Tema 10 - Estrategias para la Identificación y Caracterización de Genes y Promotores PDF

Tema 10 1. Clonación de un gen mediante complementación funcional Para clonar un gen mediante complementación funcional, partimos de una genoteca de DNA silvestre. Nuestro objetivo es encontrar qué gen tiene afectado el mutante que hemos generado mediante compuestos mutagénicos como luz UV. Para el...

Tema 10 1. Clonación de un gen mediante complementación funcional Para clonar un gen mediante complementación funcional, partimos de una genoteca de DNA silvestre. Nuestro objetivo es encontrar qué gen tiene afectado el mutante que hemos generado mediante compuestos mutagénicos como luz UV. Para ello, transformamos el mutante con la genoteca silvestre y vemos si alguna colonia ha recuperado el fenotipo silvestre. De ser así, significaría que el mutante ha adquirido algún gen de la genoteca silvestre que le ha hecho revertir su mutación. Un ejemplo de esto es la clonación de un gen de la ruta de síntesis de la arginina de levadura. Para ello, se coge el DNA de la levadura y se hace una genoteca (se parte en fragmentos y se introduce cada fragmento en un vector, en uno de ellos estará el gen de síntesis de arginina pero no sabemos en cuál). Luego cogemos una levadura mutante que no puede sintetizar arginina y se transforma con los plásmidos. Entonces, una o dos colonias serán capaces de crecer en medio mínimo sin arginina, lo que significa que son capaces de sintetizarla porque han adquirido el gen de síntesis. Con esto, hemos identificado el gen y sabemos su utilidad. 2. Uso de un elemento genético móvil como mutágeno Podemos usar transposones para generar mutaciones. Nuestro transposón debe incluir las repeticiones invertidas típicas y el gen de la transposasa, que lo ayuda a introducirse en cualquier sitio del genoma. Además, debe tener un marcador para seguirle la pista. Tras mutagenizar una bacteria con el transposón Tn5, la sembraremos en medio con kanamicina para que solo crezcan las que hayan adquirido el transposón. Esta bacteria en específico, Myxococcus xanthus, cuando recibe luz azul se estresa y produce carotenos, que le dan un color rojizo. Si hay alguna bacteria que produce carotenos en oscuridad o que no los produce con luz azul, significaría que el transposón se ha insertado en algún gen regulador o de síntesis de los carotenos. Con este mecanismo podemos estudiar la ruta de síntesis de los carotenos y su mecanismo regulador. Para localizar el transposón en el genoma, pruebo con enzimas de restricción a ver si encuentro dos sitios de corte que estén antes y después del transposón, pero no muy lejanos. Si la enzima que he utilizado no sirve, pruebo con otra (existen estrategias para ver con qué enzima probar). Tras esto, someto a ligación el fragmento resultante, usando una baja concentración de DNA, lo que le permite hibridar consigo mismo y no con otros DNAs. Ahora amplifico por PCR usando dos cebadores (ver imagen) y tendré el DNA que me interesaba, el que ha sido interrumpido por el transposón. 3. Identificación de genes que participan en un mismo proceso Como ejemplo para explicar esto usaremos el sistema del doble híbrido en levadura, el cual sirve para la identificación de interacciones entre proteínas. Gal4 es un activador transcripcional de levadura con dos dominios independientes: BD (binding domain), dominio de unión a una secuencia específica de DNA (el promotor Gal); y AD (activation domain), dominio activador de la transcripción. Para ver si dos proteínas interaccionan entre sí crearemos dos proteínas de fusión, cada una de ellas unida a un dominio de Gal4. También usaremos un marcador de resistencia a antibiótico (para E.coli) en cada plásmido y otro marcador de auxotrofía (para la levadura). Si una levadura es resistente a cam y amp y es capaz de crecer en ausencia de trp y leu, habrá adquirido los dos plásmidos. Cuando se transcriben y traducen obtenemos, por un lado, el dominio de unión de Gal4 unido a la proteína cebo y por otro, el dominio de activación de Gal4 unido a la proteína presa. Si las proteínas cebo y presa interaccionan, los dos dominios de Gal4 se ponen en contacto de forma indirecta y se unirán al promotor Gal para iniciar la transcripción del gen chivato, que debe ser fácil de identificar. Entonces, si este gen se ha expresado significa que las dos proteínas de interés interaccionan entre sí "in vivo". Si obtenemos un resultado negativo no significa que no interaccionen, puede ser por ejemplo que dos proteínas humanas no interaccionen bien en levaduras porque falte algo. Si obtenemos un resultado positivo sí que significa que hay interacción. Se ha mejorado este sistema ayudándose del hecho de que en levaduras existen dos sexos distintos que se fusionan entre sí de forma exclusiva dando lugar a una levadura diploide. Para estudiar la interacción por esta vía, transformamos una cepa de tipo a con un plásmido cebo que da lugar a la proteína de fusión con el dominio de unión al DNA de Gal4 y con mi proteína de interés. Generamos así una estirpe de sexo a que lleva incorporado el plásmido cebo. Por otra parte, en levaduras del sexo α podemos introducir numerosas proteínas de fusión con el dominio de activación de Gal4. Podemos tener una única proteína (si queremos ver interacción entre 2 proteínas concretas) o cientos de levaduras α diferentes con plásmidos diferentes (generados a partir de una genoteca), en caso de que queramos ver qué proteínas interaccionan con la mía de interés. Las levaduras de tipo a y tipo α se juntarán solas y generarán un diploide. Aquel diploide en el que se exprese el gen chivato habrá generado dos proteínas de fusión que interaccionan entre sí, es decir, interaccionan mi proteína de interés y la proteína de la genoteca. El gen chivato en este caso es His3, para la producción de histidina, por lo que el mecanismo de selección consiste en sembrar en medio mínimo y emplear levaduras que sean auxótrofas para histidina (además de para triptófano y leucina). Así, nos aseguramos de que solo crezcan colonias en las que se han incorporado los dos plásmidos y en las que, además, se está produciendo la interacción. El problema de este sistema es que si las proteínas interaccionan en un lugar alejado del DNA como la membrana, el dominio de unión a DNA será arrastrado al DNA y la proteína, a la membrana y si gana el AD, el resultado sería negativo porque no habría interacción. Sin embargo, las proteínas realmente sí que interaccionarían pero en otro lugar. Existe otro método en el cual la interacción puede ocurrir en cualquier lugar de la célula, no solo cercano al DNA: el sistema del doble híbrido bacteriano. En este sistema, fusiono mis proteínas x e y a los diferentes dominios de la adenilato ciclasa y si interaccionan veremos generación de cAMP, el cual junto a la proteína CAP irá a un promotor dependiente de ellos y se codificará el gen chivato. 4. Selección de dedos de zinc (ZF) para la unión a un DNA diana Este sistema nos permite identificar qué dedos de Zinc se unen mejor a mi DNA. Para ello pongo en el plásmido chivato mi DNA diana cerca de un promotor débil (se transcribe muy poco), seguido de un gen chivato. En otro plásmido pongo el promotor lac seguido del gen que codifica la subunidad alfa de la RNA polimerasa fusionado a la secuencia de 3 ZF en tándem. Entonces, si los dedos de zinc se unen bien al DNA diana, la subunidad alfa arrastra a la polimerasa y convierte al promotor en uno más fuerte. Puedo usar una genoteca de ZF para ver cuáles se unen mejor. 5. Estudio de la actividad promotora de una secuencia de DNA Podemos crear sondas de promotores: vectores utilizados para el estudio de la actividad de promotores de la transcripción. Para ello, insertamos una secuencia promotora aguas arriba de un gen chivato (en el MCS). Luego, introducimos el plásmido en una célula y vemos si hay expresión o no del gen chivato. Si vemos expresión es que el promotor insertado está ejerciendo su función. Además, se incluye un sitio para integración genómica, mediante el cual el vector se va a integrar el genoma en un sitio concreto por recombinación homóloga. Entonces, cuando observemos un tejido, en las zonas azules hay actividad beta- galactosidasa, codificada por el gen lac z, lo que significa que en esos tejidos el promotor que he introducido está actuando. 6. Identificación de genes de interés por su modo de expresión Para este sistema usaremos micromatrices de DNA, que son colecciones de moléculas de DNA inmovilizadas sobre un soporte, en posiciones conocidas. Todas las moléculas son iguales en el mismo cuadradito, pero difieren entre cuadraditos. Van a representar todo el genoma del organismo, y vamos a hibridarla con mRNA que aislemos de distintos tejidos en distintas condiciones de cultivo para ver su patrón de expresión.  Entonces, cogemos el RNA total de una célula y lo marcamos con fluoróforos. También se puede retrotranscribir primero y luego marcarlo. Al hibridarse, la celdilla emite fluorescencia, la cual podemos detectar. Esto nos indica que hay RNA correspondiente a x secuencia. Si no hay fluorescencia es que ese RNA no se expresa en esa célula. Como fluoróforos empleamos cianinas (Cy3 y Cy5). Estas moléculas se unirán a un nucleótido y emitirán fluorescencia a diferente longitud de onda. Esto se consigue en la retrotranscripción, pues además de poner los oligonucleótidos normales incluimos dCTP marcado con esa cianina. 6.1. Micromatrices de DNA para el análisis de la expresión diferencial de genes Si queremos analizar la expresión bajo diferentes condiciones experimentales, podemos marcar con un tipo de fluorescencia diferente el RNA de cada condición experimental y ver cuál es la fluorescencia que se emite. Puede ser que únicamente veamos un tipo de fluorescencia, que no veamos ninguna, que veamos ambas porque los genes se expresen bajo las dos condiciones o que veamos una más que otra (habrá predominancia de un color) porque bajo una condición experimental el gen se exprese más que con la otra. Con este método, podemos estudiar la transcripción de una célula normal y compararla con una cancerosa, lo que nos permite ver qué genes se expresan en las células cancerosas y no en las sanas y viceversa. También podemos monitorizar cambios en la expresión génica a lo largo del tiempo o estudiar genes reguladores mediante el análisis del efecto de mutaciones. Por ejemplo, puedo generar un mutante que tenga una deleción en un factor de transcripción y analizar las diferencias de transcripción con una célula de genotipo silvestre. Sin embargo, los resultados de un experimento global deben validarse utilizando un experimento más específico como el Northern, en el que se extrae el RNA de interés del experimento global, se corre por un gel y le pondremos una sonda marcada para ver si hibrida o no. También podemos confirmar los resultados que nos proporciona la micromatriz mediante RT-PCR, RT-qPCR, dPCR o ddPCR. 7. 5’ RACE (Rapid amplification of cDNA ends) Esta técnica se usa para identificar el inicio de la transcripción de un gen. Para ello, partimos de una molécula de RNA, a la cual se le añade un cebador de DNA y se sintetiza el cDNA complementario con la retrotranscriptasa. Tras desnaturalizar la molécula, el cDNA quedará libre y tendrá un extremo 5’ conocido (el del cebador que hemos introducido) y un extremo 3’ desconocido, siendo este último el que corresponde a la zona de inicio de la transcripción. A dicho extremo le añadimos numerosas adeninas con una transferasa terminal. Entonces, usamos un cebador con la secuencia TTTT para que se una a AAAA y por medio de la polimerasa Taq copie el resto de la cadena de cDNA. Cuando secuencie y me encuentre con la secuencia TTTT que he puesto antes, sabré que justo al lado está el lugar de inicio de transcripción y lo habré identificado. 8. Análisis de secuencias de DNA promotoras, a las que se une un factor de transcripción determinado (regulón) Los factores de transcripción pueden actuar de forma directa sobre la transcripción de un gen x. Sin embargo, ese gen x puede estar implicado en la transcripción de otro gen z, por lo que el factor que regulaba la transcripción del gen x, también regula indirectamente la del gen z. Podemos identificar factores de transcripción que actúan de forma directa mediante la técnica de CHIP (chromatin immunoprecipitation). Para ello, fijaremos con formaldehido las proteínas (factores de transcripción) que se encuentran unidas al DNA. Tras ello, nos interesa tener el DNA en pequeños trozos unidos cada uno de ellos a una o pocas proteínas, por lo que extraemos la cromatina y la rompemos por sonicación. Añadiremos un anticuerpo contra el factor de transcripción que me interesa, o si no dispusiera de anticuerpo podría ponerle una etiqueta al factor y usar un anticuerpo para la etiqueta, pero para esto es necesario manipular las células. Posteriormente, centrifugo y las proteínas que se hayan unido al anticuerpo precipitarán. Para terminar, digiero las proteínas con proteasas y ya podré identificar qué secuencia de DNA se une a mi factor de transcripción. 9. Determinación de la unión de una proteína determinada a una secuencia de DNA determinada Estudiaremos dos técnicas diferentes: EMSA y footprinting. 9.1. Ensayo de cambio en la movilidad electroforética (EMSA) Se coge el DNA diana y se marca con radiactividad y se corre en un gel. Previo a esto puedo poner la proteína (que quiero ver si se une) en contacto con el DNA marcado y si se da la unión retrasará al DNA en el gel y veremos dos bandas (la del DNA unido y la del DNA libre). 9.2. Ensayo de protección contra DNasa (footprinting) Nos permite saber exactamente dónde se une el DNA. Hago lo mismo que en el EMSA, pero tratando con una endonucleasa inespecífica. Donde está la proteína la endonucleasa no corta porque le estorba (impedimento estérico) y así descubrimos donde se une ésta.