Séquençage de l'ADN PDF

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Université Frères Mentouri Constantine 01 L3 Bioinformatique Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Année universitaire 2024/2025 Département de Biologie Appliquée Présenté par Dr Méziani.D.Y Séquençage de l’ADN I. Définition Le séquençage de l’ADN constitue une méthode dont le but est de déterminer l'ordre d'enchaînement des nucléotides d’un fragment d’ADN donné. La lecture de cette séquence permet d’étudier l’information biologique contenue par celle-ci. Étant donné l’unicité et la spécificité de la structure de l’ADN chez chaque individu, la séquence de l’ADN permet de nombreuses applications dans le domaine de la médecine, comme, par exemple, le diagnostic, les études génétiques, l’étude de paternité, la criminologie, la compréhension de mécanismes physiopathologiques, la synthèse de médicaments, les enquêtes épidémiologiques II. Historique Le séquençage de l’ADN est une technique qui a révolutionné la biologie moléculaire seulement une vingtaine d’années après l’établissement de la structure de l’ADN par Watson et Crick. Le séquençage de l'ADN a été inventée dans la deuxième moitié des années 1970. Deux méthodes ont été développées indépendamment, l'une par l'équipe de Walter Gilbert, aux États-Unis, et l'autre par celle de Frederick Sanger en 1977, en Grande-Bretagne. Ces deux méthodes sont fondées sur des principes diamétralement opposés : l'approche de Sanger est une méthode par synthèse enzymatique sélective, tandis que celle de Maxam et Gilbert est une méthode par dégradation chimique sélective. Pour cette découverte, Gilbert et Sanger ont été récompensés par le prix Nobel de chimie en 1980. Le premier organisme biologique dont le génome a été séquencé en 1977 est le virus bactériophage φX1741. Ce virus a la propriété d'avoir un génome constitué d'ADN simple brin qui est encapsulé dans la particule virale. Depuis une trentaine d'année, l'amélioration de la technique de production des amorces, de l'amplification des brins et la généralisation des traceurs fluorescents ont permis d'améliorer considérablement les techniques de séquençage. L'apparition des séquenceurs automatiques a notamment permis l'automatisation de ces technologies et ont contribué à la finalisation du génotypage humain en 2003. Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis une trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'ADN. 1 III. Séquençage 1ère génération : a. Méthode de Sanger La méthode de séquençage de Sanger (dite par terminaison de chaîne) est une technique enzymatique qui utilise des nucléotides appelés didésoxyribonucléotides (ddNTP) qui diffèrent des dNTP par l’absence de groupe hydroxyle (OH) sur le carbone 3' du ribose remplacé par un atome d’hydrogène. Dans un premier temps, il est nécessaire d’amplifier l’ADN cible par PCR, puis de le dénaturer afin d’obtenir un ADN simple brin. À l’aide d’une amorce spécifique et complémentaire du brin étudié (sens ou antisens), identique ou différente de celle utilisée pour la PCR, une ADN polymérase effectue alors la synthèse de l’ADN complémentaire à partir de cette amorce. De l’extrémité 5′ vers l’extrémité 3′, cette enzyme ajoute les désoxyribonucléotides-triphosphates (dNTP) complémentaires et de manière aléatoire et inconstante des didésoxyribonucléotides triphosphates (ddNTP), par exemple un ddGTP sera parfois ajouté à la place d’un dGTP. Quatre milieux réactionnels sont préparés pour le séquençage, chacun contient un ddNTP différent. Lorsqu’un ddNTP est incorporé à la place d’un dNTP, L’absence de l’hydroxyle en 3’ empêche la formation de la liaison phosphodiester avec le nucléotide qui devrait être ajouté ensuite et l’ADN polymérase ne peut plus continuer sa polymérisation. Les ddNTP jouent ainsi le rôle d’inhibiteurs de la synthèse de l’ADN. Il se forme donc une multitude de brins complémentaires inachevés, ainsi dans chacune des quatre préparations, est produite une série de molécules d’ADN de différentes longueurs. Par la suite les molécules d’ADN synthétisées sont séparées par une électrophorèse sur gel suivant leur taille avec les quatre préparations versées sur quatre puits parallèles du gel. La 2 séquence de l’ADN matrice peut être déterminée en identifiant les plus petites bandes et celles de plus en plus grandes et en associant la ligne dans le gel à la base terminale. La méthode mise au point par Sanger a pu être automatiser à l’aide des fluorochromes, petits composés chimiques qui émettent une lumière colorée. En ajoutant un fluorochrome de couleur différente à chaque nucléotide on peut effectuer le séquençage en un seul mélange réactif dans un seul tube. Pour déterminer la séquence, on éclaire le tube avec un laser. Lorsque la lumière traverse chaque bande de couleur, un détecteur inscrit un pic sur un graphique. Ces pics correspondent aux bases nucléotidiques. L’ordinateur reçoit donc une série de mesure d’intensité lumineuse en interprétant la couleur de la fluorescence de chaque pic l’ordinateur écrit la séquence d’ADN. 3 b. Méthode de Maxam-Gilbert Il s’agit d’une méthode chimique de séquençage. Les réactifs clivent spécifiquement après chacune des bases C, G, [A + G] et [C + T]. Cette technique est basée sur une dégradation de l'ADN via la propriété de certains agents chimiques, l’hydrazine, le diméthyl sulfate (DMS) et l’acide formique, de modifier les bases de l’ADN. Dans un second temps, la pipéridine est ajoutée et casse les brins d’ADN au niveau des bases modifiées. Les agents chimiques sont utilisés dans des conditions telles qu’ils n’agissent 4 qu’avec un faible pourcentage des bases de l’ADN étudié. Le DMS agit au niveau des bases "G". L’acide formique agit au niveau des bases "A + G". L’hydrazine agit au niveau des bases "C + T" (en milieu alcalin, l’hydrazine agit uniquement au niveau des "C"). L’ADN à séquencer est marqué à une extrémité. Le plus souvent, il s’agit d’un marqueur radioactif. Le produit de séquence est déposé sur un gel d’acrylamide, puis la séquence lue après autoradiographie. Cette technique permettait d’analyser des fragments allant jusqu’à 500 pb. 2. Séquençage 2ème génération : Pyroséquençage Le pyroséquençage est une technique de séquençage de l'ADN qui permet d’effectuer un séquençage rapide et à moindre coût qu’un séquençage par la méthode de Sanger. En effet, cette technique permet une lecture directe de la séquence obtenue après le séquençage. Le 5 principe du pyroséquençage a d'abord été énoncé en 1993 par Pettersson, Uhlen et Nyren puis elle a été développée à partir de l’année 1998. Le pyrosequençage est de loin la technique non Sanger qui a connu le plus de succès. Il s’agit d’un séquençage par synthèse (sequencing by sysnthesis, SBS) et qui se caractérise par la révélation en temps réel de l’activité de l’ADN polymérase (real time sequencing) qui ajoute un seul nucléotide non fluorescent à la fois. Cette technique est basée sur le principe de séquençage par synthèse, qui s’oppose au séquençage par “terminaison” qui est utilisé dans la méthode de Sanger. Le pyroséquençage repose sur une cascade de réactions La méthode développée par Nyrén consiste à synthétiser le brin complémentaire d'un brin d'ADN, paire de bases par paire de bases, avec une enzyme de synthèse de l'ADN et un substrat contenant une enzyme chimioluminescente, c'est-à-dire une enzyme qui émet de la lumière suite à une réaction chimique. Des solutions des quatre bases nucléotidiques A, G, C et T, sont ajoutées séquentiellement. Lorsque l'appariement d'une paire de bases à lieu, un signal lumineux est produit par libération d'une enzyme chimioluminescente. Ce signal peut être détecté par une caméra et cartographié par un logiciel. Ce processus est répété pour chacune des quatre solutions différentes et les bases cartographiées sont combinées pour établir la séquence d'ADN complète. Le pyroséquencage se déroule en 5 étapes :  Préparer le mélange réactionnel, avec les enzymes clefs et les différents substrats  Les nucléotides ne sont pas ajoutés tous ensemble comme dans une réaction de séquençage normale mais l’un après l’autre. Si le Nucléotide ajouté dans le milieu réactionnel correspond à celui attendu par la Polymérase, il est incorporé dans le brin en cours de synthèse (d’élongation) et libère un Pyrophosphate (PPi).  La sulfurylase vient alors transformer ce Pyrophophate (PPi) en ATP qui est alors utilisé, couplé à une Luciférine, par une Luciférase. On a alors production d’un signal Lumineux. (Les luciférines sont des molécules dont l'oxydation, sous le contrôle d'une enzyme, la luciférase, aboutit à la formation d'oxyluciférine et à l'émission de photons.).  L’Apyrase dégrade les nucléotides en surplus. 6  Le signal lumineux est capté par un capteur CCD (Charge-Coupled Device) puis reproduit sous forme d’un pic sur le Pyrogramme. La hauteur de ce pic est fonction de l’intensité du signal lumineux, elle-même proportionnelle au nombre de nucléotides incorporés en même temps. On peut donc déduire la séquence à partir de la taille des pics obtenus. V. Application du séquençage d’ADN Le séquençage de l’ADN peut être utilisé pour déterminer la séquence de gènes individuels, de grandes régions génétiques, des chromosomes complets ou des génomes entiers, de n'importe quel organisme.  En biologie moléculaire, le séquençage du génome permet l’étude des protéines encodées, les chercheurs identifient les changements dans les gènes et les associent avec certaines maladies afin de cibler de potentiels médicaments.  En biologie évolutive, le séquençage de l'ADN est utilisé pour étudier la manière dont les différents organismes sont liés et comment ils ont évolué  En génétique médicale, il est possible de séquencer les gènes des patients pour déterminer s'il existe un risque de maladies génétiques. Il s'agit d'un examen des caractéristiques génétiques de la personne. Le diagnostic est classiquement pré ou post-natal.  En médecine reproductive, le séquençage de l’ADN, notamment des cellules sexuelles, a permis d’appréhender les modifications génétiques causant un dérèglement de la fertilité.  En microbiologie, le séquençage du génome entier des microorganismes de la même espèce permet de déterminer à quel point ces génomes sont différents en quantifiant le 7  nombre de mutations entre les organismes. Lors de transmission directe d'une bactérie d'un patient à un autre, le nombre de mutation de différence est donc très faible.  En médecine légale, le séquençage de l'ADN peut être utilisé avec des méthodes de profilage de l'ADN pour l'identification médico-légale et les tests de paternité. Il faut toutefois préciser qu'un test de paternité n'a de valeur juridique en France que si c'est un juge qui l'a ordonné. 8