Técnicas Básicas de Genética del Desarrollo PDF

Técnicas básicas de genética del desarrollo Carolina Pardo Departamento de Biología Facultad de Ciencias Naturales Universidad del Rosario 1. Caracterización de expresión genética – – – Hibridación in situ (ISH) Secuenciación - Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-Seq) RNA-seq 2. Prueba de fun...

Técnicas básicas de genética del desarrollo Carolina Pardo Departamento de Biología Facultad de Ciencias Naturales Universidad del Rosario 1. Caracterización de expresión genética – – – Hibridación in situ (ISH) Secuenciación - Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-Seq) RNA-seq 2. Prueba de función génica – – Edición génica CRISPR/CAS9 Sistema Gal4-UAS 3. Visualización de núcleos 1. Caracterización de expresión genética – – – Hibridación in situ (ISH) Secuenciación - Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-Seq) RNA-seq 2. Prueba de función génica – – Edición génica CRISPR/CAS9 Sistema Gal4-UA 3. Visualización de núcleos – S 1. Caracterización de expresión genética – – – Hibridación in situ (ISH) • Observar el mensajero de uno o varios mRNA con (o fluorescencia). Secuenciación - Inmunoprecipitación de tinción cromatina (ChIP-Seq) • Visualizar espacialmente dónde y cuándo se expresa un gen, no cuánto. RNA-seq 2. Prueba de función génica – – Edición génica CRISPR/CAS9 Sistema Gal4-UAS Diseño de pruebas/sondas • Se hace sobre exones del gen de interés. Requiere conocer gen. Diseño de pruebas Digoxigenin RNA labelled complementario a hebra codificante = Antisentido = reportará expresión RNA labelled complementario a hebra no codificante= Sentido = control negativo Fijación de tejido/células Preserva tejidos y componentes en un ‘life-like state’ ya que detiene proceso de degradación en una célula muerta • No hay autólisis ni degradación por enzimas - detiene todas las reacciones bioquímicas • Aumenta permeabilidad de membrana • Para ácidos nucléicos – precipitación con alcoholes (metanol ppal/) y en frío • Se disecta/colecta tejido/células en estado del desarrollo deseado y se hacen lavados múltiples con metanol frío en hielo. Se preserva tejido en metanol a -80ºC. In situ per se • Día 1: • Hibridación de tejido fijado con la probe (S y AS) - múltiples lavados con solución de formaldehído y probe, en caliente (65ºC). • Puede tomar entre 24h y 70 dependiendo gen, tejido, etc. Antisense Sense Nota: la hibridación con AS y S se hace en tejidos/individuos diferentes (réplicas), nunca en el mismo. In situ per se • Día 2: • Lavados con buffers para retirar probe que no haya encontrado mRNA templado. • Agregar anticuerpo anti-DIG = no debe haber unión en control S porque probe se fue en los lavados. Antisense Sense Nota: la hibridación con AS y S se hace en tejidos/individuos diferentes (réplicas), nunca en el mismo. In situ per se • • • Probe que se pega a mRNA (por homología tiene Uracilo modificado). Ese Uracilo es reconocible por un anticuerpo Ese anticuerpo revela color con adición de sustrato Antisense Sense Nota: la hibridación con AS y S se hace en tejidos/individuos diferentes (réplicas), nunca en el mismo. In situ per se Múltiples células evaluadas al tiempo en un tejido/individuo informa el patrón espacial de expresión del gen. 1. Caracterización de expresión genética – RNAseq (secuenciación de RNA con next gen sequencing)-UAS Técnica para cuantificar el nivel de expresión de todos los transcritos en el transcriptoma. Se compara la expresión a nivel de genoma completo entre diferentes condiciones/tratamientos. Paso 1: • Colectar tejido en diferentes estados/tratamientos deseados en RNAlater; con réplicas por cada tratamiento. • Extracción RNA total de cada muestra. RNA isolation Paso 2: • Preparación de librerías • Secuenciación de librerías 1 archivo por cada muestra secuenciada Paso 3: • Análisis bioinformático Cada lectura se considera un conteo, entre más lecturas tenga un gen, más expresado está. Conteo por gen para cada tratamiento (considera todas las réplicas por tratamiento Comparación estadística Diferencia con qPCR? Programas: Cufflinks+Cuffdiff Gen Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Gen rojo 230000 1000 0 Gen azul 2000 0 0 Gen verde 0 670900 3400000 Gen amarillo 4000 2 0 Gen n XX XX XX Paquetes: Deseq EdgeR Single cell RNA-seq IsoSeq RNAseq (PACBIO) 1. Caracterización de expresión genética – Secuenciación - Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-Seq)Gal4-UAS Identificar proteínas (particularmente TF) están unidos a un segmento de ADN (por ejemplo un enhancer) 1. Crosslink DNA + proteins = formaldehído. 2. ‘Fragmentación’ (shear) DNA = sonicador buscando pedazos de 500 bp aprox. 3. Incubación de anticuerpo(s) de proteínas de interés con ADN ‘fragmentado’- necesario tener anticuerpo sintetizado para la proteína candidata que estoy buscando ($$$). 4. Precipitación de complejos ADN+proteína+anticuerpo = con beads que reconocen anticuerpo unido. 5. Degradación enzimática de proteína y anticuerpo acoplados a ADN precipitado. 6. Secuenciación de ADN restante = el que estaba unido a la proteína reconocida por el anticuerpo. 1. Caracterización de expresión genética ATACseq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput. sequencing) Identificar regiones de la cromatina que estén abiertas = accesibles = activas (transcritas, usadas, etc) en momentos/condiciones/estados específicos del desarrollo. • Trasposones se insertan preferencialmente en regiones libres de nucleosomas è cromatina abierta è transposasas cortan preferencialmente en estas regiones. • Componente clave en un experimento de ATAQ-seq è transposasa Tn5 è mutante para que sea hiperactiva y que tenga actividad ligasa. Cromatina cerrada Cromatina abierta 1. Preparación del gDNA en un estado/condición que se quiera evaluar (réplicas son necesarias) Transposasa Tn5 y adaptadores 2. Adición de Tn5 y adaptadores de PCR (para que primers puedan reconocer) 3. Tn5 genera cortes exclusivamente en regiones del ADN de cromatina accesible, y a éstos les agrega adaptadores de PCR. 4. Amplificación por PCR de estos fragmentos. Secuenciación por Illumina 5. Análisis bioinformático • Mapeo a genoma de referencia. • Número de lecturas de una región dada (en este caso no sólo son exones) es indicativo de su grado de accesibilidad = grado de actividad. • Puede determinarse si es una región codificante, un enhancer, un promotor, etc. 1. Caracterización de expresión genética – – – – Hibridación in situ (ISH) RNA-seq Secuenciación - Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-Seq) ATACseq 2. Prueba de función génica – – Edición génica CRISPR/CAS9 Sistema Gal4-UAS 3. Visualización de núcleos CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats • CRISPR procariotas cumplen una función en el sistema inmune. • Cada CRISPR es seguida de secuencias espaciadoras cortas de DNA foráneo (20 nt máx), producto de inserciones previas virales o de plásmidos. • Este ADN foráneo siempre está seguido de un PAM (protospacer adjacent motif) à 2 a 6 nt à siempre es 5’ NGG 3’ CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats • Al lado del complejo CRISPR hay pequeños clusters de secuencias CAS (CRISPR-associated system) que codifican para nucleasas o ribonucleasas. • Cuando se transcriben los CRISPR y sus espaciadores, las CAS saben que deben cortar cualquier DNA o RNA que entre que sea homólogo al RNA de los espaciadores y que esté seguido de un PAM. CRISPR – CAS9 Se inyecta la nucleasa Cas9 o mRNA que la codifica junto con un sgRNA (small guide RNA) en una célula. Cas9 usa ese RNA guía para encontrar la región del genoma homólogo a éste. La región genómica homóloga al sgRNA tendrá en su extremo una PAM (así se diseña) à Cas9 cortará. Célula activa mecanismo de reparación que es bastante ‘error prone’ • • Arregla mal à esa célula quedará mutante (knock out). Si en la mezcla de inyección se agrega un ADN guía (en un plásmido) à se activa reparación por homología à daño se repara usando el templado específico que se le da à inserta el cambio deseado (knock in). Paso 1: Diseño de sgRNA Existe software $$$$ que los diseña, lo tenemos en los Mac de sala 1 de informática. Requiere genoma de referencia disponible. Opción gratuita 1. En la secuencia FASTA del gen de interés buscar (en word por ejemplo) N(17) NGGNGG • • Último NGG funciona como PAM sequence – ‘firma viral’ – se busca en la secuencia pero NO se incluye en el sgRNA sintetizado NGG - opcional – en C. elegans reportaron mayor eficiencia de mutagénesis si lo incluyen (si van en la sgRNA) pero no se sabe por qué. Puede omitirse. 2. Idealmente diseño en primeros exones para que se trunque la proteína lo más pronto posible. 3. Diseñar 2 o 3 cercanos para inyectarlos juntos, y si funciona, por genotipificación se determina cuál tuvo la mayor eficiencia. Paso 1: Diseño de sgRNA 4. Verificar la existencia de estructuras secundarias en el sgRNA • Forma hairpin? • Forma dímeros en cualquiera de los extremos 5’ o 3’? Hairpin oligo analyzer Paso 1: Diseño de sgRNA 5. Verificar que sgRNA sólo tiene un hit en todo el genoma del organismo (no va a mutar múltiples blancos) – BLAST - se necesita el genoma completo de la especie de lo contrario el riesgo de efectos ‘off-target’- es muy alto. 6. Pedir la síntesis – es un primer normal, se pide a cualquier compañía de primers como IDT. Paso 2: Síntesis de sgRNA 1. PCR sin ADN – los primers se anillarán entre sí (PCR de dímeros) 2. Retrotranscripción del producto de PCR 3. Purificación y concentración del transcrito 4. Listo! (Obvio es de varios pasos/días en el lab) Paso 3: Hacer microagujas Paso 4: Inyectar 1. Colectar embriones (huevos) tan cercanos al momento de fertilización como sea posible 2. Inyectar con microinyector sgRNA+Cas9 1. Caracterización de expresión genética – – – – Hibridación in situ (ISH) RNA-seq Secuenciación - Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-Seq) ATACseq 2. Prueba de función génica – – Edición génica CRISPR/CAS9 Sistema Gal4-UAS 3. Visualización de núcleos Fijación de células (metanol frío – conservar a -80ºC) Incubación con DAPI (en oscuro) Se intercala en minor groove Observación en microscopio de fluorescencia DAPI puede atravesar la membrana celular de las células muertas con gran facilidad Se une con gran afinidad a adenina y timina Emisión a 455-461 nm para ADN, y 500 nm para RNA