Serolojik Tanı Lab 2 PDF

MİKROBİYOLOJİK TANIDA SEROLOJİK TESTLER Özgür ÇELEBİ  Serolojik testler Serolojik testler, in-vitro antijen-antikor birleşmesi mekanizmasına dayanan ve enfeksiyon hastalıklarının laboratuvar tanısında yaygın olarak kullanılan immünolojik yöntemlerd...

MİKROBİYOLOJİK TANIDA SEROLOJİK TESTLER Özgür ÇELEBİ  Serolojik testler Serolojik testler, in-vitro antijen-antikor birleşmesi mekanizmasına dayanan ve enfeksiyon hastalıklarının laboratuvar tanısında yaygın olarak kullanılan immünolojik yöntemlerdir. Bu testlerde temel amaç, bilinmeyen bir reaktifi (örn. antikor) bilinen bir reaktif (örn. antijen) kullanarak saptamaktır. Ayrıca bu deneyler sadece serumda değil gerektiğinde diğer vücut sıvılarında veya sekresyonlarda da uygulanmaktadır. Bu nedenle serolojik deney sözcüğü yetersiz kalmakta, immünolojik deney terimi daha uygun olmaktadır. ….iki amaçla kullanılırlar. Hastalık etkeni mikroplara ait bildiğimiz antijenleri kullanarak hastaların serum, BOS ve diğer vücut sıvılarında özgül antikorlar aranmasıdır. Serolojik testler diye bildiğimiz deneyler bu grupta yer alır (Antikor Arama). Daha önceden araştırma laboratuarlarında hazırlanmış, bilinen antikorlar (antiserumlar) kullanarak çeşitli ortamlarda mikrop antijenleri aranmasına ve tanımlanmasına yönelik deneylerdir (Antijen Arama).  Akut bir enfeksiyon hastalığının serolojik tanısı; hasta serumunda serokonversiyonun ve/veya etkene özgül IgM antikorlarının ya da enfeksiyon bölgesinde etkene ait antijen varlığının gösterilmesiyle konur. Serokonversiyon, enfeksiyonun akut ve konvelesan dönemlerinde (10-14 gün arayla) hastadan alınan iki serum örneği arasında antikor düzeyinin 4 kat veya daha fazla artış göstermesi ile karakterizedir.  Serolojik testlerde antikor varlığını göstermek kadar, antikor düzeyinin (miktarının) belirlenmesi de önem taşır. Bu nedenle çoğu infeksiyon hastalığında antikor miktarını belirlemek için serolojik testlerde serum sulandırılmaları yapılır. Deney sonucunda hiçbir sulandırımda reaksiyon görülmezse, serolojik test (-) negatiftir, aranan antikor yok demektir. Serolojik test tüplerinde reaksiyon varsa antikor varlığını gösterir. Reaksiyonun görüldüğü en son tüpün dilüsyonu, o serumun antikor titrasyonu olarak ifade edilir (Örneğin 1/80 gibi). 1. Aglütinasyon Deneyleri Bakteri, eritrosit gibi hücreler yüzeylerindeki Ag'lere karşı antikorları ile karşılaştırıldığında kümeleşme oluştururlar. Bu kümeleşme gözle görülebilir. Ayrıca lateks, gibi sentetik partiküllere istenilen Ag yapıştırılır ve bunlar da özgül antikorları ile karşılaşınca gözle görülebilen kümeleşmeler oluştururlar. Bunlara Lateks aglütinasyonu denir. Aglütinasyon deneylerinde kümelenen hücre eritrosit ise bu testlere hemaglütinasyon adı verilir.  Aglütinasyon deneyleri lam üzerinde bir damla Ag solusyonu bir damla hasta serumu ile karıştırılarak yapılabilir. Buna lam aglütinasyonu denir. Örneğin CRP, RF lateks lam aglütinasyonları gibi. Bu testler 1-2 dakikada sonuç verirler. Daha hassas olan aglütinasyon deneyi tüp aglütinasyonudur. Serolojik deney tüplerinde serum sulandırımları yapılır. Ag konur. Bir süre inkübe edilir. Aglütinasyon görülen tüplerdeki sonuçlar titre ile ifade edilir. Örnek deneyler: * Salmonellozis'te Gruber-Widal aglütinasyonu, Brucellozis'te Wright aglütinasyonu gibi. * Hemaglütinasyon deneylerine örnek; kan gruplarının tayini, * Atipik pnömonilerde soğuk aglütinasyon gibi. * Ayrıca pekçok infeksiyon hastalığında kendi ismi ile anılan aglütinasyon deneyi vardır. Listeria aglütinasyon deneyi gibi. Lam Agglütinasyon Deneyi Tüp Agglütinasyon Deneyi … aglütinasyon örnekleri Örnek I: Lam aglütinasyonu ile bakteri tanımlaması: Bu amaçla, kültürde üretilen bakteri kolonisi ya da hasta örneği lam üzerine konur. Üzerine, şüphelenilen bakteriye karşı hazırlanmış antiserumdan (antikor) bir damla damlatılır ve homojenize edilir. Lam dairesel hareketlerle 5-10 dakika karıştırılır ve pozitif reaksiyon kümeleşme şeklinde görülür. Örnek II: Tüp aglütinasyonu ile Brucella antikor tesbiti: Çalışılacak hasta serumunun seri dilüsyonları (1/40, 1/80, 1/160, 1/320,..) hazırlanır. Tüm sulandırımlar üzerine standart miktarda Brucella bakteri süspansiyonu (antijen) eklenir. 37°C’de 1 gece inkübe edilir ve kümeleşme varlığı değerlendirilir. Aglütinasyonun görüldüğü son serum sulandırımı, o serumun Brucella antikor titresini verir. Aglütinasyon  Lateks aglütinasyon testi Lateks aglütinasyon reaksiyonunun mekanizması Koaglutinasyon S.aureus’un dış yüzeyinde bulunan protein A bölgesine doğal olarak antikorların Fc kısmı bağlanır. 2. Presipitasyon Deneyleri Presipitasyon reaksiyonu, çözünür (soluble) haldeki antijenlerin özgül antikorlarla birleşmesi ve kafes oluşturarak çözünür olmayan presipitin-çökelek oluşturması esasına dayanır. Presipitin oluşumunun gözle görülebilmesi için antijen ve antikorun uygun oranlarda birleşmiş olması gereklidir. Özel olarak hazırlanmış jelatin veya agar bir lam üzerine veya petri içine dökülerek dondurulur. Agar içine küçük çukurlar açılır. Karşılıklı çukurların birine Ag, diğerine antikor (hasta serumu) konur. İkisi de agar içinde diffüze olur (yayılır). Karşılaştıkları yerde beyaz renkte bir bulanıklık = presipitasyon bantı oluşur. Agarda yapılan presipitasyon deneylerinde düşük voltajlı elektrik akımı uygulandığında Ag ve antikorun diffüzyonu daha hızlanır. Test süresi kısalır. Bunlara elektroimmünodiffüzyon adı verilir. Presipitasyon Diameter2 Radial Immunodiffusion (Mancini) Ag Concentration İmmunoelektroforez yöntemi _  Türbidimetrik ve Nefelometrik yöntemler Bu yöntemler, sıvı ortam içinde karşılaştırılan ve birleşerek bulanıklık oluşturan antijen-antikor komplekslerinin kantitatif olarak ölçüldüğü otomatize yöntemlerdir. Işık kaynağının bu sistemlerde, bulanıklığın şiddetine göre süspansiyon içinden geçen ışık şiddeti fotoelektrik algılayıcılar (sensör) tarafından elektriksel veriye dönüştürülür. Nephelometer 3. Kompleman Birleşme Deneyi Bu test, hasta serumunda etkene özgül antikor titrelerinin belirlenmesinde, antijen-antikor birleşmesi sonucu komplemanın aktive edilmesi esasına dayanan klasik bir yöntemdir. Hasta serumunda özgül antikor varlığında kompleman fikse edilmiş olduğundan hemolitik sistem üzerine bir etkide bulunmaz ve eritrositler kendiliğinden çöker (pozitif sonuç). Buna karşın özgül antikor yoksa kompleman serbest olduğundan hemolitik sisteme etki ederek eritrositleri parçalar (hemoliz, negatif sonuç) Kompleman bağlayan antikorların (IgG ve IgM sınfı) ortaya çıkarılmasında kullanılır. Örnek: Kist hidatik tanısında kullanılan Weinberg, Sifilis tanısında Kolmer deneyleri gibi Complement Fixation 4. Hemaglütinasyon Önlenim Testi (HÖ) Bazı viruslar doğal olarak bazı hayvan eritrositlerinin reseptörlerine bağlanarak onları aglütine etme (hemaglütinasyon, HA) yeteneğindedirler. Bu özellikten yararlanılarak HA yapan viruslara (örn. kabakulak, rubella, influenza, paramiksovirus, arboviruslar, vb.) karşı özgül antikor varlığının araştırılmasında HÖ testi kullanılır. V. Hemadsorbsiyon Önlenim Testi (HadÖ) Hemadsorbsiyon (Had), bazı viruslarla enfekte olan hücrelerin yüzeylerine viral antijenler eksprese edildiğinden bazı hayvan eritrositlerinin adsorbe olması (yapışması) olayıdır. VI. Nötralizasyon Yöntemi Nötralizasyon yöntemi, hasta serumunda virusları ya da bakteri ekzotoksinlerini nötralize etme özelliğine sahip antikor (nötralizan antikor) varlığının araştırılmasında kullanılır. Nötralizasyon 7. İşaretlenmiş Antikor Deneyleri Serolojik deneylerde amaç; bilinen antijen veya antikordan birini kullanarak özgül bağlanma ile diğerini aramaya ve saptamaya yöneliktir. Bu deneylerde karşılaşılan esas zorluk, antijenle antikor birleşmesi gerçekleşse bile; bunun görülebilir, saptanabilir hale getirilmesindedir. Eski teknikler ile çok düşük düzeydeki antikor veya antijen varlığını ortaya koyma şansı azdır. Ancak işaretlenmiş antikor deneyleri dediğimiz bu gruptaki gelişmiş, yeni tekniklerle çok az miktarda bile olsa antikor veya antijen varlığı gösterilebilir, hatta ölçülebilir. Üstelik bu deneylerde aranan antikorun hangi sınıf olduğu, kısaca IgG, IgM, IgA olup olmadığı ortaya çıkarılabilir. Bu da infeksiyonun seyri ve tipi (akut-kronik) hakkında güvenilir bilgi verir.  İşaretli immün yöntemler Yöntem İşaretleme Katı faz maddesi Değerlendirme Enzim Alkalen fosfataz, Polistiren bilyalar immunoassay peroksidaz gibi veya Spektrofotometre ile Absorbans ölçümü (ELISA, EIA) enzimler mikropleyt çukurları Radio l gibi radyoaktif 125 Tüpler veya cam Gama sayacı ile immunoassay (RIA) maddeler bilyalar Radyoaktivite ölçümü Fluorescein Üzerine hücre, doku Floresan boyama ile Immünofloresan isotiyosiyanat veya mo fikse parlak sarı-yeşil antikor (İFA) gibi floresanlı boyalar edilmiş lamlar boyanmanın görülmesi Luminol, lusiferin gibi Luminometre ile ışık Manyetik partiküller, Kemilüminesans bioluminesan (foton) salınımının maddeler mikropleyt çukurları ölçümü Alkalen fosfataz, Antijen Görsel olarak koyu Line peroksidaz gibi emdirilmiş özel renkli bant oluşumunun immunoassay (LIA) enzimler şeritler görülmesi Bu deneylerde temel prensip: Bilinen bir antijen sabit bir yüzeye önceden tespit edilir. (Örneğin (FAT)'de lam üzerine, EIA ve RIA'da polistren tüp veya mikropleyt çukurlarının iç yüzeyine). Ortam içine antikor aranan hasta serumu konur. Serum içinde aranan antikor varsa, tespit edilmiş, bağlı haldeki antijenle birleşir. Antijenle antikor birleşmesi gerçekleştiğinde, ortama işaretli ikinci bir antikor katarak, bunun da immün komplekse bağlanması sağlanır. Daha sonra ne kadar işaretli antikor bağlandığı ölçülerek deney değerlendirilir. Antikor işaretli olduğundan bunların ölçümü de kolaydır. Eğer serumda aranan antikor yoksa immün kompleks oluşmayacak ve böylece sonradan katılan işaretli antikor da bağlanamayacaktır.  Deney yapılırken aradaki yıkama işlemleriyle bağlanamayan şeyler ortamdan uzaklaştırıldığından ölçüm sırasında işaretli antikor da saptanamaz. İşaretli antikorun olmaması ise aranan özgül antikorun da olmadığını, kısaca deneyin negatif olduğunu gösterir. Bu tip deneylerde kullanılan işaretli antikorlara konjugat adı verilir. Antikor işaretlemede floresan boyası, enzim veya radioaktif madde kullanılır. Floresan konjugatı, enzim Konjugatı şeklinde de isimlendirilir. Deney adları da işaretleyici maddeye göre verilir. (FAT, EIA, RİA gibi). Bu deneyler standardize, hazır, kit şeklinde ticari olarak hazırlanmış ve kullanıma sunulmuştur. Enzim İmmün Assay (EIA veya ELİSA): İşaretli antikor deneyleri içinde son yıllarda en geniş kullanım alanı bulmuş çok hassas bir serolojik test yöntemidir. Aranan antikorun antijenle birleşip, birleşmediğini ortaya çıkarmada, enzimle işaretli ikinci bir antikor kullanılır. Enzimle işaretli anti-immunglobulin yapısındaki bu ikinci antikor, immun komplekse bağlanır. Ortama enzimin etkilediği substratın eklenmesiyle renk oluşumu, temelde bir spektrofotometre olan özel EIA okuyucuların da ölçülerek, değerlendirilir. EIA, bakteri, virüs, parazit ve mantar infeksiyonlarında, hem özgül antikor aranmasında, hem de mikroorganizma antijenlerinin saptanmasında mikrobiyoloji laboratuvarlarına kolaylık ve yenilik getirmiştir. Ayrıca EIA, hormon, ilaç düzeyi, tümör işaretlerinin tayininde kullanılabilen bir immunolojik testtir.  ELISA to detect Ab (HIV, HCV) to detect Ag , For e.g- HCG enzyme-linked immunosorbent assay: (ELISA) (ELISA plate; Sarı renkli çukurcuklar positive) ELISA reader Radioimmun Assay (RİA): Prensip olarak EIA' e benzer. Bu deneyde antijen-antikor birleşmesini ortaya çıkarmada, radioaktif bir madde ile işaretli antikor deneye eklenmektedir. Deney sonuçları Gamma Counter denen radioaktif madde ölçen aletlerde hassas bir şekilde değerlendirilir. Kullanım alanı EIA ile aynıdır. Floresan Antikor Testi (FAT): Bu deneyde de prensip aynıdır. Floresan boyası ile işaretlenmiş antikor kullanılır. Deney sonuçları özel floresan mikroskoplarda değerlendirilir. Kullanım alanı EIA ve RIA ile aynıdır.  Fluorescent Antibody Techniques Fluorochrome Labeled Ab Fluorochrome Unlabeled Labeled Anti-Ig Ab Direkt Floresan İndirekt Floresan antikor Ag antikor Ag Tissue Section Tissue Section Borrelia burgdorferi IFA slides Auramine-rhodamine boyası Mycobacterium tuberculosis specimen: whole blood, serum/plasma specification: cassette, strip Western Blotting Combines Electrophoresis with ELISA to separate and identify antigens  Sonuç Özgül antijen-antikor birleşmesi esasına dayanan immünolojik tanı yöntemleri gerek enfeksiyöz etkenlerin ve yabancı antijenlerin saptanmasında gerekse bunlara karşı oluşmuş antikorların araştırılmasında ve kantitasyonunda yaygın olarak kullanılan testleri içermektedir. Farklı mekanizmalarla uygulanan çok sayıda serolojik test mevcuttur. Bu yöntemlerin tanıdaki değeri; özgüllük ve duyarlılıklarının yüksek olmasına bağlıdır. Genellikle yardımcı tanı yöntemi olarak kullanılan serolojik testler özellikle klasik yöntemlerin uygulanamadığı durumlarda (örn. Kültürde üretilmesi zor olan veya mümkün olmayan etkenler) enfeksiyonların tanısında önemli yer tutarlar.