Sérologické metody, Molekulární metody, Interpretace mikrobiologického nálezu PDF

Sérologické metody Molekulární metody Interpretace mikrobiologického nálezu 2. ročník všeobecné lékařství Přednáška č. 4 MUDr. Jana Amlerová, Ph.D. Ústav mikrobiologie FN Plzeň  Osnova 1. Sérologické metody 2. Molekulární me...

Sérologické metody Molekulární metody Interpretace mikrobiologického nálezu 2. ročník všeobecné lékařství Přednáška č. 4 MUDr. Jana Amlerová, Ph.D. Ústav mikrobiologie FN Plzeň  Osnova 1. Sérologické metody 2. Molekulární metody 3. Interpretace mikrobiologického nálezu Sérologické metody  Cíle 1. Znát základní princip sérologické reakce a definovat dvě fáze jejího provedení 2. Popsat princip základních sérologických metod a) Precipitace b) Aglutinace c) Imunochromatografie d) KFR e) Neutralizace f) Reakce se značenou složkou – ELISA g) Blotové techniky 3. Definovat využití sérologických metod v mikrobiologické diagnostice  Sérologické reakce – reakce protilátek s antigeny in vitro Průběh ve dvou fázích 1. specifická vazba – Ag determinanta – vazebné místo Ab rychlá vznik vazby jednotlivých epitopů s vazebnými místy protilátek není patrná okem 2. nespecifická fáze – vizualizace reakce vznik prostorového komplexu uplatňuje se polyvalence Ag a polyvalence Ab (IgM-pentamer = 10 vazebných míst, ovšem reálně je k dispozici 5-6) reakce patrné okem nebo měřitelné → analyzátory Využití přímý průkaz agens = průkaz Ag ve vzorku nepřímý průkaz agens = průkaz protilátek v séru Rozdělení podle typu průkazu (povahy Ag) precipitace aglutinace vazba komplementu neutralizace reakce se značenými složkami Povaha antigenu: rozpustný (koloidní = solubilní) korpuskulární („částicový“, nerozpustný) = část nebo celá bakterie, latexová částice povlečená Ag... Stanovení Kvalitativní (výsledek pozitivní x negativní) Kvantitativní – stanovení titru (protilátek)  Ag celé mikroby jejich části jejich produkty Antiséra = imunní séra = protilátky (zvířecí – králičí …) monoklonální – stejnorodé – z jediné buňky (komerčně) – drahé polyklonální – z mnoha buněk B-Ly http://quizlet.com/15530903/biochem-lecture-9-flash-cards/  Ředění Titr protilátek (séra) = nejvyšší ředění, ve kterém ještě došlo k prokazatelné reakci dříve – ředění 1:100 – titr 100 dnes vžito – titr 1:100 Ředící roztoky Fyziologický roztok (FR – 0,9% vodný roztok NaCl) – běžná ředění Veronalový nárazník (pufr) s přídavkem iontů Ca2+ a Mg2+ = PBS (phosphate buffered saline) pozn. : pufr – roztok schopný udržovat v jistém rozmezí stabilní pH po přidání silné kyseliny či zásady do systému Sérologické ředění Ředění 1:2 = ředit 2x = 1 díl ředěného (séra) + 1 díl ředidla 1:4 = 1 díl ředěného (séra) + 3 díly ředidla (celkem 4 díly) X chemie 1:2 = 1 díl ředěného + 2 díly ředidla Postup při ředění Ředění geometrickou řadou nejčastěji s kvocientem 2 (1:2 1:4 1:8 …) vzácně s kvocientem 4 (1:4 1:16 1:64 …) při titracích virů s kvocientem 10 (1:10 1:100 1:000 1: 10 000 …) Mikrodestičky ve zkumavkách 8 řad 12 sloupců http://www.baria.cz/corning-plast pomocí pipet hlava ředícího hřebene v mikrodestičkách pomocí mikrodilutorů automatizované přístroje http://www.medmicro.info/portal/syfilis/lvl3/ch09s05.html  Precipitace Ag – nízkomolekulární nekorpuskulární rozpustný (solubilní) vazbou Ag-Ab vznikají velké prostorové útvary a ty vypadnou z roztoku jako sraženina = precipitát nutný optimální poměr Ag a Ab musí tam být hodně Ab (nehodí se k průkazu Ab) předpoklad – protilátka musí mít aspoň 2 vazebná místa a Ag 3 a více determinant http://www.wikilite.com/wiki/index.php/Main_Page  Typy precipitace v tekutém prostředí prstencová precipitace flokulace v agaru Ouchterlonyho technika - difuze v gelu Radiální imunodifuze dle Manciniové antisérum je přímo v gelu, prstenec okolo jamek s Ag Imunoelektroforéza V mikrotitrační destičce  http://www.snv.jussieu.fr/bmedi a/ATP/immu2.htm http://classes.midlandstech.edu/carterp/C ourses/bio225/chap18/lecture2.htm http://www.medmicro.info/portal/syfilis/lvl3/ch09s04.html  Aglutinace korpuskulární Ag – nerozpustný (tělísko, částice) pospojování Ag a Ab – vznik obrovských shluků = aglutinátů zbylá tekutina se vyčeří výborně aglutinují IgM (5 vazebných míst) Provedení – ve zkumavce, v mikrotitrační destičce, na sklíčku, na podložce... Vhodné k průkazu Ab i Ag http://edusanjalmicro.blogspot.cz/2010/04/immunology-note.html  Aglutinace Přímá Ag jsou přirozeně součástí povrchových struktur reagujících částic (antigeny krevních skupin) Nepřímá Ag navazujeme na povrch částice uměle Patří sem – aglutinace na nosičích = „precipitace převedená na aglutinaci“ Ag (koloidní) nebo Ab je navázán na nosiči (korpuskuli) - (latexové částice, erytrocyty...) v přítomnosti Ab nebo Ag dojde k aglutinaci Průkaz Ag – meningokoky, streptokoky, pneumokoky, rotaviry … v likvoru, séru, moči, sputu, ve stolici … Průkaz protilátek např. latexfixační test pro průkaz revmatoidního faktoru  Příklady aglutinace Sklíčková k průkazu Ag – určování mikrobů pomocí antisér (salmonely, shigely, enteropatogenní E. coli …) Průkaz protilátek Widalova reakce k průkazu protilátek (u salmonelóz) sérum se ředí, reakce přes noc odečet – roztočení zkumavek – víření aglutinátu proti yersiniím, listeriím, franciselám proti brucelám (Wrightova reakce) proti ricketsiím (Weil-Felixova reakce) proti leptospirám (současně i lýza bakterií – „reakce aglutinace-lýzy“)  Hemaglutinace Ag jsou ery (transfuzní služba) Paul-Bunnellova průkaz heterofilních Ab (reagují s ery jiných živočišných druhů) u inf. mononukleozy http://old.lf3.cuni.cz/mikrobiologie/bak/uceb/obsah/lues/lues.htm  http://www.biomedica.cz/index.php?id=2795 http://fvl.vfu.cz/sekce_ustavy/mikrobiologie/obrazova_priloha/mikrob/5.html http://old.lf3.cuni.cz/mikrobiologie/bak/uceb/obsah/schi/streptokoky/Streptok.ht m http://labmet.zshk.cz/vyuka/aglutinace-na-nosici- Imunochromatografie komponenty jsou navázány na povrch na určitých místech – testovací a kontrolní místo další komponenty se hned naváží na testovaný vzorek a spolu s ním cestují porézní vrstvou velmi rychlé (desítky minut) jednoduché (lze využít jako POCT) Hodnocení: Pozitivní výsledek – proužek v testovací i kontrolní linii Negativní výsledek – proužek pouze v kontrolní linii Pozn.: POCT = point of care testing – testování u lůžka pacienta, v ambulanci  Příklad detekce antigenu ICH metodou Ag ve vzorku Vytvoření proužku Vytvoření proužku v testovací linii v kontrolní linii Žádný proužek Vytvoření proužku v testovací linii v kontrolní linii Kontrolní linie Testovací linie  Komplement fixační reakce KFR Využití – průkaz protilátek Reakce je náročná na pečlivé odměření všech složek + kontroly Složky reakce: Antigen – titrace Ag (musí být v optimálním množství) Protilátka – testované sérum nesmí být hemolytické nebo chylózní – musí se inaktivovat vlastní komplement (56 °C na 30 min) Komplement (složka séra, v reakci morčecí) je termolabilní (pracovní ředění do lednice) váže se na komplex Ag s Ab nutné přesné množství – titrace komplementu Indikátor (hemolytický systém) k vizualizaci reakce beraní ery senzibilizované králičí protilátkou – hemolyzinem Princip: 1. Komplement se váže na komplex Ag – Ab 2. Nenavázaný komplement hemolyzuje senzibilizované erytrocyty KFR – pozitivní a negativní reakce http://old.lf3.cuni.cz/mikrobiologie/bak/uceb/obsah/kfr/Complement%20Fixation%20Assay.htm  KFR + -  Neutralizační reakce reakce, kdy protilátka brání biologickým účinkům Ag průkaz na vhodném systému použití: bakteriologie – průkaz antilyzinů (Ab zabraňuje hemolytickému účinku hemolyzinu bakterií) ASLO – průkaz antistreptolyzinu O indikátor – králičí erytrocyty přítomnost ASLO = zábrana hemolýzy virologie virusneutralizační test (VNT) hemaglutinačně inhibiční test (HIT) Neutralizační reakce  Reakce se značenými složkami jedna ze složek reakce je chemicky označena fluorescenční barvivo - imunofluorescence enzym – imunoenzymatické testy (ELISA …) radioizotop – radioimunoanalýza – RIA těžký kov – imunoelektronoptické reakce … značení se k molekule protilátky připojuje konjugací (chem. reakce) – výsledný produkt = konjugát konjugát = značení + Ab průkaz Ag – značená protilátka průkaz Ab – většinou reakce vícesložkové Použití: průkaz jednotlivých tříd Ig  Imunofluorescence IF jedna složka značená fluorescenčním barvivem odečet výsledku pomocí fluorescenčního mikroskopu Přímá fluorescence: průkaz Ag Nepřímá imunofluorescence: použití Ab proti Ab http://medicalab.blogspot.cz FTA Fluorescent abs http://www2.bc.cc.ca.us/bio16/default.htm  Imunofluorescence průkaz antigenu viru Herpes simplex typ 1 Foto: Ústav mikrobiologie FN v Plzni  Imunoenzymatické techniky EIA jedna složka reakce označena enzymem konjugát = značení (enzym) + protilátka ke znázornění výsledku se přidá příslušný substrát – enzymem se rozloží za vzniku barevného nebo luminiscenčního produktu zastavení reakce = zastavení reakce enzym-substrát v lineární fázi = stop roztok (silná kyselina n. zásada – H2SO4,…) – denaturace enzymu vyhodnocení intenzita zbarvení - na přístroji ( reader = čtečka) - měření tzv. optické denzity OD při určité vlnové délce Podle OD v jamách s standardizovanými kontrolními séry (kalibrační křivka) je stanoven tzv. cut-off = hranice vymezující rozhraní negativity a pozitivity  Základní složky ELISA testu Antigen detekovaný v testovaném vzorku známý, komerčně připravovaný Protilátka detekovaná v testovaném séru známá, komerčně připravovaná Konjugát Substrát chemická látka, která reaguje s enzymem a tím změní svou barvu  Hodnocení (podrobnosti jsou vždy v návodu ke konkrétní soupravě) vzorky sér s OD < cut-off jsou interpretovány jako negativní OD mírně nad cut-off – neurčitý výsledek či "reaktivní vzorek" (vyšetření pacienta se zopakuje) OD zjevně nad cut-off – pozitivní Kvantifikace výsledku kalibrační křivka získaná měřením OD dvou dodávaných kontrolních sér, nízce a vysoce pozitivního výrobce v tom případě zaručuje stálost poměru OD / množství protilátek nebo lze výsledek (orientačně) kvantifikovat podle logaritmu OD/cut-off semikvantitativním hodnocením mohou být slabě pozitivní vzorky označeny jedním křížkem (+), silně pozitivní třemi křížky (+++) http://www.ualberta.ca/~cw9/labtour/micro.html Mikrotitrační destička s plochým dnem (kvůli fotometrickému stanovení) Imunosorbční povrch (pevná fáze) – upravený polystyren (také kuličky, proužky)  Ag nebo Ab je vázán pasivní adsorpcí na pevný podklad = koutování = coating - inkubace ředěné protilátky v důlcích přes noc ve 4 °C http://www.alibaba.com/product-detail/ELISA-Microplate-Reader_104281121/showimage.html ELISA Reader http://en.wikipedia.org/wiki/Plate_reader  Typy technik ELISA Přímá ELISA – pro detekci antigenu (nebo Ab) nejjednodušší na pevné fázi hledaný Ag – značená Ab Nepřímá ELISA – pro detekci specifických protilátek event. Ag na pevné fázi známý Ag – detekovaná Ab – značená Ab je tam protilátka proti protilátce Kompetitivní ELISA Sendvičová ELISA na pevné fázi Ab přímá – pro detekci antigenu nepřímá – pro detekci specifických protilátek nebo Ag  Přímá ELISA Přímá ELISA Nepřímá ELISA Přímá sendvičová ELISA pro Ag „Ag je sendvič mezi 2 Ab“ Nepřímá sendvičová ELISA pro Ag „Prokazovaná Ab je mezi Ag a konjugátem“ Jana Navrátilová, Optimalizace detekce enzymu myeloperoxidasy v lidské plasmě metodou ELISA, bakalářská práce MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie Brno 3x negativní sérum - kontrolní 1x pozitivní sérum - kontrolní Ředění séra http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img= 3361490_1756-3305-5-70-1&req=4  Elispot kvantifikace buněk sekretujících cytokiny nebo imunoglobuliny na úrovni jedné buňky Zviditelnění buněk produkujících cytokin nebo protilátku 1 reagující buňka = 1 spot je možné pracovat s určitým počtem buněk (předchozí spočítání a naředění) http://www.immunospot.com/index.php?id=514 http://www.pharmaceutical-business-review.com  Imunoblot (Western blot) zvláštní příprava antigenu do reakce příprava jednotlivých vyčištěných Ag by byla velice nákladná – proto tato technika rozdělení hrubého antigenního preparátu na řadu složek název Western blotting (blot = angl. skvrna) přesátí skvrny z podložky na savý papír původní techniku vynalezl Southern (western – slovní hříčka) 1. Příprava Ag gelová elektroforéza separace proteinů podle jejich velikosti v polyakrylamidovém gelu blotting přenos proteinů z gelu na povrch membrány (nejčastěji nitrocelulózová nebo PVDF polyvinylidene fluorid) pomocí blotovacího zařízení pomocí el. proudu rozstříhání na proužky 2. Detekce – serologická reakce (jako ELISA v jamce) Využití: konfirmace u HIV, dg. borreliozy, hepatitid … http://www.medmicro.info/port al/syfilis/lvl3/ch09s05.html  Rozdělení proteinů podle molekulové hmotnosti na tzv. bandy (proužky) http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1668-34982006000100012 https://www.bing.com/images/search?view=detailV2&id=F97D0608BED82623459F382884D85244141D1DB2&thid=OIP.nq3- hNupM5eZXPaIE4AV7QHaEO&mediaurl=http%3A%2F%2Fcdn.hiv.uw.edu%2Fdoc%2F329-1%2Fhiv-1-antibodies-bound-to-hiv-1-antigens-on-western-blot-test- strip.jpg&exph=685&expw=1200&q=antigen+westernblot&selectedindex=5&ajaxhist=0&vt=0&eim=1,6&ccid=nq3%2BhNup&simid=607990449511402886 Molekulární metody  Cíle 1. Definovat princip molekulárních diagnostických metod 2. Popsat princip metod a) Hybridizační b) Amplifikační c) Sekvenační 3. Popsat složky master mixu (reakční směsi) pro PCR 4. Určit využití těchto metod v mikrobiologické diagnostice  Molekulární testy průkaz bakteriálních nukleových kyselin + velmi citlivé, specifické, rychlé - (drahé) průkaz NK i z mrtvých buněk náchylné na kontaminaci  Stavba nukleové kyseliny dusíkaté báze purinové adenin (A) guanin (G) pyrimidinové cytosin (C) uracil (U) thymin (T) DNA – A G C T RNA – A G C U báze + cukr + fosfát = nukleotid cukr báze + cukr = nukleosid ribóza (RNA) deoxyribóza (DNA) fosfát Základní vlastnost DNA – komplementární párování bazí C=G A=T A=U http://www.bioc.uzh.ch/bl exon/n:nukleotid http://en.wikipedia.org/wiki/Nucleic_acid  Struktura DNA 5´ 3´ phosphate OH- NK má na povrchu záporný náboj fosfodiesterová vazba vodíkové můstky NK je syntetizována ve směru 5' → 3' www.tuitionclass.net 3´ 5´ (tzn., že narůstá na 3' konci) Prodlužování řetězce – DNA polymeráza  Kódování aminokyselin Triplet = kodon = trojice dusíkatých bazí „Slova DNA mají délku tří písmen” http://is.muni.cz/do/sci/UEBBiol/DNA-FTBcz/pages/2-22- dna-tri-pismena.html  Pojmy denaturace DNA = úplné rozdělení dsDNA na 2 ssDNA hybridizace = spojení 2 řetězců (molekul), které spolu před tím spojeny nebyly replikace = syntéza komplementárního řetězce DNA (zdvojení) amplifikace = zmnožení DNA transkripce = přenos informace z DNA na RNA (přepis) translace (přenos) = překlad informace z RNA do vzniku bílkoviny (syntéza bílkovin) „ústřední dogma molekulární biologie“ = přenos info DNA – RNA – protein RNA je prostředníkem mezi DNA a proteinem  Genetické metody identifikace mikrobů Hybridizační metody ve vzorku máme DNA, kterou chceme určit přidáme „sondu“ – označený úsek DNA specifické pro určitý druh mikroba po rozdělení dsDNA mikroba (denaturaci) se obě DNA (ssDNA vzorku a ssDNA sondy) navážou, pokud je ve vzorku přítomen daný druh, a označení se „rozsvítí” vzorek se promyje (uvolní se nenavázané komponenty) hybridizované (označené) komplexy se odečtou na luminometru + rychlé, specifické - méně citlivé, potřebujeme více DNA ve vzorku Hybridizace – sonda http://biologie.upol.cz/metody/Slovnik/Sendvic.htm  Amplifikační metody Nejčastější PCR – polymerázová řetězová reakce Další metody (podobný princip) – LCR, NASBA (průkaz RNA)... Princip: ve vzorku máme DNA, kterou chceme určit tuto DNA „namnožíme” (amplifikace) Opakované cykly (cca 30-40x – cca 2 hod – cca 109 kopií) v termocycleru 1. denaturace (rozdělení dsDNA) (94–98°C, 20–30s) 2. připojení „primerů” = annealing (označí, který úsek DNA chceme množit) (50–65°C) 3. elongace – vznik nového vlákna DNA podle původního (syntéza pomocí DNA polymerázy) (75–80°C) amplikony pak prokážeme např. elektroforézou nebo DNA sondou (viz hybridizace)  http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction ------------------------------------------------------------------------------------------------- Detekce RNA – pomocí reverzní transkriptázy převedení na DNA = RT PCR  Složky PCR reakce https://www.genesinspace.org/news/blog/using-pcr-your-genes-space-proposal/ Hodnocení PCR  Ct = cycle threshold („cyklus prahu“) = cyklus, kdy dochází k nárůstu fluorescence nad práh pozadí, které se v reakci vyskytuje čím je Ct nižší, tím více bylo do reakce dodáno templátové DNA Amplifikační křivka – průběh PCR reakce Arya, Manit & Shergill, Iqbal & Williamson, Magali & Gommersall, Lyndon & Arya, Neehar & Patel, Hitendra. (2005). Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert review of molecular diagnostics. 5. 209-19. 10.1586/14737159.5.2.209. Kvantifikace PCR Kvantifikace relativní – real time PCR detekce amplifikačního produktu v reálném čase počet cyklů (Ct) potřebných k dosažení hranice pozitivity Kvantifikace absolutní – počet kopií NK stanoveno pomocí standardní křivky (kalibrátory součástí kitu) počet kopií NK na určené množství – většinou 1 ml, počet buněk… př. CMV, HHV6, HIV  Sekvenační techniky Sekvenování DNA = určení sekvence (pořadí) nukleotidů (resp. bází) v jednom z řetězců DNA (druhý řetězec je komplementární) Princip: při syntéze nových vláken DNA dochází v místě přítomnosti určitého nukleotidu k ukončení (terminaci) syntézy vznikají tak nedokončené úseky komplementárního vlákna, jejichž délku lze zjistit pomocí elektroforézy v gelu  Zastavení syntézy druhého vlákna při sekvenování normální terminační deoxynukleotid 100:1 dideoxynukleotid http://biologie.upol.cz/metody/  v jedné sekvenační reakci lze určit sekvenci templátového vlákna o délce přibližně 400-900 nukleotidů průběh ve čtyřech oddělených zkumavkách – v každé dochází k terminaci reakce v pozici jiného typu nukleotidu (A, T, C nebo G) délka produktů v dráze odpovídá pozicím určitého typu nukleotidu v templátovém vlákně Praxe detekce v kapilární elektroforéze nukleotidy značeny různými fluorescenčními barvami detekce laserem vytvoření ATCGCCTAACTGACCTGCACGTAAGCTGC http://biologie.upol.cz/metody/Slovnik/Cteni%20sekvenacniho%20gelu.htm http://www.docstoc.com/docs/122302623/Presentaci%EF%BF%BDn-de-PowerPoint http://www.eisenlab.org/FunFly/?page_id=24  Vyhodnocení SW v mezinárodních databázích http://orion.chemi.muni.cz/e_learning/=Texty/20- Proteosyntesa/20b-NK_proteos_Metody.htm  Využití sekvenačních technik Popis genomu mikroorganismů Identifikace mikroorganismů Porovnáním s databází Hledání mutací Detekce rezistence mikroorganismů Mimo mikrobiologii – „genetika” dg. vrozených vývojových vad onemocnění na genetickém podkladě (př. Leidenská mutace, metabolická onemocnění) onkologie Molekulární metody v mikrobiologii – využití cílená detekce infekčního agens ve vzorku možnost stanovení kvantity detekce přítomnosti nukleové kyseliny ve vzorku s následnou identifikací agens detekce genů pro rezistenci sekvenace genomu mikroorganismů epidemiologické charakteristiky typizace kmenů Interpretace mikrobiologického nálezu  Cíle 1. Popsat souvislosti, ze kterých interpretace vychází 2. Definovat možné chyby při interpretaci výsledku nepřímého průkazu 3. Vysvětlit pojmy a) Titr protilátek b) Index pozitivity c) Dynamika protilátek d) Anamnestický titr e) Čtyřnásobný vzestup (pokles) titru f) Sérokonverze 4. Definovat faktory ovlivňující výsledek sérologické reakce nepřímého průkazu 5. Popsat pojmy specifita a senzitivita reakce 6. Vysvětlit pojem laboratorní chyba  Diagnostika přímá Prokazuje přítomnost mikroba nebo jeho částí 1. mikroskopicky 2. kultivačně izolace mikroba identifikace stanovení citlivosti na antibiotika u patogenů průkaz mechanismů rezistence 3. důkaz přítomnosti typických mikrobiálních složek antigeny nukleové kyseliny 4. pokus na zvířeti  Diagnostika nepřímá Prokazuje reakci organismu na přítomnost infekčního agens 1. Průkaz protilátek 2. Buněčná imunita  Interpretace nálezů přímého průkazu Vždy v souvislosti: Se stavem pacienta S typem vyšetřovaného vzorku (vč. místa odběru) S metodou vyšetření vzorku S kvantitou nálezu S dalšími nálezy S biochemickými a hematologickými parametry S výsledky zobrazovacích metod S výsledkem histologie S dalšími souvisejícími faktory  Interpretace kultivačních nálezů Kontaminace zanesení cizorodých mikrobů během odběru nebo zpracování vzorku (z kůže, z prostředí…) Kolonizace přítomnost mikroorganismů, včetně potenciálních patogenů, které ale nevyvolávají danou infekci (normální mikroflóra orofaryngu, gastrointestinálního traktu apod.) Signifikantní patogen – interpretace v kontextu Patogeny obligátní, potenciální Interpretace průkazu mikrobiálních složek Průkaz Ag Falešná negativita Krátká doba od začátku onemocnění Např. průkaz Ag Streptococcus pneumoniae v moči Nízká citlivost metody … Falešná pozitivita Polyaglutinabilita Nespecifická reakce Průkaz NK Průkaz mrtvých buněk Kontaminace …  Interpretace nálezů nepřímého průkazu Vždy v souvislosti: Se stavem pacienta S typem vyšetřovaného vzorku (vč. místa odběru) S metodou vyšetření vzorku S kvantitou nálezu S dalšími nálezy S biochemickými a hematologickými parametry S výsledky zobrazovacích metod S výsledkem histologie S dalšími souvisejícími faktory  Interpretace sérologických výsledků (nepřímého průkazu) neprokazujeme přítomnost původce choroby, ale pouze reakci části (!) imunitního systému základní pravidlo: Protilátky nejsou nemoc, výsledek je nutné hodnotit v kontextu klinického stavu pacienta a ostatních laboratorních vyšetření! Chyby interpretace nepřímého průkazu nález protilátek se mylně považuje za diagnostický pouze důkaz o kontaktu organismu s antigenem v případě zkřížené reaktivity ani to ne negativní nález považován za vyloučení infekce dg. okno malá citlivost reakce … přítomnost protilátek se považuje za patologickou Východisko dobrá informovanost klinika i mikrobiologa úzká spolupráce obou  Příklady – protilátky jako průkaz infekce Z jednoho vzorku Chronické infekce, kde agens přetrvá v organismu celý život HIV, syfilis (+ konfirmace) Zvláštní infekce EBV – průkaz heterofilních protilátek (IM, OCH) – 1. měsíc nemoci Průkaz jednotlivých tříd IgG a avidity někdy nespolehlivé (aktivace chronické infekce, pozdní nástup IgM…) Dynamika titru Běžné, často se vyskytující nákazy (promoření populace) Odstup sér – týden (chřipka) až 6 týdnů (borelióza) Čtyřnásobný vzestup Index pozitivity  Čtyřnásobný vzestup titru Ředění v sérologii 1:4 = 1 díl + 3 díly !!! 4násobný vzestup (pokles) = ob 1 ředění 0 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 2x 2x = 4x Sérokonverze = z nuly o 2 ředění  Avidita protilátek = pevnost vazby protilátek s antigenem v průběhu nemoci se mění – zvyšuje se (vazba „vyzrává“) vyšetření srovnání intenzity reakce normálně proběhlé s reakcí, kdy jsme se pokusili tuto vazbu rozrušit (např. roztokem urey…) vymizení reakce svědčí pro čerstvou infekci www.odec.ca Jak mikrobiolog hodnotí nález? zkušenost dynamika protilátek změny hladin protilátek v průběhu onemocnění vyšetření 2 vzorků séra vždy v souvislosti se stavem pacienta spolupráce laboratoř – klinik http://www.wikiskripta.eu/index.php/Protil%C3%A1tka anamnestické titry = protilátky v organismu po prodělání onemocnění  Stanovení titru – má člověk protilátky? Nález protilátek = člověk se někdy s infekcí setkal Epidemiologické přehledy, po očkování … Sérologické vyšetření Prodělává člověk onemocnění? - při podezření na infekci Výše titru (většinou nestačí) Dynamika protilátek 1. vzorek negativní, po 14 dnech pozitivní = sérokonverze vzestup titru 4x, (pokles titru 4x) tvorba Ab: od začátku nemoci IgM, pak IgG Vyšetření párových sér (současně – vyloučení lab. chyby)  Ovlivňující faktory Související s etiopatogenezí choroby (stádium, charakter …) Související s mikroorganismem neprotilátková imunita – tbc mikrob napadá buňky imunitního systému – CMV, HIV …) Související se stavem imunitního systému pacienta věk, gravidita, imunitní poškození … Související s použitými laboratorními metodami citlivé reakce – ELISA, IF, neutralizace (pozitivní dříve) KFR, aglutinace – pozitivní nález svědčí pro čerstvou infekci Pozor u průkazu IgM přítomnost tzv. revmatoidního faktoru (IgM proti vlastním IgG) - reakce „vlastního“ komplexu IgG-IgM - falešně pozitivní reakce na přítomnost IgM  Dozrávání imunitního systému Vývoj produkce imunoglobulinů Porod http://kmil.trios.cz/Predchozi/kmil07012c.htm http://www.sanidadanimal.info/cursos/inmun/tercero2.htm  Dynamika protilátek při infekčním onemocnění variabilita dle druhu infekčního agens a průběhu nemoci (inkubační doba...) styk s Ag – začátek nemoci první průkaz Ab – cca po 10 dnech první protilátky IgM (event. IgA) během týdne až měsíce se vytratí jejich průkaz svědčí pro čerstvou (nebo aktivní) infekci IgG objeví se později, pozvolný nástup po začátku onemocnění, vrchol za měsíc mohou přetrvávat velmi dlouho  Index pozitivity Vyjádření výsledků pomocí bezrozměrného čísla (IP) Naměřená hodnota séra / hodnota standardního séra negativní IP < 0,9 pozitivní IP > 1,1 hraniční +/- 10 % kolem hodnoty standardního séra IP = 0,9–1,1  Laboratorní charakteristiky antigen - určuje specificitu 1. Preanalytická fáze metody detekční systém - určuje citlivost 2. Specificita a senzitivita reakce (sensitivitu) metody Senzitivita zajímá se o nemocné pacienty = správný záchyt nemocných pravděpodobnost, že test bude pozitivní u nemocných testy s vysokou senzitivitou - screeningová vyšetření „nesmí uniknout nemocný“ (někdo může být falešně +) Specifita zajímá se o zdravé pacienty = správná negativita u lidí bez onemocnění u lidí vybraných screeningovou metodou označí jen ty skutečně nemocné „všichni negativní jsou skutečně negativní“ (někdo může být falešně -) Zvýšení senzitivity může snížit specificitu 3. Laboratorní chyba nepřesnost pomůcek a zařízení, reagencií dáno, tzv. chyba měření výsledek měření se vždy pohybuje v určitém pravděpodobném rozsahu (chybovém intervalu) lidský faktor  Interpretace nálezů vždy v souvislosti s klinickým stavem pacienta a s jeho dalšími nálezy nikdy se neléčí laboratorní nález, ale vždy nemoc pacienta „titritida“ – protilátky nejsou nemoc řešení nálezů v rozporu se stavem pacienta opakování sledování použití jiné metody … Dynamika titrů protilátek proti EBV http://www1.lf1.cuni.cz/~hrozs/lymfa1.htm Dynamika titrů protilátek proti Toxoplasma gondii  Sérologické markery VHA http://www1.lf1.cuni.cz/~hrozs/vhakpch1.htm Sérologické markery akutní VHB Děkuji za pozornost