Synthèse en Hematologie - PDF

D. Chapitre 4 : granulopoïèse - 3 types de granulocytes o Neutrophile, éosinophile, basophile - Polynucléaires (un seul noyau mais plusieurs lobes) - Progéniteur et précurseur dans la moelle - Passe dans les tissus - Fonctions o Lutte antibactérienne pa...

D. Chapitre 4 : granulopoïèse - 3 types de granulocytes o Neutrophile, éosinophile, basophile - Polynucléaires (un seul noyau mais plusieurs lobes) - Progéniteur et précurseur dans la moelle - Passe dans les tissus - Fonctions o Lutte antibactérienne par phagocytose o Hypersensibilité immédiate (allergie) o Lutte contre les parasites 1. Progéniteurs - Essentiellement intramédullaire (0,1% des cellules de la moelle) - Eosinophile et basophile ont un ancêtre commun o Stade précoce : CFU-GEMM → CFU-GM o Stade Tardif : CFU-G, CFU-M, CFU-éo/baso, CFU-éo, CFU-baso - Cytokine et facteur de croissance oriente la différenciation - Mise en évidence des progéniteurs : technique de culture in vitro - Marqueurs de surface : HLA-Dr+, CD34+, CD45+, CD117+, MP0- (myélopéroxydase) 2. Précurseurs - Présence de granulations (très reconnaissable) - Maturation du noyau : condensation de la chromatine et segmentation du noyau - Maturation du cytoplasme o Perte de la basophilie Bleu → Clair (diminution de la quantité d’ARN) - 2 premiers stades : myéloblaste et promyélocyte → pas de lignée - Sujet sain : 50-70% des cellules médullaires - Myélocyte, métamyélocyte, polynucléaire non segmenté, polynucléaire - Le métamyélocyte ne se divise pas, il se mature. 2.1. Myélocyte - Arrêt de la production des granulations primaire au profit des granulations secondaires spécifiques - Perte du nucléole - Le type de granulation détermine la lignée - La granulation donne une positivité à la phosphatase alcaline - Réduction du nombre de ribosomes → Cytoplasme acidiphilie légère 2.2. Métamyélocyte - Suite à trois divisions du myélocyte - La majeure partie des synthèses protéiques cesse - Va subir un à trois pincements pour donner naissance aux lobes nucléaire 31  Myéloblaste Promyélocyte Myélocyte Métamyélocyte Neutrophile + éosinophile + basophile → différence des grains Après 3 div du myélocyte NE SE DIVISE PLUS La majeure partie des synthèses protéiques cesse Taille Grande (10-25µm) + grand 15-20µm 10-18µm Ȼ médullaires 0,1-2% 0-5% 0-7% 7-25% Réniforme excentré Noyau Grand Excentré Pincement Centre de gravité dans le noyau Nucléoles 0-5 Oui Non Non Chromatine Fine (maille) Fine + condensée N/C élevé N/C diminue N/C diminue Cytoplasme N/C diminue Basophile (ARN → très actif) Basophile Perte basophilie (réduction du nbre de ribosomes) Primaire : 20% Primaires disparaissent progressivement Secondaires : 80% Primaires Apparition de secondaires (spécifiques) Granulations Rare Azurophiles N : grains Iaire plus claire + grains IIaires plus foncé E : orangé Surplombe le noyau E : orangé B : gros grain empêche vue du B : gros grain noir noyau MPO Enzymes lysosomiales : Phosphatase acide Contenu granulation Myélopéroxydase 5’ nucléotidase Glucuronidase Elastase 32  PNN non Polynucléaire PNN segmenté Polynucléaire basophile Mastocyte segmenté éosinophile Leucocytes du sang 0-5% 40-70% 0-5% 0-1% Rare Leucocytes médullaire 4-11% Taille 10-18µm 10-18µm 10-15µm 10-15µm 15-30µm Se condense Très condensée (clair/foncé) Très condensée Très condensée Chromatine (foncé/clair) 2 (band cells) 2-5 lobes (augmente avec 2 (parfois 3-4) Non visible Arrondi ou lobé Centre de l’âge) Noyau caché par les grains gravité à + Lobes l’extérieur du Corpuscule de Barr : noyau appendice nucléaire chez la femme (2e chrom X inactivé) Cytoplasme Rosé Rosé Bruns-rouges Brunes Gros grains orange Bleues, violets, noires Violet foncé Grains azurophiles (10-20%) Granulations Masque noyau Granulations Fins grains spécifiques (80- secondaires Plus petites 90%) éosinophiles Pont de chromatine rejoint les Ribosomes, RER, Noyau lobé Granules denses aux électrons lobes Golgi, mitochondries avec plus dev que dans Chromatine condensée - Scroll-like Hétérochromatine en PNN - Cristaux périphérie du noyau Particule de glycogène Petites vésicules (exosomes Euchromatine Granulation avec peroxydase proviennent de la structure Microscopie électronique enroulée) Granulations (surtout IIaire) Granulation avec histamine certaines MPO+ et certaines Granulations MPO- Corps ellipsoïdaux Autres granulations cliares avec noyau cristalloïde (aspect grain de café) 33 3. Granulopoïèse neutrophile - Faible durée de vie o Moins de 24h dans le sang o 1 à 3 jours dans les tissus - 50 milliards de PNN par jour - Production o Cytokines o Facteurs de croissance - Il existe des compartiments de stockage ou de réserve mobilisable en quelques minutes - Lutte antibactérienne par phagocytose puis bactéricidie 3.1. Le PNN : Microscopie électronique : - Pont de chromatine entre les lobes - Chromatine condensée en périphérie du noyau (hétérochromatine) - Chromatine ouverte (euchromatine) - Nombreuse granulations principalement secondaires (certaines MPO+ certaines MPO-) - Pauvre en ribosomes, réticulum endoplasmique et mitochondries et golgi - Nombreuses particules de glycogène - Contient de nombreuses protéines (actine, gelsoline, tubuline et tropomyosine) qui jouent un rôle dans les propriétés de chimiotaxie, phagocytose et exocytose. 3.2. Polynucléaires neutrophiles. (> 50 % des leucocytes du sang chez l’adulte) - Noyau complètement condensé - Plus de lobe → plus âgé - Anomalie o Entre 1 et 2 lobes → hypo segmentation o Plus que 5 lobes → hyper segmentation - Femme : corpuscule de Barr détachés → 2e chromosomes X inactivées 34 3.3. Les quatre types de granulations - Granulations primaires ou azurophiles (rouge) o Produit au stade du promyélocyte o 10-20% du total des granulations du PNN matures o Fonction antimicrobienne : lysosomes ▪ Hydrolases acide (coupe en présence d’eau) ▪ Protéines cationiques antimicrobiennes (défensine) pourvues d’activités enzymatiques semblables à celles de la chymotrypsine ▪ Myélopéroxydase (MPO), un hème protéique jouant un rôle dans la bactéricidie. Produit de l’hypochlorite ▪ Elastase, lysozyme, bacterial/permeability increase protein (BPI)… - Granulations secondaires ou spécifiques o Majoritaires aux stades myélocyte, métamyélocyte et PNN o 80% des granulations dans les PNN matures o Action antibactérienne, module l’inflammation, chimiotaxie ; migration ▪ Lysozyme qui lyse la paroi bactérienne (protéine cationique présente aussi chez les monocytes et macrophages) ▪ Apo lactoferrine Similitude fonctionnelle avec la transferrine Affinité pour le fer est plus forte ▪ Collagénase : casse le collagène pour permettre aux ȼ de mieux migrer ▪ Activateur du plasminogène, vitamine B12-Binding protein - Granulations tertiaires o Stade : métamyélocyte o On ne les voit pas en microscopie optique o Aide à la migration tissulaire ▪ Gélatinase - Vésicules sécrétoires o Stade : métamyélocyte et polynucléaire mature o Pas vraiment des granulations mais des vésicules o Non visibles au microscope optique o Formées par endocytose ▪ Albumine ▪ Phosphatase alcaline ▪ Récepteurs à des facteurs chémottractants ▪ Récepteurs pour le complément CR1 (ou CD35) et CR3 (CD11b) 3.4. Les antigènes membranaires - CD34 et CD117 : marqueur de ȼ immatures - CD33 : précurseur myéloïde - CD16 : récepteur parti Fc des Ig - MPO : marqueur de la lignée neutrophile - Appariation et disparition → Détermination du stade 35 3.5. Aspects cinétiques - Un myéloblaste donne naissance à 16-32 PNN sanguins en 7 jours - Une CFU-GM produit des PNN sanguins en 10-14 jours - Les facteurs contrôlant le relargage des PNN dans le sang sont : o Le diamètre des pores des sinusoïdes médullaires o La maturité des cellules o Certains facteurs humoraux 36  - Diverse cytokine influence le passage : o TNF-a o TNF-b o G-CSF o GM-CSF o IL-8 o C5a - Dans les tissus ils meurent après exercé leur fonction soit par dégérescence cytoplasmique ou apoptose (qui peut être retardé en cas de grossesse, excès d’œstrogènes et progestérone, glucocorticoïdes, milieu hypoxique) 3.6. Régulation de la granulopoïèse - Lente mais profond sur la production : o Stimulation de la prolifération et de l’engagement des progéniteurs de la lignée granulocytaire ▪ GM-CSF ▪ G-CSF ▪ Cytokines du microenvironnement - Rapide mais évanescent : o Stimulation du recrutement des neutrophiles matures du pool de stockage médullaire ▪ Endotoxine bactérienne ▪ G-CSF, GM-CSF, TNF alpha et bêta, Il-8 ▪ Facteurs humoraux : LIF, NIA ▪ Composant C3 du complément o Stimulation de la fonction neutrophile (rend plus efficace) ▪ Activation des mécanismes de phagocytose/bactéricidie par diverse cytokine ▪ Stimulés par les lipopolysaccharides les neutrophiles peuvent produire diverse cytokine : IL-1 TNF-a o Inhibiteurs ▪ Lactoferrine se lie sur des récepteurs des macrophages et induit une diminution de production de certaines cytokines comme GM-CSF ▪ La transferrine inhibe la production de GM-CSF par les lymphocytes T 3.7. Fonction des polynucléaires neutrophiles - Destruction des micro-organismes o Adhérence o Chimiotactisme o Phagocytose o Dégranulation o Explosion respiratoire o Killing o Digestion des germes tués 37 I. Adhésion - Environ 50% adhèrent +/- fortement à l’endothélium vasculaire 1- Rolling o Liaison faible qui résulte de l’action de cytokines inflammatoires sur les cellules endothéliales o Ces sélectines interagissent sur des molécules présentent sur les PNN 2- Adhésion plus forte (intégrine) o Adhésion augmentée par des intégrines de la membrane des PNN o Liaison à des récepteurs spécifiques o Les PNN sont marginés o En présence de chimioattactants, augmentation de l’expression d’intégrines 3- Diapédèse : passe à travers les espaces entre les vaisseaux o Changement de forme o Migre par chimiotactisme à travers la paroi vasculaire dans les tissus II. Chimiotactisme - Correspond à un mouvement de la cellule selon un gradient de concentration d’un médiateur chimio-attractant - Molécules produites par les pathogènes/acteur immunitaire - Nécessite une cascade de transduction impliquant des protéines G, phospholipase C, PIP2, diacylglycérol et IP3 - Les granulocytes non stimulés par un agent chimiotactiques émettent des pseudopodes dans toutes les directions o Le noyau se place vers l’arrière tandis que le centriole se place entre le noyau et les pseudopodes (qui sont dans le sens du déplacement) a. Aspect moléculaire - Récepteur couplé à une protéine G - Activation de la sous unité α o Sous unité αβγ → α - Phospholipase C o Hydrolyse de PIP 2 en PIP 3 - Augmentation de la concentration cytoplasmique de calcium - Activation de la PKC III. Phagocytose 1- L’opsonisation o Immunoglobulines (opsonines thermostables) ▪ Fragment Fc de l’anticorps peut être reconnu par les récepteurs anti-Fc présents sur le PNN ▪ Essentiellement des IgG et IgG3 ▪ Les IgM n’ont guère d’activité d’opsonisante directe o Des composants du complément (opsonines thermolabiles) ▪ C3 se fixe sur des récepteurs au C3b et le C3bi (CR1 et CR3) présents sur le PNN. 2- L’ingestion ou endocytose o Facteurs importants : ▪ Taux des cations bivalents (Ca2+ et Mg2+) ▪ La température Phagocytose optimale à la température physiologique ▪ Le pH 38  ▪ La pression osmotique : L’hyperosmolarité inhibe la phagocytose 3- La dégranulation intracellulaire o Granulations (lysosome I) ▪ Gr azurophile : 1-3mins ▪ Gr spécifiques : 30s o Fusionne avec celle du phagosome o Phagolysosome = lysosome secondaire o pH acide : inhibe la croissance bactérienne o Lyse des bactéries : lysozyme, lactoferrine, défensines, protéines cationiques. 4- L’explosion respiratoire o Augmentation de la consommation en oxygène o NADPH oxydase ▪ 2 O2 + NADPH ⟶ NADP+ + H+ + 2 O2– o Superoxide-dismutase (SOD) ▪ 2 O2– + 2 H+ ⟶ O2 + H2O2 o Myélopéroxydase (MPO) ▪ H2O2 + Cl– + H+ ⟶ H2O + HClO NaClO = eau de javel 5- Le Killing ou bactéricidie o O2 dépendant, MPO indépendant ▪ OH-, singulet 1O2 : oxyder de nombreux composants bactériens Ȼ reconnait la bactérie o O2 dépendant, MPO dépendant ▪ H2O2 + X- ➔ OX- + H2O (X= halide ou le plus important physiologiquement es le Cl-) ▪ Hypochlorite : oxydation amines/amides, chloramines, décarboxylation AA, halogénation radicaux tyrosine ; Formation de singulet 1O2 o O2 indépendant : ▪ Acidité dans le phagolysozome (toxique + activation enzymatique) ▪ Lysozyme scinde les liaisons β-1-4 glycosidiques (paroi bactérienne) ▪ Protéines cationiques (défensines) : BPI jouerait un rôle dans le killing de bactéries Gram- ▪ Lactoferrine anti-bactérienne : privation du fer Potentialise l’action du lysozyme 39  ▪ Hydrolases acides, protéases neutres, la phosphatase alcaline, transcobalamines jouent un rôle secondaire dans la bactéricidie 3.8. Exploration de la granulopoïèse - Hémogramme : 1500-7000/µl o Machine compte les ȼ o Frottis coloré au MGG : ▪ Morphologie des PNN - Myélogramme : Exploration morphologique des étapes de la granulopoïèse médullaire - Biopsie de moelle osseuse permet d’obtenir une « carotte » (conservation de la structure) - Culture de progéniteur in vitro - Cytométrie en flux 3.9. Exploration des polynucléaires neutrophiles - Hémogramme, frottis sanguin, ponction de moelle, biopsie médullaire I. Valeurs normales - Nouveau-né = 600-2600/µL - 1-6 Ans = 1500-8500/µL - Adulte = 1500-700/µL (homme et femme) - Neutropénie si < 1500/µL - Agranulocytose si < 500/µL - Polynucléose neutrophile si > 7500/µL II. Test de la MPO - Cytochimie ou cyrtométrie - Caractère myéloïde - Utile classification des leucémies III. Morphologie - Hyposegmentation ou hypersegmentation - Vacuolisation - Hypogranulation cytoplasmique - Précurseurs (moelle) IV. Cyrtométrie en flux - Récepteurs de surface (CD33, CD13, CD10, …) - Des intégrines 40 V. Méthodes d'évaluation du chimiotactisme VI. Méthodes d'évaluation de la phagocytose 4. Éosinopoïèse - GM-CSF, IL-3, IL-5 (> t CD4 et CD8) - CFU-GEMM → CFU-éo/baso - Acquisition du CD125 (IL-5R) - CFU-EO : o CD34+ o IL-5R+ o CCR3+ - IL-5 : Voie o JAK2 – STAT1 o RAS – MAP kinases - Chémokine : o Eotaxine o Rantes - FT : o GATA1 o PU1 o C/EBP - La durée différenciation (progéniteur → éosinophile mature) : o 3 à 5J 41  - Importante granulation intracytoplasmique de couleur orangée - Présent en faible quantité dans le sang 5% - Effectrices de divers types de manifestations inflammatoires allergiques et non allergiques 4.1. Cinétique dans la moelle osseuse : - Compartiment médullaire (300 à 400) o Temps de transite : 9 jours ▪ Compartiment progéniteur ▪ Compartiment mitotique 2.5 Jours dans le compartiment post-mitotique ▪ Compartiment de maturation ▪ Compartiment de stockage - Compartiment sanguin (100 à 300) - Compartiment tissulaire o Peuvent repasser dans le sang - PNE peuvent s’accumuler dans les organes possédant une surface exposée à l’environnement o Ils y survivent plus longtemps que les PNN 4.2. Le PN éosinophile : Microscope électronique : - Noyau ne comporte que deux lobes - Chromatine condensée - Ribosomes, RER, Golgi, Mitochondries plus développés que PNN - Granulations éosinophiles : o Corps ellipsoïdaux avec noyau cristalloïde 4.3. Compartiment de PN éosinophile : - 100-400/µL (variation au cours de la journée jusqu’à 40%) I. Moelle 9 jours (300-400): - Précurseurs : o CSH o CFU-éo/baso, CFU éo - Proliferation (mitotique): 42  o Myéloblaste o Promyélocytes o Myélocytes - Stockage (maturation): o Métamyélocyte o “Band Cell” o PN eosinophile II. Sang 18h (1) diapédèse: - Circulant (90%): o PNE normodense ▪ Richesse normale en granulations - Circulant (10%): o PNE hypodenses o Leur nombre augmente aussi bien en cas d’hyperéosinophilie que tumorale o Ce sont des PNE plus « activés » (toxicité plus élevée envers les parasites) ▪ Vacuolisé ▪ Riche en globule lipidique ▪ Granulations plus petites ▪ Plus récepteurs Ig IL2 ▪ Toxicité contre les vers o Se collent à la paroi des vaisseaux (margination) puis migrent dans les tissus III. Tissus 2 semaines (100-300) Rantes, éotaxine, molecules d’adhésion : - PNE tissulaire exposé à l’environnement : o Tube digestif o Peau o Poumons o Voies urinaires o Utérus - Peuvent s’accumuler et rester quiescent ou s’activer en libérant des médiateurs 4.4. Granulations éosinophiles : I. Contenu majoritaire : - Pas de lysozyme - Teneur en peroxydase, en β-glucuronidase et en phosphatase acide est de 2 à 3 fois plus élevée que dans les polynucléaires neutrophiles (catalyse principalement l’oxydation du Br- en BrO-) - Contient dans les granulations spécifiques une Arylsulfatase B 10 à 20 fois plus active que celle présente dans les polynucléaires neutrophiles - Les polynucléaires éosinophiles sont l'une des rares sources de phospholipase D - Les polynucléaires éosinophiles contiennent 8 fois plus de lysophospholipase que les polynucléaires neutrophiles - 50% : Major basic protein (MBP) o Synthétisé précocement dans la lignée o Localisée dans le cristalloïde o Pas d’action enzymatique o Effet toxique en provoquant la perméabilisation des membranes cellulaires 43  - 25% : Eosinoperoxydase (EoPO) o 25% du contenu des granulations o Catalyse l’oxydation des halogènes en ROS toxiques pour les microorganismes - Histaminase - Eosinophil cationic protein (ECP) et Eosinophil derived neurotoxin (EDN) - Effet toxique sur les parasites et virus - 25 cytokines : o IL4 o IL6 o IL10 o GM-CSF o IL8 o TGF α o Rantes - Collagénase o Effet lytique sur la matrice extracellulaire pour la migration II. Granulations minoritaires : o Protéine de Charcot-Leyden (Gal-10) III. Des globules lipidiques : o Acide arachidonique o Enzymes du métabolisme des leucotriènes IV. Différences par rapport au PNN : - Pas de lysozyme - EoPO donne des hypobromites BrO- - Arylsulfatase B 100 à 20 fois plus active - 8 Fois plus de lysophospholipase - 2 à 3 fois plus de : o Peroxydase o Β-glucuronidase o Phosphatase acide 4.5. Les molécules de surface : - Récepteur pour le Fc des Ig G (CD 32) - Récepteur pour les Ig A (CD89) - Récepteur pour certaines fractions du complément - Récepteur pour les cytokines de la croissance éosinophiles o IL-3R o IL-5R o GM-CSFR - Récepteur pour d’autres cytokines : o IFN- a o TNF-a - Récepteur pour des molécules d’adhésion - Récepteur pour des o Prostaglandines o PAF 44  o Molécules Toll-like 4.6. Activation des éosinophiles : - Récepteur Fc des IgG et IgA - Récepteur pour diverses cytokines →Dégranulations : libération de médiateurs pro-inflammatoires I. 4 Mécanismes : - L’exocytose classique : o Fusion des membranes puis le contenu de la granulation se vide à l’extérieur - L’exocytose composée : o Fusion des granulations dans le cytoplasme puis fusion membrane plasmique et se vide à l’extérieur - La dégranulation progressive (fragmentaire) : o Nombreuses petites vésicules sécrétoires apparaissent dans le cytoplasme provenant des granules éosinophiles qui disparaissent progressivement puis se vident dans le milieu extérieur - La nécrose par cytolyse (désintégration de paroi) 4.7. Fonction : I. Contrôle des réactions d’hypersensibilité immédiate : - Les PNE se localisent à l’endroit où les mastocytes se dégranulent sous l’influencent des IgE en inactivant les mastocytes - Recrutement des éosinophiles (chimiotactisme produite par les mastocytes) : o ECF-A o PGD2 o LCF o Histamine o Complément - Les lymphocytes activés peuvent élaborer des facteurs préférentiellement chimiotactiques pour les PNE - Les PNE une fois sur le site de réaction sont capables d’inactiver les basophiles/mastocytes o Dégranulation des PNE : ▪ EDI → cAMP → Baisse de la dégranulation ▪ Phagocytose ces granules ▪ MBP → Inactive l’héparine ▪ Histaminase → Dégrade l’histamine ▪ Arylsulfatase B → inactive le SRS-A ▪ Phospholipase D → inactive le PAF ▪ Lysophospholipase → Détruit les LPL II. Destruction des formes larvaires des helminthes : - Larve + C3b et IgE 45  - Eosinophile : o Récepteur C3 o Récepteur Fc Ig - Dégranulation des éosinophiles : o BrO- ou de l’H2O2 ou d’une halogénation de la membrane o MBP : ▪ Ligand qui renforce la liaison du PNE au parasite ▪ Rôle toxique pour le parasite o ECP : ▪ Toxique pour le parasite - Mécanismes oxydatifs incluant la participation o BrO- o H2O2 o Halogénation de la membrane par l’action conjointe de H2O2 et peroxydase des polynucléaire éosinophiles - Pour que l’action anti-parasite puisse avoir lieu, les PNE doivent être au voisinage du parasite o Cette localisation met en jeu les réactions d’hypersensibilité immédiate (Mastocytes et IgE) o Subaiguë (activation du complément) o Retardée (activation des lymphocytes T) 5. Basophiles et mastocytes : - Localisés principalement dans le sang - Faible quantité (