Steop II WS 22/23 Zusammenfassung Genetik PDF

STEOP II STEOP II WS 22/23 Zusammenfa ssung Genetik STEOP II WS 22/23 ZUSAMMENFASSUNG GENTIK Häufiger: mehrere Genotypen spielen zusammen, um einen Phänotypen Genetik ist die Lehre der Vererbung &...

STEOP II STEOP II WS 22/23 Zusammenfa ssung Genetik STEOP II WS 22/23 ZUSAMMENFASSUNG GENTIK Häufiger: mehrere Genotypen spielen zusammen, um einen Phänotypen Genetik ist die Lehre der Vererbung & auszuprägen beschäftigt sich damit, wie Eigenschaften über Generationen vererbt werden Moderne Probleme & Anwendungen Sub-Disziplinen der Genetik Humangenetische Diagnostik: Klassische Genetik: o Erkennen & Nachweisen von o Wie werden Merkmale Erbkrankheiten vererbt, woraus bestehen o Entwicklung von Gene Nachweisverfahren o Wie entstehen Phänotypen o Erfassen genetischer o Wie beeinflussen sich Risikofaktoren (z.B.: BRCA 1 & Merkmale 2 weißen häufiges Auftreten Molekular Genetik: von Brustkrebs nach) o Expression von Genen o Genetische Beratung bei o Welche Gene kodieren welche familiärer genetischer Proteine Belastung o Genetische Phänologie Genomanalyse: Populationsgenetik: o Sequenzanalyse o Wie verteilen sich Gene & o Funktionelle Annotation von Varianten in einer Population Genen o Vor- & Nachteile von Genen in o Vorhersage der einer Population Genregulierung o Wahrscheinlichkeit o (Mittlerweile sehr bestimmter kostengünstig) Genkombinationen o (Forensische & Ökologische Quantitative Genetik: Verwendung) o Erfassung nicht qualitativer GWAS (Genome-wide association Merkmale studies): o Gene für quantitative o Erfassen Polygener Erbgänge Merkmale & das Wechselspiel allelischer o Gegenseitige Beeinflussung Varianten bestimmter Allelvarianten o Erkennen von Risikofaktoren o Welche Genvarianten & deren genetischer Erbkrankheiten Kombinationen treten gehäuft o (keine Beweisführung für auf „schuld“ an Phänotypen) o Selektionsvorteil des Weitere Anwendungen: Individuums o Cancer Genetics Entwicklungsgenetik: o Genetics of Behavior o Wie steuern Gene die o Genetics of ageing Entwicklung o Quantitative Genetics: o Welche Gene sind für die ▪ Genetik nicht- Entwicklung von Organen, diskreter Merkmale Symmetrien & Segmenten ▪ (Wichtig für verantwortlich Landwirtschaft Es gibt Genotypen, die ganz klar einen Phänotypen bestimmen. Modellorganismen waren 20 Aminosäuren bekannt. DNA hat Anforderungen an Modellorganismen: jedoch nur 4 Basen. Daher wurde vermutet, dass Proteine mehr Information speichern Leichte Aufzucht im Labor können. Große Nachkommenschaft Gute Unterscheidbarkeit Experiment von Griffith (1928) Kleines Genom Isolierte 2 Stämme von Streptococcus Mutierbarkeit pneumoniae (Relevanz für menschlichen Bedarf) S-Stamm: Was ist ein Gen? bildet glatte (Smooth) Kolonien Verschiedene Definitionen können in R Stämme mutieren und wieder reversieren Basiseinheit der genetischen ist virulent und führt zur Infektion Information trägt eine Polysaccharidkapsel, welche Die physische und funktionelle Einheit die Virulenz verursachen der Vererbung Ein Gen ist für die Ausprägung eines R-Stämme: physischen Merkmales verantwortlich Ein DNA-Abschnitt, welcher für die bildet raue (Rough)Kolonien Bildung einer RNA verantwortlich ist keine Schleimkapsel ist nicht pathogen Woraus bestehen Gene? Verschiedene Arten von Information muss stabil gespeichert Polysaccharidhüllen führen zu werden verschiedenen S-Hüllen: IS, IIS, IIIS Information muss genau replizierbar Mutiert ein IIS-Stamm in einen RII- sein, sodass nachkommende Zellen Stamm, so kann dieser NUR wieder zu die gleiche Information wie deren einem IIS-Stamm reversieren, nicht Eltern haben aber zu IS oder IIIS Die Information muss veränderbar Experiment an Ratten: sein Schritt: Injektion von lebenden S Isolation von DNA Bakterien führt zum Tod, bei R Sie wurde erstmals von Friedrich Miescher im Bakterien nicht Jahre 1869 isoliert. Dieser beschrieb die →Oberflächenproteine sind also sehr Substanz aus dem Zellkern als Nuklein, wichtig für Pathogenität welcher Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff 2. Schritt: hat S Stamm aufgekocht und Phosphor enthielt. und wurde dadurch nicht mehr Phosphor kommt in Aminosäuren nicht vor, virulent daher wusste man das es sich bei der Substanz 3. Schritt: mischen von lebenden IIR- nicht um Proteine handeln kann. Stämmen mit hitzeinaktivierten IIIS- Stämmen →IIR-Stamm wurde DNA oder Protein? pathogen (genetisches Material wurde Theodor Boveri zeigte, dass alle von den toten IIIS auf die lebenden IIR Chromosomen des Seeigels für dessen Bakterien übertragen) Entwicklung notwendig waren. Da →Erbinformation ist Hitzestabil Chromosomen aus DNA und Proteinen Griffith hielt dieses genetische Material für bestehen, war nicht klar was für die Proteine, führte aber Begriff der Vererbung verantwortlich war. Um 1900 Transformation ein Avery, McLeod und McCarty 1944 Test der Hypothese: S-Stämme wurden lysiert und verschiedene Phagen werden in Bakterien, Bestandteile enzymatisch zerstört. Nach welche in Medien mit radioaktiven Verdau mit DNAsen war keine Transformation mehr möglich. Sie zeigten somit, dass die DNA Protein- bzw. Nukleinsäure für das Phänomen der Transformation Bestandteilen gezogen werden, verantwortlich ist vermehrt. So entstehen Phagen deren Nukleinsäuren (32P) oder The Hershey and Chase Experiment Aminosäuren (35S) markiert sind. 1953 Die radioaktiv markierten Phagen Verwenden den T2 Bakteriophagen, um werden für die Infektion neuer Bakterien zu infizieren. Bakteriophagen sind Bakterien und die Erzeugung neuer Viren der Bakterien. Viren leben nicht, und Phagen verwendet. Nur die 32P- sind bei der Vermehrung auf Wirtszellen markierten Phagen hinterlassen angewiesen. Viren sind Vehikel für genetische Spuren in den Bakterien und Information. führen zur Produktion neuer Phagen, welche wiederum radioaktiv sind Bestandteile des genetischen Materials: DNA & RNA Manche Viren besitzen RNA als genetisches Material Vermutlich ist RNA das ursprüngliche genetische Material. RNA kann komplexe Faltungen eingehen und so enzymatische Aktivität erlangen 1. Anheftung an die Wirtszelle & Viele “alte” Prozesse sind jedoch Injektion der Phagen DNA heute noch durch RNA reguliert bzw. 2. Bakterium vermehrt die Phagen katalysiert → Dies führte zur DNA Postulierung der RNA-Welt Hypothese 3. Vermehrung der Phagen DNA RNA Chromosomen Bestehen aus Pentose (C5 Zucker), Basen & 4. Virale Hüllen werden aufgebaut Bestandteile genetischen Materials 5. Viren werden zusammengesetzt Haben ein 5‘ (Phosphat) & 3‘ (OH) Ende 6. Bakterium lysiert → Phage wurde Die Polymere sind über Phosphordiesterbrücken verbunden vermehrt Desoxyribose Ribose Hypothese: Thymin Uracil Zusätzliches 2’OH Das genetische Material ist DANN stabil Instabil Möglicher Test: Wird DNA oder Protein von einer Generation auf die nächste weitergegeben Die Basen von DNA & RNA Watson & Crick postulierten: Die DNA besteht aus zwei Polynukleotidketten welche sich rechtsdrehend umeinanderwinden Die zwei Polynukleotidketten verlaufen antiparallel Das Zucker-Phosphat Rückgrat befindet sich auf der Außenseite der Helix, während die Basen in deren Inneren übereinander gestapelt liegen. Die Basen der zwei Ketten sind durch Purine: aromatische Doppelringe schwache Wasserstoffbrücken Adenin: an C6 Aminogruppe miteinander verbunden. A-T Guanin: an C6 Ketogruppe, an C2 Aminogruppe Basenpaare und G-C Basenpaare Pyrimidine: einfacher aromatischer Ring passen in die Dimension der Cytosin: an C4 Aminogruppe Doppelhelix. Dies führt zur Uracil: an C4 Ketogruppe Komplementarität der zwei Helices Thymin: an C4 Ketogruppe Einzelne Basenpaare in der Helix sind Diese Seitengruppen sind wichtig, um 0,34 nm voneinander entfernt. Eine Wasserstoffbrückenbindungen eingehen zu Drehung der Helix nimmt 10bp oder können 3,4 nm ein. Die Helix ist 2nm im Nukleotide bestehen aus Base, Zucker, und Durchmesser. Phosphorsäurerest Das Rückgrat der DNA wird durch eine Phospho-desoxy-Ribose Kette Nukloside bestehen aus Base und Zucker aufgebaut, welche die Helix asymmetrisch umwinden. Dies führt DNA (und RNA) sind Polymere, welche zur Bildung der Minor und Major über Phosphordiesterbrücken Groove (Große und kleine Furche). verbunden sind. Jede DNA und RNA hat ein 5’ Die Struktur der DNA (Phosphat) und ein 3’ (OH) Ende. DNA bildet eine rechts-drehende B- RNA hat ein zusätzliches 2’ OH (two- Form Helix aus prime-hydroxyl) Phosphodiester Rückgrat umschließt minor groove, die Basen sind der Die Struktur der DNA: Die major groove zugewandt Doppelhelix A-T Basenpaare: zwei James Watson & Francis Crick entdeckten die Wasserstoffbrücken Struktur der DNA im Jahr 1953 G-C Basenpaare: drei Bereits zu diesem Zeitpunkt war die „Chargaff Wasserstoffbrücken Regel“ bekannt, welche besagt das es In etwa Wasserstoffbrücken sind eine gleich viele Adenosine wie Thymidine, bzw. schwache Bindung → denaturieren Guanosine wie Cytosine. bei Erhitzung Wasserstoffbrücken bilden sich durch Rosalind Franklin und Maurice Wilkins: die Seitengruppen der Basen Röntgenstrukturanalyse zeigte die Helizität, Abstand der Basen,... der DNA mit einer Regularität von 0,34 und 3,4 nm (10-9m) Verpackung von DANN Bakterielle Chromosomen sind in DNA ist ein langes, lineares Molekül (beim loops organisiert → es ist nicht klar Menschen etwa 2m lang), in der Zelle ist es welche Proteine an deren Basis sitzen enger gepackt Loops sind negativ supercoiled Menschliche DNA ca. 10.000 loops Viren Prokaryoten DNA oder RNA Zirkuläre Der C-Wert chromosomale DNA Bezeichnet haploiden, nicht replizierten DANN Linear oder & Gehalt einer Zelle in pg oder bp. (bp = zirkulär extrachromosomale Basenpaare) zirkuläre DNA- Der C-Wert verschiedener Organismen kann Plasmide enorme Unterschiede aufweisen. Manchmal auch lineare Eukaryotische Chromosomen Chromosomen Meist Diploid (besitzen jeweils 2 – Eukaryoten Organellen nahezu-idente Chromosomen 1x Lineare, Zirkuläre DNA- väterlich, 1x mütterlich) → diploide DNA- Genome (z.B.: in menschliche diploide Karyotyp (46 Chromosomen Mitochondrien) Chromosomen. 23 von der Eizelle und 23 durch das Spermium) Im Zellkern: Im Zellkern ist DNA als Chromatin DNA als organisiert. Chromatin, Chromos=Farbe, Chromatin=färben darin Histone DNA des menschlichen Genoms ist ca. In Bakterien & Archea kann die 2m lang, passt jedoch in einen 10 µm chromosomale DNA eng als Nukleoid gepackt Großen Zellkern sein DNA komplexiert mit Histonen (ist um Ein E. coli “Chromosom” ist ca. 1.100µm lang Histone gewickelt) und ergibt so die (1.1 mm, oder 1.000mal länger als das 10 nm fiber Bakterium) Histone sind Oktamere bestehend aus je 2x H2a, H2b, H3, H4 Supercoiling DNA ist 2x um das Histon Oktamer Stärkere gepackt durch verzwirbelung. (146bp) gewunden Durch Einzelstrangbruch (nick) Das Linker Histon H1, ermöglicht entsteht ein open circle höhere Kompaktierung. Dies führt zur Kann positiv (mehrere Windungen) Bildung der 30 nm fiber. oder negativ (weniger Windungen) Die 30 nm Struktur wird durch ein haben Solenoid ausgebildet Wird durch Topoisomerase In der Zelle ist DNA vermutlich in herbeigeführt, sie spaltet die DNA, Schleifen organisiert. In der windet & verknüpft diese neu (sind für Metaphase sind diese Schleifen am die Packung essenziell) Chromosomen Scaffold angeheftet. Topoisomerase Typ 1: DNA-Kompaktierung (Eukaryoten): o schneidet einen Strang und o Doppelhelix gewunden um führt den zweiten Strang der Histone Helix durch den geschnittenen o Histone kompaktiert (speziell Strang durch Histon H1)  o weiter kompaktiert durch Konservatives Modell loops o loops werden zu weiteren loops kompaktiert o Chromosom DNA-Kondensation im Zellzyklus Während des Zellzyklus ist die DNA unterschiedlich stark kondensiert. In der Mitose ist die gesamte DNA stark kondensiert. Euchromatin (beinhaltet Gene): in der Dispersives Modell Interphase kondensiert Heterochromatin (nicht kodierende Gene): durchgehend kondensiert Zentromere Zentromere sind die Punkte des Spindelansatzes Kodieren nicht für Gene In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist diese Sequenz sehr kurz und zwischen den einzelnen Das Meselson und Stahl Experiment 1958 Chromosomen hoch konserviert Basen beinhalten Stickstoff → Bei höheren Eukaryoten ist die Bakterienkulturen in Gegenwart von Zentromer Sequenz sehr lang und verschiedenen radioaktiven Isotopen durch viele Repeats aufgebaut wachsen DNA-Moleküle im Dichtegradienten nach Größe gut auftrennbar erzeugen mit Cäsiumchlorid einen Gradienten, zentrifugieren den und genau dort, wo für das DNA-Molekül der Auftrieb und die Schwerkraft sich auswiegen, dort reichert sich das DNA-Molekül an DNA detektierbar →aromatische DNA-Replikation Ringe absorbieren kurzwelliges Licht Semikonservatives →durch Röhrchen Licht Modell → wurde von durchscheinen lassen und wo Meselson und Stahl schwarzer Strich entsteht, ist DNA belegt Meselson und Stahl haben Bakterienkultur in Anwesenheit vom schweren Stickstoff wachsen lassen →DNA isoliert und im Dichtegradienten zentrifugiert →haben uniform schwere DNA- Moleküle bekommen →gemäß dem Gewicht hat man Absorptionspeak bekommen  Bakterien rausgeholt und in neues DNA a-Protein →sieht Origin und Medium mit dem leichten Stickstoff bereitet es für Replikation vor dazugegeben und eine Generation →Helikase wird reingebracht und vervielfältigen lassen →haben DNA-Strang geöffnet gemischte Doppelstränge von DNA- Eine Helikase (DnaB) (entwindet DNA) Molekülen bekommen wird durch ein “Ladeprotein” (DnaC) in weiteren Zyklen und wenn man es auf die DNA geladen. Die DNA wird immer wieder im leichten Stickstoff partiell entwunden (an einer AT- wachsen lässt, verdünnt sich Gewicht reichen Sequenz). An dieser Stelle aus →der Mutterstrang bleibt aber in kann Replikation beginnen einer DNA immer enthalten 3‘ OH Startmolekül wird benötigt für belegten damit die Semikonservative den Start der Synthese →Primasen Replikation docken hier an und können am freien 3’ OH Ende neue Nukleotide DANN-Polymerisation dranbauen Desoxynucleotidtriphosphate, eine RNA-Moleküle können sich selbst DNA-Polymerase, ein freies 3’ OH vermehren Ende & ein Template Proteine und Faktoren, welche an der DNA-Replikation verläuft IMMER von DNA-Replikation beteiligt, sind: Arthur 5’ nach 3’ Kornberg führte in vitro DNA- -ase = Enzym (Polymerase) Synthese Versuche durch. → zeigen, dass für die DNA-Synthese folgende Komplementär zur Matrize Faktoren benötigt werden durch die Bindung der 1. DNA als Template (Vorlage) Phosphordiesterbrücken entsteht 2. DNA als Primer (freies 3’ OH) (in vivo freies Pyrophosphat ist dies meist RNA) Die Energie für die Neusynthese 3. dNTP (desoxynukleotid Triphosphate) stammt aus der Hydrolyse eines 4. DNA-Polymerase 1 dNTPs (desoxyncleotide-triphsophate) 5. Magnesium in ein dNMP (…monophosphate). Jedes angehängte Nukleotid verfügt DNA-Polymerase & deren über ein neues 3’ OH Ende, welches Möglichkeiten die weitere Synthese der DNA erlaubt 5’-3’ Polymerase Aktivität (zur → Das freie 3’ OH Ende macht einen Neusynthese von DNA) nukleophilen Angriff auf das alpha- 3’-5’ Exonuklease Aktivität (Entfernt Phosphat gerade eingebaute Nukleotide vom 3’ New Strang: 5‘ zu 3‘; Vorlage Strang: Ende, wenn diese nicht korrekt z.b. 3‘ zu 5‘ →dann DNA-Polymerase →5‘ falsche Basenpaarung eingebaut zu 3‘ wurden) “Proofreading Aktivität” DNA-Replikation ist sehr schnell: 5’-3’ Exonuklease Aktivität (Entfernt o Bakterien: 850 Nukleotide pro DNA oder RNA-Stränge von deren 5’ Sekunde Ende) o Eukaryoten: 60 bis 100 nt pro Bakterielle DNA Polymerase I hat alle Sekunde 3 Aktivitäten Bakterielle-DNA Polymerase III hat nur Ablauf der DNA-Replikation 5’-3’ Polymerase und 3’-5’ Beginnt an eine Origin of Replication Exonuklease Aktivität, jedoch keine 5’- (bei Bakterien durch eine bestimmte 3’ Exonuklease Aktivität Sequenz definiert)  Da DNA-Polymerase keine de novo Diese „Bubbles“ „verschmelzen“ nach DNA-Synthese beginnen können der Replikation wieder bedarf es immer einer Primase, welche ein kleines RNA-Fragment zur Verfügung stellt Das 3’ OH Ende des RNA-Primers wird durch DNA Pol III verlängert. Einer der beiden Stränge kann kontinuierlich verlängert werden (leading strand) Der andere Strang wird diskontinuierlich verlängert (lagging Replikation Bakterien & Eukaryoten strand): Hier müssen ständig neue Replikation bei Replikation bei RNA Primer und kurze DNA Fragmente bakteriellen Eukaryoten (Okazaki Fragmente) erzeugt werden, Plasmiden welche anschließend miteinander bidirektional (geht in sind größer, haben verknüpft werden (Ligiert) → die beide Richtungen, definierte ständig entstehenden Primasen auch chromosomale Zeitspanne für müssen wieder entfernt werden und DNA) Zellteilung zur das passiert durch die DNA verfügbar (definierte Startpunkte = ARS) Polymerase I(besitzt Aktivität: 5‘-3‘ Plasmide = kleine, besitzen Replikons, Exonuklease) ringförmige welche durch ARS Entstehung der Okazaki Fragmente autonom (autonomous replizierende replicating 1. Initiation: RNA-Primer startet doppelsträngige Sequentes) definiert Replikation am lagging strand → 1. DNA-Moleküle sind →ARSs werden Okazaki Fragment durch ORCs(origin 2. Neuer DNA-Strang wird entwunden recognition und verlängert → 2. Okazaki Fragment complexes- 3. Nach Beendigung des 2. Fragmentes Proteinkomplexe) wird das 3. Okazaki Fragment erkannt synthetisiert Besitzt mehrere 4. DNA-Primase beginnt mit dem 4. ARSs →deren Okazaki Fragment Replikation muss 5. Primer durch Polymerase 1 entfernt genau reguliert sein, 6. Verbindung benachbarter DNA- da es auf keinen Fall doppelt repliziert Fragmente durch DNA-Ligase werden darf →DNA- Um den RNA-Primer der DNA-Synthese wieder Strang kann dadurch zu entfernen, wird DNA-Polymerase III durch an mehreren Stellen DANN-Polymerase I ersetzt gleichzeitig repliziert werden →geht viel Meist (aber nicht immer) ist DNA- schneller Synthese bidirektional und bildet ein Genexpression “Auge” Gene kodieren (in der Regel) für Proteine → An jeder Replikationsgabel findet sich mehrere Gemeinsam bilden daher ein “leading” und ein “lagging” Merkmale/Funktionen strand: “Semidiskontinuierliche DNA- Synthese” Es entsteht eine Replication Bubble Arzt Archibald Garrod für eine bestimmte AS gebrauchtwird, nicht Studierte 1902 Alkaptonurie Patienten wachsen Konnte zeigen, dass es sich hierbei um eine rezessive Erbkrankheit handelt Patienten scheiden Homogentisinsäure aus (durch Abwesenheit eines funktionellen Enzyms kann diese nicht metabolisch abgebaut werden) Diese Patienten können Homogentisinsäure nicht metabolisieren Er schloss, dass eine Blockade in einem metabolischen Prozess zur Akkumulation eines Stoffwechselintermediats führt OMIM Online Mendelian Inheritance in Man Neurospora: Isolation von Mutanten, welche alle human genetischen Krankheiten in bestimmten Stoffwechselwegen defekt sind (Zusammenhang: Phänotyp und Genotyp), wird täglich aktualisiert Auxothrope Mutanten: sind auf die Zugabe von Aminosäuren angewiesen Synthesestoffwechsel Bakteriengenetik verwendet, um Aminosäuren Beadle & Tatum 1942 aufzubauen und zu entdecken (multi-step gewisse Gene für biochemische Prozess) →mittels Hefegenetik hat man Prozesse verantwortlich darüber sehr viel gelernt →kam dabei drauf, haben auxotrophe Mutanten aus dass der Aufbau von Aminosäuren sehr Neuro spora crassaisoliert konserviert, ist in Eukaryoten und Prokaryoten haben mutierten Stamm genommen und gewisse einzelne, aufgereinigte verwendete Pilz der in 2 Formen von Leben Aminosäuren zugegeben →haben vorkommt = diploid→ zwei Kopien, haploid→1 erkannt, dass durch die Zugabe einer Kopie Aminosäure, die Pilze wieder wachsen wenn man jetzt diploiden Stamm hernimmt konnten →man hat somit eine und mutagenisiert, kann man eine Mutation Mutation in einem gewissen Enzym, einfügen bzw. Gen ausschalten, hat aber das für die jeweilige Synthese trotzdem zweite Genkopie da, was daher gebraucht wird, somit konnten sie Wachstum nicht stört →kann dann herausfinden, welches Gen defekt ist Organismus in haploiden Zyklus und dadurch das Enzym ausfällt, das hineinschicken und so haploide Kulturen vom gebraucht wird, um das Medium zum Pilz wachsen lassen Endprodukt weiter zu synthetisieren und so hat man viele von den Genen auf Medium, wo alle Aminosäuren identifiziert, die man braucht, um vorhanden sind, kann er perfekt wachsen Aminosäuren zu synthetisieren →ist bei minimalem Medium, wo er auf ein vielschrittiger Prozess Eigensynthese von AS angewiesen ist, werden Kulturen, wo Mutation in einem Gen ist, das One Gene – one RNA model →Sequenzinformation lässt sich daher Gene (Abschnitte der DNA) werden in von diesem Strang leicht ablesen RNA transkribiert (abgeschrieben) Die Synthese neuer RNA wird durch Oftmals hat die RNA selbst bereits eine RNA-Polymerase katalysiert eine Funktion, und wird nicht in ein Um den Startpunkt der RNA-Synthese Protein umgeschrieben zu definieren, werden regulatorische Fehlen dieser RNAs kann auch zur Sequenzen benötig Ausprägung von Phänotypen führen TRANSKRIPTION Viele dieser nicht-codierenden RNAs Bakterien Prokaryoten Eukaryoten sind essenziell Initiation Terminale Verschieden (Promoter), Hairpins e RNAs durch Beispiele nicht kodierender RNAs Elongation, (Haarnadeln) versch. RNA- Ribosomale RNA (rRNA): bildet den Terminatio , Rho Polymerasen Großteil des Ribosoms (Translation) n (Helikase) (rRNA, Small nuclear RNA (snRNA): bildet den mRNA, katalytischen Teil des spliceosoms snRNA, (RNA splicing) tRNA, Small interfering RNA (siRNA): snoRNA) essenzieller Teil der RNA gesteuerten Transkription in Bakterien Interferenz (RNAi) erfordert Initiation, Elongation & Small nucleolar RNAs (snoRNAs): Termination steuern Modifikationen in der rRNA Initiation benötigt Promotor Micro RNAs (miRNAs): regulieren die Promoter: Startpunkt → bestimmt Ort Translation und Stabilität von RNAs & Richtung der RNA-Neusynthese Short heterochromatic RNAs (shRNA): Kodierende Sequenz + Promotor Kontrollieren die Stilllegung von bilden eine funktionelle Einheit chromosomalen Regionen links von Transkriptionsstart spricht man von upstream of gene (Start, Genexpression im molekularen Level Promoter), rechts von downstream of Wie wird die genetische Information in gene (zeigt an, wann Schluss ist) Polypeptidketten umgesetzt? Bestimmte Sequenzen sind in Bei der Transkription wird DNA in RNA Promotoren bakterieller Gene umgeschrieben konserviert → Position -10 und -35 Bei der Translation wird die in RNA sind hoch konserviert →Eintrittsstelle gespeicherte Information in Proteine für RNA-Polymerase übersetz Bestimmte Nukleotide kommen an Pos. -10 und -35 häufig vor →Grund Transkription ist ein Faktor, welcher der Polymerase DNA-Strang wird in RNA hilft, Initiation einzuleiten umgeschrieben In vitro kann bakterielle RNA- Da RNA (wie DNA) nur in 5’-3’ Polymerase von jeder Stelle Richtung synthetisiert werden kann, Transkription initiieren muss DNA in 3’-5’ Richtung gelesen (Assoziation mit Sigma Faktoren (oft werden→3’-5’ Strang = Template Sigma 70) beschränkt die Initiation auf Strang! Promoter Regionen) Der 5’-3’ Strang ist dem RNA-Strang Ablauf: Sigma-Faktoren erkennen die - nahezu ident (Coding strand) 10 und -35 Stellen →Polymerase bindet →Entwindung des  Doppelstrangs →öffnen die DNA Polymerase. Durch ATP-abhängiges →Polymerase kann beginnen (bindet Entwinden der RNA vom Template zuerst bei -35, dann bei -10) Strang dissoziiert die RNA. o RNA-Polymerase-Holoenzym erkennt zuerst den Promoter Transkription bei Eukaryoten in der -35 Position und bindet Es werden verschiedene RNAs durch dann an den vollständigen verschiedene RNA-Polymerasen gebildet: Promoter Ribosomale RNA (rRNA): o RNA-Polymerase bindet noch dichter an Promoter an der - macht Großteil der zellulären RNA aus 10 Position, wird begleitet von (90%) lokal entwundenen DNA in aus rRNA werden Ribosomen gebildet dieser Region →jetzt ist RNA- RNA aktive Teil des Ribosoms Polymerase korrekt orientiert, rRNA wird durch RNA-Polymerase I um an +1 Position mit der synthetisiert Transkription zu beginnen auch katalytische Aufgaben Nach dem Entwinden der DNA dissoziiert der Sigma Faktor und die Messenger RNA (mRNA): RNA-Polymerase kann die kodiert für Proteine Transkription beginnen. enthält die Information, die am Während der Elongation verändert die Ribosom in ein Protein übersetzt wird Polymerase Ihre Form (wird mRNA wird von RNA-Polymerase II kompakter). synthetisiert Bakterielle RNA-Polymerase hat eine eigene unwindungs Aktivität. Kleine nicht kodierende RNAs (snRNAs, tRNAs, snoRNAs): haben regulatorische oder katalytische Funktion Genom-Browser bringen einzelne Aminosäurestücke an Ribosomen, wo sie zu Polypeptid Gene auf Chromosomen können in jede verknüpft, werden Richtung orientiert sein werden von RNA-Polymerase III Code ist auf beiden Strängen codierbar synthetisiert Operons → es werden mehrere Gene Regulation der Proteinkodierenden gemeinsam reguliert Gene Termination der Transkription in bei Eukaryoten benötigt es ebenso einen Start Prokaryoten Pol II. benötigt Promotoren und Enhancer Durch terminale Hairpins reguliert. Die →dort heftet Transportmaschinerie an Struktur verlangsamt die RNA Pol. Die Wie wurden diese definiert: folgenden U-reichen Sequenzen destabilisieren die RNA-Interaktion durch Mutationen wird die Aktivität mit dem Template Strang und die verringert Polymerase dissoziiert. oder: Transplantation des Promoters Durch Rho-abhängige Termination. führt zur Aktivierung von Eine C-reiche Sequenz in der RNA „downstream” Sequenzen erlaubt das Binden von Rho. Rho ist eine Helikase und folgt der RNA- Promotoren können bis zu 200 bp upstream die Assemblierung des zentralen der kodierenden Sequenz reichen Transkriptionsapparates und kontrollieren so die Genexpression Vorgang: →hilft Genexpression Gewebs- und Beginn der eukaryotischen T ein wichtiger Zelltypspezifisch zu gestalten Transkription ist bei der TATA-Box (- dieFaktor gir Transkribierte RNA besteht aus einer Initiation 25, reich an Thymine und Adenine) der Trans 5’ untranslatierten Region, der →Pol II wird an TATA-Box gebracht Kription Proteinkodierenden Sequenz, und TBP und TFIIs assemblieren an der einer 3’ untranslatierten Region. 5’ TATA-Box →an TATA-Box lagern sich und 3’ Untranslatierte Region immer mehr Transkriptionsfaktoren bestimmen die Stabilität und an, die wichtig sind für die gesamte Translatierbarkeit einer RNA. Transkription o transkribierte RNA hat immer Enhancer: können mehrere 1000 bp untranslatierte Regionen upstream oder downstream der (meist vor Translation-Start kodierenden Sequenz liegen →der und Translation-Stopp) minimale core-Promoter umfasst ca. →werden bei Translation 50 bp upstream des nicht umgeschrieben Transkriptionsstarts Prokaryotische RNA Eukaryotische RNA Bei +1 liegt die Initiator Sequenz: hier wird bereits wird modifiziert, beginnt Transkription kotraskriptionell prozessiert, aus Kern Bei -25 liegt die TATA-Sequenz → translatiert, da sie exportiert und erst dient als Bindungsstelle für TBP (Tata keinen Zellkern im Zytoplasma binding protein, hilft Polymerase ihren haben translatiert Ort zu finden), was wiederum als Modifikation & Reifung Grundlage für die Bindung weiterer TFII (Transcription Factor II Proteine) eukaryotischer mRNAs dient Capping: Wichtig ist der TFII H: hat Helikase Wenn ca. 20 Nukleotide der RNA- und Kinase Aktivität →die Helikase Synthetisiert sind, wird ein 5’ entwindet die DNA, die Kinase invertiertes methyl-Guanosin Cap phosphoryliert den C-Terminus von durch ein “capping- Enzyme” angefügt Pol II und hängt Phosphate dran →die → dadurch wird die zu translatierende Ladung der Aminosäuren Frequenz RNA markiert verändert sich dadurch kann mit der diese bildhafte "Kappe" schützt die Transkription begonnen werden mRNA vor dem Abbau durch in Eukaryoten gibt’s noch viele Exonuklease und ist für das zusätzliche regulatorische Elemente = Ausschleusen aus dem Zellkern und „promotor proximale Elemente” der Initiation der Translation von →liegen weit weg: -50 bis -200bp Bedeutung alles zusammen hilft einen effizienten Jedes RNA-Stück, dass dieses Cap hat, Start zu gewährleisten wird in weiterer Folge in Proteine „promotor proximale Elemente“ z.B. übersetzt CAAT box, GC box →oft stark Zucker von Nukleotid 1 und 2 werden konservierte Sequenzen →diese auch methyliert Sequenzen werden von zusätzlichen Transkriptions-Aktivatoren gebunden →diese Aktivator-Proteine erleichtern Poly-A-Tail: Gen kann man dadurch mehrere verschiedene Polypeptide erzeugen Eukaryotische mRNAs werden an bei einer fertig transkribierten RNA, deren 3’ Ende Polyadenyliert die nun translatiert werden kann, RNA ist sehr instabil in der Zelle und wurde das Cap und der Poly-A-Tail durch das Dranhängen des Poly-A- drangehängt und die Introns entfernt Tails (150 bis 400 Adenosine hintereinander) schützt RNA vor Translation Abbau In mRNA gespeicherte Information wird am Ablauf: Ribosom in Proteine übersetzt. o wenn ein Transkript ins finish Das Ribosom besteht selbst aus RNA und geht, gibt es Proteinen (Struktur des Ribosoms: Nobelpreis Erkennungsproteine, welche 2009) an die Sequenz binden und einen Schnitt machen Ribosomen einer der dominantesten o (RNA wird gespalten: Bestandteile einer Zelle (ca. 1000 pro Zelle) Sequenzen am 3’ Ende der RNA werden erkannt = CPSF, Struktur einer Aminosäure CstF o in unmittelbarer Nähe wird die RNA gespalten durch CF I und CF II = cleavage factor I und II) o dann wird von PAP am 3‘ Ende viele A-Nukleotide drangehängt (= Polyadenylation) o passiert ohne eine Vorlage Splicing: Grundstruktur von jeder Aminosäure: weitere Spezialität von eukaryotischen C-Atom an dem eine Carboxyl-Gruppe, Transkripten →tragen zur eine Amino-Gruppe, ein H-Atom und Vielfältigkeit bei die für jede einzelne AS Eukaryotische Gene sind nahezu unterschiedliche Rest-Gruppe immer von Introns unterbrochen R Gruppe bei jeder Aminosäure →Introns werden im Zellkern durch verschieden (R = Rest) prä-mRNA Spleißen entfernt Im Menschen: 20 verschiedene o Exons= codierte Sequenz; Aminosäuren eukaryotisches Gen, das nach einzelne Aminosäuren werden durch Spleißen erhalten bleibt Peptidbindung miteinander verknüpft o Introns= nicht codiert, werden (am Ribosom) →passiert zwischen deswegen beim Spleißen Carboxygruppe der 1. Aminosäure und herausgeschnitten der Aminogruppe der 2. Aminosäure Möglichkeit aus einem Lokus versch. →Peptidbindung entsteht unter Polypeptide zu erzeugen = Abspaltung von Wasser alternatives Spleißen: führt zur Reihenfolge der Verknüpfung: in Diversifizierung des Proteoms →aus 1 mRNA Genetischer code: Triplett-code sich etwas geändert, aber schlussendlich Jede Position einer RNA kann 4 wurde der ursprüngliche Code verschiedene Informationen wiederhergestellt beinhalten G, A, U, C Wie lautet der genetische Code? 3 aufeinanderfolgende Nukleotide Nierenberg und Khorana: entschlüsselten den können 4x4x4= 64 Aminosäuren genetischen Code beschreiben 3 Basen kodieren eine Aminosäure Sie verwendeten Zell-freies in vitro Da es nur 20 natürliche Aminosäuren Translationssystem (Zelllysat) in welches gibt, ist der genetische Code synthetische RNA zugefügt wurde. redundant → für eine bestimmte Anschließend wurden die synthetisierten Aminosäure gibt es mehrere Aminosäuren analysiert. Dadurch konnten sie verschiedene Tripletts herausfinden, welches Basentriplet für welche Experimente am Bakteriophagen T4 Aminosäure kodiert. bestätigten den Triplett code Beispiele der verwendeten RNAs: Experiment am Bakteriophagen T4 AAA AAA AAA 2 Arten von Plaques auf Bakterienrasen: UCU CUC UCU C r+ Stämme → trübe Plaques GAG GAG GAG GAG rII-Stämme → klare Plaques usw. können diese Stämme durch Einfügen So konnten fast alle möglichen oder Deletieren einer Base verändern Aminosäureketten synthetisiert werden → mischt man Phagen mit den Bakterienrasen entstehen Löcher in Genetischen Code ablesen den Bakterienrasen = klare Plaques ist redundant Frameshift durch Proflavin: Mutation ist ein Triplett-Code durch Entfernung einzelner Basen ohne Unterbrechung →entdeckten Proflavin, dass aus Nahezu Universell (Ausnahme: trüben Plaques, klare Plaques machen Organellen oder Protozoen) konnte Im Code Start & Stopp Sequenz Tripletts einer RNA codieren für gewisse die dritte Position kann eine ungenaue Aminosäuren →wird jetzt eine Base durch Basenpaarung eingehen/variabel sein Proflavin entfernt, entstehen neue Tripletts und ergibt trotzdem gleiche AS →3. und so neue Aminosäuren →durch Reversion Position kann schlampig sein = ist es möglich Base wieder dazu zuaddieren „Wobble-Hypothese“ und ursprüngliche Basenreihenfolge wieder zu bekommen→ Reversion: Mutation durch Addition einzelner Basen →bis auf 2 falsche Aminosäuren, wird wieder das richtige Protein gebildet (wieder trübe Plaques) →wenn eine Base hinzugefügt wird, wird nach 2 Falschproduktionen wieder die richtige Aminosäure gebildet Crick und Bencer haben erkannt, dass durch das Hinzufügen von 3x je 1 Base an benachbarten Positionen die Proteinfunktion wiederhergestellt werden konnte →lokal hat Ablauf der Translation Translation erfolgt vom 5’ zum 3’ Ende RNA bringt die Tripletts an diese Maschinerie der mRNA (mRNA) und durch diese wobble-basepairs tRNAs bringen Aminosäuren zum kann eine t-RNA verschiedenen Codons für die Ribosom gleiche AS decodieren Das Anticodon der tRNA basenpaart mit dem Codon der mRNA. eine tRNA muss nach der „Wobble- tRNA hat auch oft noch andere Basen Hypothese“ das gleiche Basentriplet z.B. Inosin (unterscheiden sich nur an der 3. Base) für die Jede tRNA wird mit einer spezifischen gleiche AS, für jedoch unterschiedlicher Aminosäure beladen. Basentripletts der mRNA codieren können tRNAs nehmen eine Kleeblattstruktur (durch Basenpaarungen) ein. In gefaltetem Zustand nimmt die tRNA eine L- Form ein Alle tRNAs haben eine CCA-Sequenz logische Erklärung: es gibt zwar 61 Basen- an deren 3’ Tripletts (auf der mRNA) →jetzt müsste es 61 Ende. Diese anticodierende Basen-Tripletts der tRNA Sequenz wird geben, um an die 61 Basen-Tripletts der mRNA post-transkriptionell angefügt. zu binden →es gibt jedoch nur 41 der tRNA →so müssen jetzt gleiche tRNA-Basen- Tripletts für unterschiedliche mRNA-Basen- Tripletts anticodieren →es passieren dadurch unübliche Basenpaarungen, wie z.B. G-U →Basen müssen aus ihrer Position am Ribosom während der Translation herauswackeln, damit das möglich ist →Wobble-Paarungen Mögliche Basenpaarungen der wobble Position: Aminoacyl-tRNA Synthetase belädt tRNAs unter ATP-Verbrauch Zyklus: 1. Aminoacyl-tRNA Synthetase bindet ATP, bindet Valin (AS) und bringt diese durch Esterbindung in eine Jede Frequenz hat drei mögliche Codes → Nur energetisch günstigere Form eine Sequenz ergibt einen längeren offenen 2. Ungeladene tRNA wird von dem Leserahmen (reading frame) welcher durch Enzym aufgenommen ein Start und Stopp Codon definiert ist & 3. Aminosäure bindet an die tRNA somit zu einem Peptid führt.  4. tRNA & gebundene AS werden Das primäre Transkript wird in seine entlassen Untereinheiten zerschnitten 5. neuer Zyklus kann starten & die tRNA (prozessiert). transportiert die AS zur mRNA Funktion des Ribosoms dabei bindet die Carboxyl-Gruppe der Kleine Untereinheit: Aminosäure an die Ribose des letzten Ribonukleotids der tRNA-Kette (bindet an Hier wird mRNA durchgefädelt & 3' oder 2' OH) decodiert Ribosomen in Bakterien & Große Untereinheit: Eukaryoten Erzeugung der Peptidkette prokaryotische & eukaryotische tRNA interagiert mit dem Ribosom an der A, P, Ribosomen sind einander sehr ähnlich und E Site die RNAs in Ribosomen haben strukturelle, aber auch katalytische A-Site = Aminoacyl-Site: hier tritt Funktionen beladene tRNA hinein P-Site = Peptidyl-Site: Stelle, wo zweite beladene tRNA wäre und hier kann die eine AS an die zweite drangehängt werden E-Site = Exit-Site: während die Kette wächst, werden die leeren tRNAs hier entlassen Translation wird in 3 Phasen reguliert: Initiation, Elongation, Termination Initiation in Bakterien Initiation wird von Initiationsfaktoren reguliert. Initiation Factor 1 und 3 binden die Unterschiede der Ribosomen: kleine ribosomale Untereinheit. Diese bindet Bakterien Eukaryoten das 5’-Ende der RNA. Die kleine Untereinheit Größe 70S 80S des Ribosoms erkennt die Shine-Dalgarno Große 50S 60S Sequenz und weiß das es dort binden muss. Untereinheit Die rRNA basenpaart mit der Shine-Dalgarno Kleine 30S 40S Sequenz der mRNA. Die erste geladene tRNA Untereinheit mit Methionin (Codiert für AUG = Startcodon) S → Sedimentationskoeffizient = 1S = 10-13 (in Bakterien fMET = formyliertes Methionin) Sekunden kann an die Untereinheit treffen und die Translation beginnen Ribosomale RNA wird als ein precursor-Molekül transkribiert rRNA der kleinen Untereinheit basenpaart mit (Zahlen nicht relevant): der Shine-Dalgarno Sequenz und lässt dadurch In Bakterien ist dies als 16S 23S 5S das Ribosom erkennen, dass es nahe dem Transkript organisiert Start-Codon ist →relativ nahe dran (ca. in den In Eukaryoten als 18S-5.8S-28S (bzw. nächsten 10 Basen) kommt dann das Start- 25S bzw. 23 S (Pflanzen, Tiere, Pilze)) Codon AUG. Die kleine Untereinheit ist gebunden an die mRNA. Die beladene tRNA ist anhand des IF2 erkannt worden und dazugekommen. Dies Elongation führt dazu, dass sich die große Untereinheit wird in Eukaryoten und Prokaryoten benötigt anlagert unter der Entlassung der Initiationsfaktoren (IF) und der Hydrolyse von Elongation Faktor Tu (Ef-TU) wird mit der Guanosintriphosphat (GTP = tRNA komplexiert und bindet an die A-site energiefreisetzender Prozess). Es liegt nun die Ef-TU wird durch Ef-Ts neu mit GTP beladen mRNA mit beiden Untereinheiten und die erste tRNA vor. IF1 hat dabei geholfen, dass Elongation bei Prokaryoten die A-Site geschlossen blieb, während fMET über die P-Site geladen wurde und so an das AUG-Codon binden konnte. Die nächste tRNA kann nach der Entlassung der IF nun über die A-Site an die erste AS binden →Polypeptidkette entsteht Initiation in Eukaryoten Erfordert eIFs. (Eukaryotic initiation factors) Elongation bei Eukaryoten ähnlich Benötigt KEINE Shine-Dalgarno →Unterschiede nicht besprochen in Sequenz. VO mRNA muss ein Cap tragen, dort 70S Initiationskomplex wird bindet eIF4E & gibt Signal für den hergestellt →fMET-tRNA bindet an Start AUG-Codon in P-Site von Ribosomen (A-Site wird bei erster AS blockiert) Ablauf: In einem Komplex mit Ef-TU und GTP 1. eIFs und eine mit met-tRNA beladene bindet das nächste Aminoacyl-tRNA 40 S Untereinheit interagiert mit dem Molekül (Ser = tRNA Ser) an das Cap & scannen das 5’ Ende der RNA nebenliegende Codon (UCC) in der A- bis zum 1. AUG Site vom Ribosom→ große 2. Nach Erkennen des AUGs bindet die Untereinheit verknüpft dabei die AS 60S Untereinheit und nahezu alle eIFs unter Abspaltung von Wasser und werden entlassen (außer eIF4E→ Bildung einer Peptidbindung→ dieses bindet weiterhin am Cap). Carboxyl-Gruppe der einen AS wird 3. Das 3’ Ende des A+ tails der RNA mit der Amino-Gruppe der anderen AS interagiert mit dem Cap. unter Abspaltung von H2O verbunden 4. Dies führt zu einem geschützten, zirkulären Molekül, welches effizient translatiert werden kann. 5. Zirkularisierung der mRNA sorgt für effiziente Translation Nach Peptidbindung führt EF-G zur Translokation von A zur P-site →erst wenn eine freie tRNA die E-site verlässt, ist die A-site für die  Aufnahme einer neuen tRNA bereit GDP und die GTP-Hydrolyse setzt RF3 (mit EF-TU) frei Translokation erfolgt, wenn sich das Ribosome recycling factor (RRF)bindet Ribosomen um ein Codon nach rechts an A-Seite bewegt, was EF-G und GTP erfordert EF-G-GTP bindet an Ribosom →die →das Peptidyl-tRNA bewegt sich von Hydrolyse von GTP zu GDP führt zur A-Site zur P-Site →leere tRNA bewegt Verlagerung des Ribosoms, RRF sich von P-Site zur E-Site kommt an die P-Site und tRNA an die o sobald das Ribosom einige E-Site Codons vom Start-Codon RRF gibt die freie tRNA frei, EF-G gibt entfernt ist, kommt es zu RRF frei, und die zwei Ribosomen einer neuen Untereinheiten dissoziieren von der Translationsinitiation mRNA →Prozess wiederholt sich immer wieder, so entsteht ein Termination bei Eukaryoten Polysom eRF1 erkennt alle 3 Stopp-Codons (daher zerfällt das Ribosom wieder in seine Einzelteile und die Peptidkette wird freigegeben) eRF3 stimuliert Termination Regulation der Genexpression in Bakterien und Phagen Wenn die Translokation beendet ist Genexpression → Wie der Genotyp eines und die Peptidyl-tRNA an der P-Site Organismus oder einer Zelle den Phänotypen ist, wird das ungeladene tRNA von der ausprägt E-Site freigegeben und das Ribosom Inducers und Repressors kontrollieren die kann erneut einen Elongations-Zyklus Genexpression. beginnen Der Elongations-Zyklus wiederholt sich Inducers sind oft kleine Moleküle. Diese bis ein Stopp-Codon (UAA, UGA, UAG kleinen Moleküle werden oft von DNA- in mRNA) auftritt bindenden Proteinen erkannt, welche als Aktivatoren oder Repressoren der Termination bei Prokaryoten Transkription wirken. Stopp-Codon tritt auf →Terminationscodons werden nicht Induzierbare Gene werden nur exprimiert, in durch tRNA erkannt der Abwesenheit einer Repressors bzw. in der Statt tRNA bindet ein Releasefaktor Anwesenheit eines Inducer Moleküls (RF1) an Stopp-Codon (RF1 erkennt In Bakterien sind die Gene für UAA und UAG; RF2 erkennt UAA und bestimmte Stoffwechselwege oftmals UGA (in Bakterien)) gekoppelt RF1 führt zur Trennung des Proteins eine regulatorische Region kodiert für von tRNA durch Peptidyltransferase die Transkription einer Die Polypeptidkette wird freigesetzt, Polycistronischen RNA. Diese RNA der Rest wird recycelt (Ribosomen, kodiert für multiple Peptide → mRNA,... können öfters verwendet Operon werden) Jacob und Monod haben das lac- RF3-GDP bindet, wodurch RF1 Operon untersucht. Dieses kodiert für freigesetzt wird →GTP ersetzt das  ß-Galactosidase (lacZ), die Strukturgene transkribieren = Lactosepermease (lacY), ß-Galactoside positive Regulation transacetylase (lacA). Die Anwesenheit von Lactose und die Experiment zur cis Aktivität des Abwesenheit von Glukose induziert Operators die Expression dieser Gene 1000x. Die RNA ist instabil. Abwesenheit von Lactose schaltet diese Gene sofort ab. Jacob & Monod’s Mutagenese Experiment Haben durch das Mutagenese Experiment das Lac-Operon untersucht haben Mutationen isoliert, wo dieser Stoffwechselweg des Laktoseabbaus 1. Teilweise diploid in Abwesenheit eines nicht mehr funktioniert →erkannten, Inducer →bei jeweils einem Operon dass es für die Regulation des Operons haben sie eine der Gensequenz „lacZ, Elemente auf dem DNA-Molekül lacY oder lacA“ mutiert, bei selbst gibt →identifizierten eine „geklonten“ Operon noch dazu der Region als Operator (lacO) und eine Operator mutiert, damit Repressor als Repressor (lacL) nicht binden kann →konnten daher Ergebnis: nur gemeinsam mit beiden Operons o lacO operiert in cis-Region Laktose transferieren, da bei jeweils (gleich beim Promoter) →lacO einem Operon die benötigte Sequenz operiert am gleichen Molekül fehlte, die beim anderen vorhanden des Operons (ist also fix an war diesem Platz lokalisiert) a. bei originalem Operon, o lacL operiert in trans-Region konnte Repressor an Operator →lacL kann frei binden und es wurden gar herumschwirren und auch auf keine laktoseabbauenden anderen Molekülen fungieren, Enzyme produziert hat eigenen Promoter und b. bei Klon konnte der Repressor Terminator und wird immer nicht an den mutierten neu erzeugt= konstitutive Operator binden und so Exprimierung wurden Enzyme gebildet → ein Tetramer des Repressors bindet an wegen mutierter Herstellung den Operator und inhibiert die keine Funktion Transkription von mRNA. RNA- c. da aber originaler Operon Polymerase kann nicht an den durch Repressor blockiert war Promotor binden, wenn der Repressor und nichts produzierte, an den Operator gebunden ist = konnte keine Laktose negative Regulation abgebaut werden, da ein Induktion des Promoters durch normal hergestellte Permease Allolaktose: bindet Allolaktose an noch fehlte Repressor, verhindert dieser die 2. Teilweise diploid in Anwesenheit von Bindung des Repressors an den Inducer →originalem Operon wurde Operator →wenn kein Repressor am nun Inducer (Allolaktose) hinzugefügt Operator ist, kann RNA-Polymerase →bindet an Repressor und so war  Operator von originalem Operon nicht 2. Teilweise diploid in Abwesenheit eines mehr blockiert und konnte ebenso Inducer = wie oben nahmen sie jetzt Enzyme produzieren wieder zwei lac-Operons: bei beiden a. produzierte nun war jeweils eine Gensequenz wieder nichtfunktionelle ß- mutiert, die Operator waren normal Galactosidase aus dem aber diesmal war bei einem die lacZGen, funktionelle repressorproduzierende Gensequenz Permease aus dem lacY Gen mutiert →Repressor vom normalen und funktionelle Operon konnte aber binden und so Transacetylase aus dem lacA Polymerase bei beiden unterbinden Gen→ dar geklonte Operon →somit wusste man eigentlich das der produziert das gleiche wie Repressor trans aktiv ist vorher →zwischen den beiden 3. Teilweise diploid in Anwesenheit eines Operons entstehen Inducer = wie in Schritt 2 nur mit funktionelle ß-Galactosidase Inducer →Inducer (Allolaktose) wurde und Permease, Transacetylase hinzugefügt →der Inducer deaktiviert wird von beiden funktionell den normalen Lac Repressor und gebildet verhindert, dass es an die Operatoren b. hatte durch Zusammenarbeit bindet →der mutierte Lac Repressor von beiden Operons alle für kann auch nicht an Operator binden den Laktoseabbau wichtige →die Folge ist die Transkription von Enzyme gebildet beiden Operons: nichtfunktionierende c. cis bestätigt, da man sehen ß-Galactosidase und funktionierende konnte der Operator direkt Permease werden vom normalen am jeweiligen Operon arbeitet Operon produziert, funktionierende ß- und nicht den Platz wechselt Galactosidase und nichtfunktionierende Permease vom Experiment zur trans Aktivität des mutierten lacL Operon, beide bilden Repressors funktionierende Transacetylase →zusammen wieder alle Enzyme funktionierend für den Laktoseabbau gebildet 4. haben nun noch bei dem Operon, bei dem die repressorproduzierende Gensequenz mutiert ist, den Repressor so mutiert, dass er zwar am Operator bindet und die Polymerase blockiert jedoch unempfindlich gegen Allolaktose (Inducer) wird →mutierter Repressor band nun an beiden 1. haploide Belastung = ein einziger Operatoren der Operons und Operon - haben nun blockierte, während der normale repressorproduzierenden Abschnitt Repressor vom normalen Operon von vom geklonten Operon mutiert - der Allolaktose ineffektiv gemacht bildete mutierte Repressor die nicht wurde→ trans wieder bestätigt, da am Operator binden konnten - da mutierter Repressor nicht nur eigenen Operator nicht blockiert war, wurde Operon, sondern auch anderen alles gebildet Operon belegte  Operon kann erkennen, ob Glukose im Tryptophanmangel oder niedrigen Medium vorhanden ist: gibt Enzym, Tryptophanwerten) und ist dadurch langsamer das ATP zu zyklischem AMP (cAMP) →die so ermöglichte Sekundärstruktur umbaut →Glukose unterdrückt die verhindert Termination der Transkription →in Expression des Lac-Operons und führt Gegenwart von Trp forciert das Ribosom die zu niedrigen cAMP-Level Bildung einer Terminator Struktur (da eh hohe cAMP-Levels erlauben die genügend Trp vorhanden ist) Expression des Lac-Operons, wenn Glukose abwesend ist: wenn viel Genregulation in Eukaryoten cAMP vorhanden ist, kann es an CAP Kann über mehrere Ebenen erfolgen: (catabolit activator protein) binden Transkriptionskontrolle und in aktivierte Faltung bringen Regulation des RNA-Processings Trp-Operon RNA-Stabilität bei Bakterien Translationskontrolle Proteinstabilität kodiert ebenfalls für eine polycistronische Protein Modifikation mRNA, wo versch. Enzyme erzeugt werden, um Tryptophan (= wichtige AS für den Körper) Je weiter oben in der Kaskade gelegen, desto zu bilden verzögerter ist die Antwort auf ein Signal hat einen sensing-Mechanismus eingebaut, ob Proteinmodifikationen erlauben eine Tryptophan im Bakterium vorhanden ist oder unmittelbare Antwort auf einen Stimulus nicht Es ist einfacher ein Protein zu modifizieren, als Trp-Operon ist kleines Gen vorgeschalten, das eine Transkription neu zu starten ein kurzes Protein erzeugt, wo viele Transkriptionskontrolle Tryptophane eingebaut werden →ist viel Erfolgt über Aktivatoren vorhanden, passiert das sehr schnell, wenn Aktivatoren können Transkriptionen wenig vorhanden ist, passiert das sehr auf verschiedene Arten stimulieren langsam Sie binden bei TATA-Box & helfen ➔ geht nur in Bakterien, da Transkription Polymerase effizienter an die und Translation nicht örtlich getrennt sind, Promoter zu bringen sondern gekoppelt bei Eukaryoten ist Transkription im Kern, die Translation jedoch im Zytoplasma Attenuator reguliert die Expression in Gegenwart von WENIG Tryptophan →die 5‘ Region des Operons codiert für ein kurzes Peptid mit Trp-Codons UND kann Basenpaarungen eingehen, welche die Transkription terminieren können, →kann nur basenpaaren, wenn es langsam geht →wenn es zu schnell geht, würde Polymerase irgendwann runterfallen, wenn Sequenz aus ist →liegt an der Faltung die gleichzeitige Transkription und Translation ermöglicht das Ribosom gerät ins Stocken bei dem Trp- Codon in Abwesenheit von Trp (bei Aktivierung von Galactose Steroidhormon fermentierenden Enzymen in der diffundiert durch Zellmembran →bindet in Zelle an Rezeptor →dieser Hefe schleust Hormon in Zellkern Der Transkriptionsaktivator Gal4p wird nur in z.B. Hsp 90 (Heat shock protein 90: der Abwesenheit von Glukose synthetisiert. → ummanteln andere Proteine/Rezeptor Dieser bindet an die Gal UAS = UPSTREAM →schützt diese) verhindert die ACTIVATING SEQUENCE vorzeitige Aktivierung des In Abwesenheit von Galaktose wird Gal80 Steroidhormon-Rezeptors →wenn gebildet, welches den Lokus blockiert, an dem Hormon in die Zelle eintritt, wird es die Polymerase eintreten würde, → blockiert von Hsp90 befreit →Steroidhormon- somit Gal4 Rezeptor bindet nun hormone receptor elements (HREs) an der DNA Galaktose vorhanden: Gal3 wandelt Galactose und regulieren so die Transkription in Inducer, welcher Gal80 bindet → Gal 4 wird bestimmter Gene wieder aktiviert. Mediator (z.B.: SAGA) kann Kombinationen von Aktivatoren, Gal4 binden & Polymerase beim Eintreten welche an Promotoren bzw. Enhancer unterstützen → Transkription kann starten binden, regulieren verschiedene Gene Mögliche Wirkungsweise von →z.B.: Gen im Bsp. braucht 4 Aktivatoren Sequenzen Hormonen auf die Transkription Durch Kombination verschiedener Membrangebunden: Rezeptoren binden Faktoren kann eine große Zahl an Hormone und führen zu einer intrazellulären Genen mit einer limitierten Zahl an Signaltransduktion Transkriptionsfaktoren kontrolliert Membranpermeabel: Hormone binden einen werden→ zeigt, dass die Effizienz der intrazellulären Transkriptionsaktivator Polymerase vom Zusammenwirken verschiedener Faktoren abhängt Höhere Eukaryoten DNA-Abschnitte sind dicht verpackt →dadurch kann Transkriptionsapparat an Gene schlecht koppeln →Chromatin muss offen sein, damit Polymerase daran binden kann →gibt folgende Möglichkeiten, um Gene längerfristig abzuschalten Globale Regulation Polypeptidhormon An der Außenseite der Zellmembran ist ein Repressor, welcher mit dem Hormon bindet →startet Informationsweitergabe an Zellkern Histon Modifikationen: können Transkription regulieren, indem Chromatin mehr oder weniger zugänglich verpackt, wird →gibt viele Histonmodfikationsmöglichkeiten z.B. Anheften von Acetylgruppen damit DNA loser Mutation passiert durch verpackt ist →so kann dann alles besser dazu Adaptation/einen Stimulus z.B. veränderte Umweltbedingung Chromatin remodeling complex: weitere diese Veränderung sollte zahlenmäßig Möglichkeit damit Lokus auch offener ist konstant sein →kann Histone entfernen und auseinanderschieben Darwinismus Methylierte Cytosin Mutation passiert zufällig→ irgendwann setzt sich ein Organismus besser durch als andere diese Veränderung sollte zahlenmäßig stark fluktuieren (je nach Generation, in welcher diese Mutation aufgetreten ist und je nachdem wie schnell sich die Generation vermehrt) stärker verbreitet als die Adaption DNA selbst kann auch modifiziert werden durch methylierte Cytosine Experiment von Luria & Delbrück Cytosin wird Methylgruppe angehängt →wird methyliert →führt zur engen Verpackung →ist so weniger zugänglich für Genexpression und kann daher reguliert werden →markiert meist Abschnitte auf Chromosomen, die nicht so aktiv sind gewisse Erkennungsmerkmale: befinden sich Modell von Darwinisten konnte durch in der Promotorregion von inaktiven Genen Resistenz von Bakterien gegenüber (als CpG islands) →Methylierung von CpG Bakteriophagen T1 experimentell belegt islands kann die Transkription inhibieren werden (Mittel-bis längerfristige Regulation) Bakterien wachsen lassen →über mehrere Arten von Mutationen Generationen an verschiedenen Punkten mit Chromosomale Mutation: Betreffen ganze Phagen infiziert →spontane Mutation in Chromosomen oder deren Teile. Führt so zum Unabhängigkeit der Phagen bzw. die dadurch Fehlen mehrerer Gene. veränderte Umwelt→ T1 resistente Bakterien kamen immer wieder durch Mutation vor und Punktmutation: Betrifft einzelne Gene durch gaben es an Generation weiter Veränderung, Deletion, oder Insertion einzelner oder weniger Basen. Die Zahl der resistenten Bakterien fluktuierte stark, je nachdem wo die spontane Mutation Mutation durch Transposable Elemente: auftrat und wie häufig diese weitergegeben Mobile DNA wurde →bewies das Modell der Darwinisten Mutationen können (müssen aber nicht) zur Produktion eines funktionell veränderten Genproduktes führen. Adaptation (Lamarckismus) vs. Mutation (Darwinismus) Lamarckismus Somatische vs. Keimbahn- Missense Mutationen Dabei wird die Identität des Codons verändert. Somatische Mutationen betreffen nur das Dabei wird ein Basenpaar ausgetauscht und Soma und sind somit nicht vererbt. somit eine Aminosäure gegen eine andere getauscht, da sich das Codon verändert. Keimbahn Mutationen betreffen alle nachfolgenden Generationen (bringen aber Beispiel: AAA codiert für Lysin, wird nun eine für den Träger keine Veränderung mit sich) Base geändert zu GAA codiert dieses Codon für Glutamin. Transitionen Dabei handelt es sich um eine Purin- bzw. Nonsens Pyrimidindesaminierung Dabei wird die Identität des Codons verändert. Dabei wird ein Basenpaar ausgetauscht und Dabei wird zum Beispiel ein A-T Basenpaar somit eine Aminosäure gegen ein Stopcodon gegen ein G-C Basenpaar ausgetauscht getauscht, da sich das Codon verändert. Die Desaminierung verändert die Beispiel: AAA codiert für Lysin, wird nun eine Basenidentität. SO wird aus einem Cytosin Base in der DNA zu TAA geändert, so entsteht durch Desaminierung ein Uracil. Ebenso wird in der mRNA ein UAA welches als Stop-Codon aus einem 5-methylcytosin durch fungiert. → führt zu verkürzten Proteinen Desaminierung ein Thymin Neutrale Die Desaminierung ist die häufigste Dabei wird eine Aminosäure gegen eine Mutationsform. andere getauscht, welche allerdings Beispiel einer Desaminierung: denselben Aminosäure-Charakter wie die ursprüngliche besitzt. APOBEC Cytidine Desaminasen Basisch durch basisch, polar durch polar eine Quelle für Mutationen besonders in Krebszellen Silent physiologisch können Enzyme Hier bleibt die Identität des Codons erhalten. Desaminierung selbst machen Dies kann passieren, da mehrere Codons für normalerweise desaminieren diese dieselbe Aminosäure codieren können. Enzyme RNAs zur viralen Abwehr von viraler RNA →machen virale RNA Beispiel: AAA codiert für Lysin, wenn nun die erkennbar, aber manchmal läuft es letzte Base getauscht wird zu AAG entsteht schief →desaminiert dann wieder ein Lysin genomische Nukleotide in genomische DNA und das führt zu Mutation Frameshift Dabei verändert sich der Leserahmen, was in Transversion der Regel zu einem verkürzten Protein führt, Diese Mutationsart tritt sehr selten auf. da ein zufälliges Stop-Codon den (falschen Leserahmen unterbricht. Dabei wird eine Purin- gegen eine Pyrimidinbase ausgetauscht & umgekehrt. Es wird ein Basenpaar addiert oder subtrahiert. Da Codons immer aus 3 Basen Zum Beispiel könnte ein Guanin gegen ein bestehen verändert sich nun der Leserahmen. Cytosin getauscht werden→ dadurch wird dann auch die kovalente Base ausgetauscht Suppressor Mutationen (passiert z.B. in der tRNA) Dabei wird eine Aminosäure gegen eine andere Ausgetauscht, die restliche Synthes wird aber nicht gestört. gibt eigenen Reperaturmechanismus, um Diese Mutation können andere Mutationen Fehler zu beseitigen. supprimieren. Förderung der Mutation Diese Mutationen können Intra- & UV-Strahlung: Extragenisch auftreten Ist ein starkes Mutagen für unsere Gen. Extragenisch: Suppressor Mutation wird eingefügt die Mutation unterdrückt UV-Strahlung induziert die Bildung von Nukleotid-Dimeren (präferentiell Thymin). Intragenisch: Mutation eingefügt, sodass Replikation kann diese Transläsion nicht Faltung des Proteins so verändert wird, dass korrigieren und arretiert an dieser Stelle. es nicht mehr funktioniert →in anderen Loci wird dann wahrscheinlich zweite Mutation Ionisierende Strahlung: eingeführt, die dies wieder kompensiert und (Röntgen) oder Radioaktivität erzeugt richtig faltet Punktmutationen (Nonsens, Missens & Silent) Mutationsrate in niedriger Konzentration, hohe Konzentrationen erzeugen Spontane Mutationen treten im Menschen Chromosomenbrüche→ Entstehung von mit einer Häufigkeit von 10-4 bis 10-6 pro Gen Chromosom Kreuzungen (Translokation). und Generation auf. Beispiel: Philadelphia Chromosom (Austausch In Prokaryoten mit 10-5 bis 10-7 pro Gen und zwischen Chromosom 9 & 22) Generation. Mutationen können während der Replikation durch tautomere Basenpaarung entstehen. Dabei wird bei der Zellteilung dann immer Chemikalien: wieder das „falsche“ Produkt weitergegeben, Originale Mutagen Modifizierte Paarung Ergebnis bis sich das gefestigt hat. Base Base Partner Guanin Salpetrige- Xanthin Cytosin Non Depurinierung säure kann zum Verlust von Purinen führen (Adenin, Cytosin Salpetrige- Uracil Adenin C-G → Guanin) säure T-A Adenin Salpetrige- Hypoxanthin Cytosin A-T → Purin-Basen werden vom Zuckerstrang- säure G-C Doppelstrang der DNA herunter gelöst durch Cytosin Hydroxyl- Hydroxyl- Adenin C-G → Hydrolyse →Zuckerphosphatgerüst bleibt in amin aminocytosin T-A Takt, aber es können an diesen Stellen Brüche Guanin Alkylanzien O6- Thymin G-C → entstehen (= DNA-Brüche) →z.B. durch Hitze: Methylguanin A-T Purine werde dabei leicht abgespalten (muss man nicht auswendig können) Ames Test 4. UvrD (Protein D) bindet und weltweit anerkennt entwindet die Region zwischen den abgeschnittenen Bereichen und gibt jede Chemikalie, die auf den Markt kommt, die beschädigte Passage frei geht durch diesen Test→ Test auf mutagene 5. DNA-Polymerase I füllt die Lücke Wirkung chemischer Komponenten auf DNA- 6. DNA-Ligase tritt zu den DNA- Moleküle (unser Erbgut) Segmenten und verklebt sie Mutagene Wirkung von Chemikalie entsteht →Reparatur ist beendet erst in unserem Körper Nicht toxische Komponenten werden oft erst durch deren metabolische Veränderung toxisch →dies wird in vitro durch Zugabe von Rattenleberextrakt-Enzymen simuliert: durch Verwendung verschiedener S. typhimurium Mutanten (Salmonellen-Stamm, der nicht wachsen kann, da er eine Histidin-Mutation hat)kann auf die Art der induzierten Mutationen geschlossen werden →wenn Stoff nun genotoxische Substanz erzeugt kann es zu einer Mutation im Stamm kommen →wenn, dieser nun recht mutagen ist, wird er am Locus der Histidin-Mutation eine Methylation-dependent mismatch Rückmutation hervorrufen →Stamm wächst repair wieder Reparaturmechanismus wenn falsche Base heute noch verwendet: zeigt wie genotoxisch eingebaut wird eine Substanz ist doch wie wird erkannt, wo repariert werden Nukleotide excision repair muss? →bei Bakterien gibt es eine Modifikation an den Adenosinen, wo der Existiert in fast allen Organismen. Es wird das ganze Nukleotid entfernt. Ursprungsstrang erkannt werden kann Thymin Dimere werden erkannt. Der defekte Ablauf in Bakterien: Strang wird geschnitten und eine Helikase 1. MutS (= Enzym) erkennt den entwindet den Strang. Nach Reparatur durch Mismatch Pol 1 wird die Stelle durch Ligation versiegelt. 2. Enzyme MutH und MutL kommen dazu →erkennen MutS und Beispiel: Mondscheinkinder→ hier ist dieser Ursprungssprang (ist durch Methyl Vorgang Defekt markiert) →bestimmen den Ablauf: unmethylierten Strang (→unmethylierter muss korrigiert 1. UvrAB-Komplex scannt und findet werden) →MutH spaltet diesen DNA-Fehler (in der Mitte ein Thymin- 3. Im neuen Strang wird Bruch Dimer) eingeführt → Exonuklease verdaut 2. UvrA (Protein A) wird freigegeben, fehlerhaften Strang und entfernt UvrC (Protein C) bindet damit die falsch eingebauten 3. Bei 5' und 3' schneidet man Passage Nukleotide →so ist Mismatch entfernt weg  4. Polymerase 3 repariert den Strang Reparaturproteine (MutH, MutL, MutS, UvrD), →kann neu synthetisieren und durch Pol II, Exonuklease und Ligase Ligase kann Lücke geschlossen werden → Alle 3 arbeiteten zuerst mit Bakterien, In Eukaryoten gibt es eine andere Art der dann mit Eukaryoten Erkennung des Ursprungstrangs →Ursprungsstrang nicht methyliert →glaubt, Mendel’sche Genetik dass man anhand der Okazaki-Fragmente Merkmale werden durch Gene & erkennt, wer neu und wer alt ist (Enzyme Umwelteinflüsse beeinflusst & ergeben so ähnlich, heißen aber anders: MSH2, MLH1, einen Phänotypen eines Individuums. PMS1, PMS2) Phänotyp → Ausprägung eines physischen Mutationen in diesen Enzymen, die die Merkmales Mismatches korrigieren, führen zu bekannten Gregor Mendel studierte Merkmale der Erbse, Krankheitsbildern: z.B. non-polypatösen welche gezielt gekreuzt wurden. → wollte Colon-Carcinom (Krebs) →erhöhte herausfinden, wie sich phänotypische Mutationsrate in stark replizierenden Merkmale weiter vererben → zu seinem Glück Geweben →hohes Risiko Krebs zu entwickeln verwendete er Erbsen, denn deren Phänotyp wird jeweils nur von einem Gen getragen Hierbei wurde auf 7 Merkmale geachtet: Form der Erbse Farbe der Erbse Schotenform Schotenfarbe Pflanzengröße