADN que se encuentra antes de la región a transcribir. La unión provoca la separación de la doble hebra de ADN y comienza la síntesis de ARN. En eucariotas, la ARN polimerasa no se une directamente al promotor, sino que proteínas auxiliares llamadas factores de transcripción se unen primero al promotor, permitiendo entonces la unión de la ARN polimerasa al ADN. La presencia de muchas As y Ts facilita la separación de las hebras de ADN. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.2. Transcripción del ADN a ARN 2. Elongación Se da el crecimiento de la cadena de ARN por incorporación de ribonucleótidos con bases complementarias, formando el híbrido ADN- ARN. Solo se transcribe una de las cadenas de ADN à cadena molde o codificadora. La que no se transcribe recibe el nombre de sin sentido, informativa o no molde. La ARN polimerasa se desplaza por el ADN en sentido 3’ à 5’ leyendo y seleccionando el ribonucleótido complementario. El ARN va creciendo en sentido 5’ à 3’. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.2. Transcripción del ADN a ARN 3. Terminación. Cuando la polimerasa alcanza una secuencia de ADN (TTATTT) llamada señal de terminación, se separa de la cadena y esta recupera su estructura de doble hélice.  2.4 El flujo de la información genética. 2.4.2. Transcripción del ADN a ARN q Maduración del ARN. Es el proceso que requieren las moléculas de ARN que se han transcrito para diferenciarse en los distintos tipos (ARNm, ARNr y ARNt). En eucariotas el proceso de maduración es complejo porque en los genes se alternan secuencias llamadas exones e intrones. o Exones: secuencias que se transcriben y traducen, portando información que da lugar a la síntesis de proteínas (codificantes). o Intrones: secuencias que se transcriben pero no se traducen, ya que no portan información para la síntesis de proteínas y se deben eliminar (no codificantes). 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.2. Transcripción del ADN a ARN q Maduración del ARN. La maduración del ARN tiene 3 pasos de: Adición de caperuza en 5’ para proteger el ARN de la degradación. (7-metilguanosina- trifosfato) Adición de cola poli-A en 3’ que permite la salida al citoplasma. Esta cola se debe a una enzima llamada poliA-polimerasa. Eliminación de intrones formando bucles y aproximando los extremos de los exones, eliminando el intrón à corte y empalme (splicing). 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.3. Traducción del ARNm. Traducción Proceso por el cual a partir de una molécula de ARNm se sintetiza una proteína. Durante este proceso, los aminoácidos se irán incorporando secuencialmente a la cadena polipeptídica El paso de bases nitrogenadas (A, C, G y U) a los 20 aminoácidos que existen se hace gracias al código genético à traducción (diccionario). Cada 3 bases nitrogenadas tenemos un codón à 1 aminoácido. Existen 64 codones posibles: 61 dan lugar a aminoácidos y 3 a secuencias de terminación (STOP). 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.3. Traducción del ARNm. El código genético es el diccionario que permite traducir una secuencia de bases nitrogenadas a una secuencia de aa’. Una secuencia de 3 BN codifica un aa’. El número posible de codones es igual al nº de variaciones con repetición de 4 bases tomadas de 3 en 3: 64 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.3. Traducción del ARNm. q Características del código genético: Universal: válido para todos los organismos (únicamente diferente para mitocondrial). No es ambiguo: cada triplete (codón) tiene su significado. Degenerado: varios codones pueden codificar un mismo aminoácido à redundancia. Los codones que dan lugar al mismo aminoácido se llaman sinónimos. Continuo y no solapado: los codones se encuentran seguidos unos de otros sin compartir ninguna base. Lectura lineal de tres en tres. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.3. Traducción del ARNm. q Fases del proceso de traducción: Para la síntesis de proteínas o traducción se necesitan: ARNm. 20 aminoácidos. Ribosomas: ARNr y proteínas. ARNt. Enzimas que catalizan la unión entre aminoácidos. Cada aa se une a su respectivo ARNt por la acción de una enzima la aminoacil-ARNt-sintetasa específica. Los ribosomas constan de dos subunidades de distinto tamaño: ü La subunidad menor: tiene un sitio de unión al ARNm. ü La subunidad mayor tiene dos sitios de unión a los ARNt: El sitio peptidil o sitio P, donde se sitúa el ARNt que porta la cadena polipeptídica en crecimiento. El sitio aminoacil o sitio A, donde se sitúa el ARNt que porta el siguiente aminoácido que se va a incorporar a la cadena. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.3. Traducción del ARNm. q Fases del proceso de traducción: 1. Iniciación El ribosoma se une a ARNm en AUG (codón de inicio). Acude ARNt con el anticodón complementario (UAC) y une Met à se forma el complejo de iniciación. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.3. Traducción del ARNm. q Fases del proceso de traducción: 2. Elongación. Se van incorporando más aminoacil-ARNt complementarios al sitio A según se va leyendo el ARNm. Enzima peptidil-transferasa libera el primer aminoácido del ARNt y une el dipéptido (enlace peptídico). El ribosoma se desplaza una posición en dirección 5’ à 3’ (translocación) y se libera el hueco para que llegue un nuevo ARNt. Se continua el proceso uniendo más aminoácidos en función de la extensión del gen. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.3. Traducción del ARNm. q Fases del proceso de traducción: 2. Elongación. 2.4 El flujo de la información genética. 2.4.3. Traducción del ARNm. q Fases del proceso de traducción: 3. Terminación. Cuando el sitio A del ribosoma llega al codón de terminación (UAA, UGA o UAG) en el ARNm, no existe anticodón complementario à se unen factores de liberación. Los factores reconocen las secuencias y la peptidil-transferasa rompe la unión entre el polipéptido y ARNt. La cadena de aminoácidos (polipéptido) se libera à proteína ya formada. Posteriormente también se liberan del ribosoma (por subunidades), ARNm y ARNt. 2.5 Enzimas empleadas en biología molecular. Técnicas de biología molecular donde se requieren enzimas: amplificación, degradación, corte, unión, marcaje, secuenciación, etc. Las enzimas tienen actividad catalizadora à llevan a cabo funciones de manera específica. En el laboratorio utilizamos enzimas aisladas de distintos organismos. 2.5 Enzimas empleadas en biología molecular. 2.5.1. Nucleasas. Nucleasas Enzimas que cortan y degradan los ácidos nucleicos mediante la hidrólisis del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos Tipos Según la Según el tipo Según el tipo Según el punto especificidad de á. nucleico cadena de corte del corte Nucleasas que Nucleasas que Endonucleasas atacan a atacan a Exonucleasas (cortan en (eliminan el nt Puntos de corte ARNasas ADNasas moléculas moléculas puntos Aleatoriamente concretos del extremo) intermedios) bicatenarias monocatenaria  2.5 Enzimas empleadas en biología molecular. 2.5.2. Endonucleasas de restricción. Reconocen secuencias concretas (dianas de restricción) de ADN y producen cortes en la doble cadena. En bacterias son una estrategia de defensa para degradar ADN ajeno (vírico). Existen distintos tipos y habitualmente se denominan con tres letras y un número romano à Inicial del género y dos de la especie de la bacteria de la que se ha obtenido. 2.5 Enzimas empleadas en biología molecular. 2.5.2. Endonucleasas de restricción. Tipos de corte q Tipos de endonucleasas de restricción. Tipo I: no útiles en Biología Molecular porque hacen cortes a distancias aleatorias respecto a la diana de restricción à fragmentos distintos cada vez. Tipo II: reconocen y cortan en puntos específicos generalmente dentro de la misma diana de restricción à generan patrones específicos y reproducibles de fragmentos, ya que siempre cortan por los mismos puntos. Requieren magnesio como cofactor, “tijeras moleculares”. Tipo III: reconocen dos secuencias invertidas dentro de la misma cadena y cortan fuera de la diana de restricción, pero a corta distancia (25-30pb). Requieren ATP y magnesio como cofactores. Los extremos cohesivos generan regiones Tipo IV: cortan ADN con marcas de metilación (etiqueta). cortas complementarias que permiten de nuevo la unión de los extremos. Importante Requieren GTP y magnesio divalente como cofactores. aplicación biotecnológica Tipo V: pueden cortar secciones de ADN de casi cualquier organismos y longitud à CRISPR-Cas. 2.5 Enzimas empleadas en biología molecular. 2.5.2. Endonucleasas de restricción. q Aplicaciones en biología molecular Ø Síntesis de moléculas de ADN recombinante: Se cortan dos moléculas distintas de ADN con la misma enzima de restricción. Cuando los fragmentos son cohesivos ambas moléculas se mezclan, se unirán por la complementariedad de bases. Las mellas que quedan en cada cadena se unen con una ligasa y se obtiene una molécula híbrida recombinante. Ø Patrones de restricción: Las enzimas de restricción tipo II generan cortes en lugares específicos en el ADN, dando lugar a fragmentos de distintos tamaños. Estos fragmentos se pueden separar mediante electroforesis generando un patrón, que puede identificarse y utilizarse como medio de identificación de muestras à ejemplos: estudios de paternidad, anomalías en diagnóstico prenatal, etc. 2.5 Enzimas empleadas en biología molecular. 2.5.3. ADN polimerasas. ADN polimerasa Permiten realizar copias de moléculas de ADN mediante replicación. De hecho, la ADN polimerasa es indispensable para la PCR La mayor parte de los procedimientos de laboratorio requieren una fase previa de amplificación à obtener un gran número de moléculas idénticas a partir de la muestra original. 2.5 Enzimas empleadas en biología molecular. 2.5.4. Retrotranscriptasas o transcriptasas inversas: Son ADN polimerasas-ARN dependientes, es decir sintetizan moléculas de ADN utilizando ARN como molde. Se ha aislado de los retrovirus cuyo material genético es ARN y es capaz de retrotranscribirse a ADN en la célula infectada e integrarse en el genoma de la célula huésped. Se puede utilizar para amplificar ARN (RT-PCR) 2.5 Enzimas empleadas en biología molecular. 2.5.5. Desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt): Es una ADN polimerasa que cataliza la incorporación de desoxinucleótidos al extremo 3´ de una molécula de ADN. No requiere de cebador ni de una cadena molde para ejercer su actividad. Se han aislado de células linfoides inmaduras y en ciertos linfomas y leucemias. Su principal utilidad es el marcaje terminal de sondas con nucleótidos marcados (fluorocromos). 2.5 Enzimas empleadas en biología molecular. 2.5.6. Ligasas Ligasa Enzima responsable de catalizar la formación de enlaces fosfodiéster entre los extremos 3’ de una molécula de ADN y 5’ de otra Junto con las enzimas de restricción suponen una importante herramienta biotecnológica 2.5 Enzimas empleadas en biología molecular. 2.5.7. Topoisomerasas Relajan la tensión de la doble hélice de ADN próxima a las burbujas de replicación o transcripción. Se utiliza para relajar estructuras superenrolladas de ADN, como paso previo a la aplicación de otras técnicas de biología molecular.