Thérapie Génique 2.pptx PDF

BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes => SEQUENCAGE DU DNA Elle consiste à utiliser des didésoxyribonucléotides et un DNA à séquencer inséré dans le vecteur M13 (ou le plasmide pUC) Un didésoxynucléoside triphosphate est un analogue structural d’un désoxynucléoside...

BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes => SEQUENCAGE DU DNA Elle consiste à utiliser des didésoxyribonucléotides et un DNA à séquencer inséré dans le vecteur M13 (ou le plasmide pUC) Un didésoxynucléoside triphosphate est un analogue structural d’un désoxynucléoside NH2 triphosphate mais ne possède pas de groupement N hydroxyle (OH) en 3’ O N O O OH P O P O P O H2C O N N OH OH OH H H énosine didésoxyribonucléoside H H Triphosphate 06/11/2024 H H 1  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes => SEQUENCAGE DU DNA Le didésoxynucléoside triphosphate peut normalement s’incorporer dans la chaîne en cours de synthèse, mais l’extension de la chaîne s’arrête aussitôt après son incorporation Le bactériophage M13 possède une séquence caractéristique (adjacente ou polylinker) identique à tous les vecteurs M13 => commercialisation par certains laboratoires d’une AMORCE dite UNIVERSELLE qui permet quelque soit l’INSERT son amplification par l’ADN polymérase Le DNA polymérase est une enzyme qui permet de synthétiser 06/11/2024 une chaîne de DNA à partir d’une 2  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes => SEQUENCAGE DU DNA Si le DNA à séquencer est cloné dans un plasmide pUC, le pUC recombinant est d’abord dénaturé > LA REACTION DU SEQUENCAGE Elle s’effectue en traitant parallèlement 4 tubes contenant chacun: -Le brin de DNA à séquencer - 4 desoxynucléotides non radioactifs (A,T,G,C) - L’ amorce universelle - une DNA polymérase - 06/11/2024 1 seul type de didésoxynucléotide radioactif 3 /  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes > LA REACTION DU SEQUENCAGE Tube 1: ddATP* Tube 2: ddGTP* Tube 3: ddCTP* Tube 4: ddTTP* séquençage d’un fragment d’ADN de 15 nucléotides 5’ GC TAGTCCTGTGACG 3’ ? 3’ ………………………… GC 5’ La DNA polymérase a à chaque fois le choix d’incorporer un nucléotide normal ou un dd nucléotide. Chaque incorporation d’un dd nucléotide radioactif => arrêt de la polymérisation 06/11/2024 4  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes > LA REACTION DU SEQUENCAGE ube 1: ddATP* => 3’ ACTGC 5’; 3’ ACACTGC 5’ etc. ube 2: ddGTP* => 3’ GC 5’; 3’ GACACTGC 5’ etc. ube 3: ddCTP* => 3’ C 5’; 3’ CTGC 5’ etc. ube 4: ddTTP* => 3’ TGC 5’; 3’ TCAGGACACTGC 5’ équençage d’un fragment d’ADN de 15 nucléotides GC TAGTCCTGTGACG 3’ ………………………… GC 5’ Tous les segments visualisés seront radioactifs et ceux n’ayant pas pu incorporer un ddnt échappent 06/11/2024 à l’identification 5  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes > LA REACTION DU SEQUENCAGE Tube 1: ddATP* 5’ GCTAGTCCTGTGACG 5’ 3’ GCTAGTCCTGTGACG 3’ 3’ ACTGC 5’ 3’ ACACTGC 5’ 5’ GCTAGTCCTGTGACG 3’ 5’ GCTAGTCCTGTGACG 3’ 3’ AGGACACTGC 3’ 5’ ATCAGGACACTGC 5’ EX: séquençage d’un fragment d’ADN de 15 nucléotides 06/11/2024 6  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes > LA REACTION DU SEQUENCAGE Tube 2: ddGTP* 5’ GCTAGTCCTGTGACG 3’ 5’ GCTAGTCCTGTGACG 3’ 3’ GC 5’3’ GACACTGC 5’ 5’ GCTAGTCCTGTGACG 3’ 5’ GCTAGTCCTGTGACG 3’ 3’ GGACACTGC 3’ 5’ GATCAGGACACTGC 5’ EX: séquençage d’un fragment d’ADN de 15 nucléotides 06/11/2024 7  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes > LA REACTION DU SEQUENCAGE Tube 3: ddCTP* 5’ GCTAGTCCTGTGACG 5’ 3’ GCTAGTCCTGTGACG 3’ 3’ C 5’3’ CTGC 5’ 5’ GCTAGTCCTGTGACG 3’ 5’ GCTAGTCCTGTGACG 3’ 3’ CACTGC 3’ 5’ CAGGACACTGC 5’ 5’ GCTAGTCCTGTGACG 3’ 3’ CGATCAGGACACTGC 5’ EX: séquençage d’un fragment d’ADN de 15 nucléotides 06/11/2024 8  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes => LA REACTION DU SEQUENCAGE Tube 4: ddTTP* 5’ GCTAGTCCTGTGACG 3’ 5’ GCTAGTCCTGTGACG 3’ 3’ TGC 5’ 3’ TCAGGACACTGC 5’ EX: séquençage d’un fragment d’ADN de 15 nucléotides 06/11/2024 9  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes REACTION DU SEQUENCAGE PARATION DES FRAGMENTS OBTENUS PAR ELECTROPH Les molécules seront séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide Le pouvoir discriminant du gel est tel qu’il permet de différencier des brins de DNA ne différent que d’un seul nucléotide REVELATION PAR AUTORADIOGRAPHIE 06/11/2024 10  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes REACTION DU SEQUENCAGE ARATION DES FRAGMENTS OBTENUS PAR ELECTROPHORESE 3’ CGATCAGGACACTGC 5’ 3’ GATCAGGACACTGC 5’ 3’ A 3 G 2 1 - C 4 T 3’ ATCAGGACACTGC 5’ 5 6 7 3’ TCAGGACACTGC 5’ 3’ CAGGACACTGC 5’ 9 8 A 10 G 3’ AGGACACTGC 5’ 11 3’ GGACACTGC 5’ 12 3’ GACACTGC 5’ 13 14 3’ ACACTGC 5’ 15 3’ CACTGC 5’ 3’ACTGC 5’ 5’ + 3’ CTGC 5’ Technique de SANGER 3’ TGC 5’ 3’ GC 5’ 3’ C 5’ On lit le film de haut en bas (3’->5’) ou dans le sens 5’->3’ mais de bas vers le haut du gel 3’ CGATCAGGACACTGC 5’  BRIN SYNTHETISE Connaissant la séquence du brin complémentaire synthétisé on en déduit la 06/11/2024 11 séquence du brin matrice soit:  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes Þ POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) La PCR (réaction de polymérisation en chaine) est une technique d’amplification de DNA in vitro, à l’instar du clonage qui est une technique d’amplification in vivo utilisant les bactéries (technique décrite en 1985 par K. Mullis et al., PRIX NOBEL de CHIMIE en 1993) Conditions  Définir la région du DNA à amplifier afin de synthétiser des oligonucléotides complémentaires  AMORCE ou PRIMER =>06/11/2024 Cet oligonucléotide va servir à repérer le DNA 12 à  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 3 ETAPES DENATURATION à 92 -95 °C => SEPARATION DES DEUX BRINS HYBRIDATION à 50-55°C => APPARIEMENT DES AMORCES ELONGATION à 70 -72 => EXTENSION DES AMORCES PAR L’ADN POLYMERASE ENZYME: 06/11/2024 Taq polymérase = isolée d’une bactérie 13  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Température PCR se fait en conditions stériles Dénaturation pour éviter les 92-95°C contaminations …………………………………………………… Polymérisation 70-72°C (Taq pol) ……………….………. ……….. Hybridation 50-55°C ………………………. ………. Cycle de PCR A la fin de chaque cycle la molécule de DNA a été multipliée 06/11/2024 par 2: l’amplification est donc 14  BIOLOGIE MOLECULAIRE - Etude des gènes Þ APPLICATIONS DE LA PCR La PCR est appliquée lorsqu’il s’agit d’amplifier de toutes petites quantités de DNA à étudier EXEMPLES:  Détermination des empreintes génétiques en criminologie (chercher l’auteur d’un crime à partir du sperme, cheveux…)  Détermination d’un diagnostic anténatal: Drépanocytose, infection virale… 06/11/2024 15  BIOLOGIE MOLECULAIRE IV- Applications Diagnostic (diagnostic anténatal de la drépanocytose) Au niveau du gène, la drépanocytose est due à une mutation au niveau du 1er exon du gène de la β-globine (au niveau protéique remplacement du glutamate par la valine) T 5’ …………………….CCT GAG GAG …………………..3’ DNA 3’……………………..GGA CTC CTC ……………………..5’ A Transcription 5’ …………………….CCU GAG GAG ………………….. 3’ m UTraduction H2N……………………Pro…Glu …GLu ……………COOH β-g 06/11/2024 16 Val  BIOLOGIE MOLECULAIRE IV- Applications Diagnostic (diagnostic anténatal de la drépanocytose) La technique couramment utilisée pour diagnostiquer la drépanocytose est l’électrophorèse de l’hémoglobine => basée sur la différence de migration électrophorétique de l’hémoglobine A (normale, plus acide, migrant plus vite) et l’hémoglobine S Cette anomalie peut être recherchée au niveau génique à partir des cellules du fœtus (cellules du liquide amniotique, prélevées dès la 17ème semaine 06/11/2024 de grossesse, ou précocement dès la 817 ème  BIOLOGIE MOLECULAIRE IV- Applications Diagnostic (diagnostic anténatal de la drépanocytose) udier = chromosome 11 -> chaîne β rtie de DNA sera coupée par une enzyme de restrictio CCTNAGG G G A N’T C C N’ = n’importe laquelle des bases (palindrome imparf Ce palindrome correspond à la séquence des codons n°5 et 6 et le début du 7ème codon de l’exon N°1 du gène de la β-globine (chromosome 11) 06/11/2024 Mst II = Microcoleus species (algue bleue) 18  BIOLOGIE MOLECULAIRE IV- Applications Diagnostic (diagnostic anténatal de la drépanocytose) Action de Mst II …………. …………. 5’P 3’OH 3’OH DNA NORMAL 5’P Exon 1 Exon 2 1,15 kb 0,20 kb Mutation …………. 5’P 3’OHDNA Drépanocytos 3’OH 5’P Exon 1 Exon 2 Action de Mst II 1,35 kb 06/11/2024 19  BIOLOGIE MOLECULAIRE IV- Applications Diagnostic (diagnostic anténatal de la drépanocytose) On obtient l’autoradiogramme suivant: S S 1,35 kb A A 1,15 kb Hétérozygote Normal HbAA HbASHomozygote HbSS 06/11/2024 20  BIOLOGIE MOLECULAIRE IV- Applications Diagnostic (diagnostic anténatal de la >drépanocytose) Principales étapes  Extraction du DNA  Coupure du DNA par l’enzyme de restriction Mst II donnant des fragments de longueurs différentes  PCR  Séparation par électrophorèse (gel polyacrylamide)  Dénaturation du DNA (séparation double hélice)  Transfert 06/11/2024 du gel sur une membrane de 21  BIOLOGIE MOLECULAIRE IV- Applications Médecine légale (empreintes génétiques) Définitions:  Les empreintes génétiques ont été décrites en 1985 par JEFFREYS (Angleterre) et sont utilisées depuis 1987 C’est un ensemble de fragments d’ADN de taille variable, obtenus après digestion par des enzymes de restriction, séparation par électrophorèse et visualisation par autoradiographie  RFLP = Restriction Fragment Length => SPECIFICITE (Polymorphisme Polymorphisme GENETIQUE d’undeindividu longueuret des sa FILIATION fragments de restriction) 06/11/2024 22  BIOLOGIE MOLECULAIRE IV- Applications Médecine légale (empreintes génétiques) LES SEQUENCES CODANTES DU GENE sont généralement très semblables d’un individu à un autre, puisque codant des protéines identiques ou proche LES SEQUENCES NON CODANTES subissent d’assez grandes variations au cours de l’évolution Dans cette partie non codante il existe des séquences appelées MINISATELLITES ou VNTR (variable number of tandem repeat = nombre variable de séquences répétées en tandem) Le nombre de répétition de cette séquence est très 06/11/2024 23 variable d’un individu à l’autre et se transmet de  BIOLOGIE MOLECULAIRE IV- Applications Médecine légale (empreintes génétiques) TECHNIQUES DES EMPREINTES GENETIQUES  Extraction du DNA (sang, sperme…)  Digestion du DNA par les enzymes de restriction  PCR  Séparation des fragments par électrophorèse PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) => dénaturation du double brin  Southern Blot => transfert du gel sur membrane 06/11/2024 de Nylon 24  BIOLOGIE MOLECULAIRE IV- Applications Médecine légale (empreintes génétiques) TECHNIQUES DES EMPREINTES GENETIQUES 2 kb Brin P INDIVIDU 1 Brin M 1,8 kb 2,2 kb Brin P Brin M INDIVIDU 2 1,6 kb IND Ech IND 1 2 2,2 kb 2 kb 1,8 kb 06/11/2024 1,6 kb 25  BIOLOGIE MOLECULAIRE IV- Applications Evaluation de l’efficacité d’un traitement antiviral A. ol A PN A Ec oR I tr M BV n PN M C o P1 - P1 - P1 D H  Extraction du DNA (cellules) RC L  Séparation des ADN par CCC électrophorèse => SS dénaturation du double brinB.  Southern Blot => transfert 140 Relative band intensity 120 du gel sur membrane de 100 80 44 % 60 59 % Nylon 40 20 60 %  Hybridation avec un sonde 0 spécifique radioactive  Visualisation des bandes Figure 6 radioactives par autoradiographie Ndeboko et al., Brevet INSERM BIO06250 06/11/2024 26  BIOLOGIE MOLECULAIRE V- Conclusion La biologie moléculaire est une discipline qui permet d’étudier les gènes (structure, expression et régulation) Les outils de base sont, les acides nucléiques (ADN, ARN); les enzymes de restriction (donc les protéines); etc. La biologie moléculaire a permis de comprendre les mécanismes de fonctionnement d’une cellule TRANSCRIPTION grâce aux TRADUCTIONdes gènes techniques de manipulation ADN ARN m PROTEINES REPLICATION 06/11/2024 Le DOGME de la Biologie Moléculaire 27