Gua de Prácticas Parasitología 2024-II PDF

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Universidad Nacional Mayor de San Marcos Universidad del Perú. Decana de América Facultad de Farmacia y Bioquímica Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica Departamento Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada MANUAL DE PRÁCTICAS PARASITOLOGÍA Responsable de la Asignatura - PhD. Edwin Hualpa Cutipa 2024-II  GUÍA DE PRÁCTICAS PARASITOLOGÍA – 2024-II E.P. FARMACIA y BIOQUÍMICA PRÁCTICA 1: Principios de bioseguridad. Microscopía. Toma, manejo y conservación de muestras parasitológicas Introducción Objetivos Parte 1: Principios de bioseguridad en el laboratorio Parte 2: Bases y principios de la microscopía Parte 3: Principales estrategias para la conservación de muestras parasitológicas. Cuestionario Introducción La parasitología es la disciplina encargada del estudio de los parásitos que juegan un rol muy interesante en el desarrollo de los organismos que funcionan como sus hospederos o huéspedes. Por lo cual es importante conocer los aspectos de bioseguridad al manipular las muestras biológicas que contienen dichas especies parasítica, con la finalidad de no contagiarnos accidentalmente. Adicionalmente, es vital que los estudiantes tengan conocimientos de la correcta manipulación de los dispositivos utilizados en el estudio de dichos parásitos (microscopía). El manejo y conservación de las muestras parasitológicas para una correcta identificación es un factor de importancia, ya que determinará el éxito en la identificación y correcto diagnóstico. Por lo tanto, en esta guía de practicas se resumen los principales aspectos de bioseguridad, microscopia y manejo y conservación de muestras parasitológicas. Objetivos: Identificar y comprender los principios de bioseguridad, Microscopía y la manera adecuada para la recolección, manejo y conservación de muestras parasitológicas. Parte 1: Principios de bioseguridad en el laboratorio Los laboratorios están diseñados para cumplir con tres objetivos principales: educación, diagnóstico e investigación. Actualmente el tema de la bioseguridad se ha convertido en un eje fundamental de la vida diaria, debido básicamente a la pandemia ocasionada por el SARS-COV-2. Sin embargo, en los ambientes de investigación y enseñanza la bioseguridad tiene el objetivo de proteger al personal que trabaja en los laboratorios con fines educativos, de diagnóstico rutinario y de investigación, así como a las personas ajenas al laboratorio y a los materiales de éste. Desde la década de 1990, el concepto de bioseguridad ha comenzado a desarrollarse para los laboratorios y las directrices de bioseguridad han empezado a ser publicadas por parte de varias universidades e instituciones. Las precauciones relacionadas con la bioseguridad y las normas se determinan en función de la evaluación del riesgo de los microorganismos o parásitos que se van a estudiar en el laboratorio. De acuerdo con estas evaluaciones de riesgo los microorganismos se han clasificado en cuatro grupos de riesgo y se han determinado cuatro tipos de niveles de bioseguridad en el laboratorio. En estos niveles de bioseguridad en el laboratorio, además de las aplicaciones de bioseguridad en microbiología y parasitología estándar, se toman aplicaciones y precauciones específicas que se mencionan como barreras de propiedad primarias y secundarias. Las unidades de cuidado de animales y los centros de producción y cuidado de artrópodos también se clasifican como laboratorios. El término de bioseguridad incluye temas como la recogida adecuada de los residuos generados en el laboratorio, el transporte y la eliminación de sustancias químicas y radiactivas, que incluyen también a microorganismos bajo distintos grupos de riesgo para el operante (Tabla 1). _____________________________________________________________________________ pág. 2  GUÍA DE PRÁCTICAS PARASITOLOGÍA – 2024-II E.P. FARMACIA y BIOQUÍMICA Tabla 1. Grupos de riesgo y características de los microorganismos infecciosos. Grupo Riesgo Riesgo de Explicación personal social riesgo 1 Bajo o Bajo o En este grupo están los microorganismos los cuales probablemente no nulo nulo causan enfermedades en humanos y animales. 2 Medio Bajo Existen microrganismos en este grupo que pueden ocasionar enfermedades en humanos y animales, sin embargo, no representan un riesgo importante para los laboratoristas, sociedad, mascotas y el ambiente. 3 Bajo Bajo A pesar de que los patógenos son capaces de ocasionar graves y serias infecciones, ellas son raramente transmitidas entre personas infectadas. Existen tratamientos efectivos y medidas de protección contra dichos patógenos. 4 Alto Alto Los patógenos en este grupo causan serias enfermedades en los humanos y animales. Se transmiten directa e indirectamente de una persona a otra. Usualmente no hay un tratamiento efectivo y medidas de protección frente a estos patógenos Clasificación de los agentes infecciosos por grupos de riesgo La mayoría de las infecciones parasitarias se encuentran en el Grupo de Riesgo 2. Los Grupos de Riesgo 3 y 4 no contienen ningún agente parasitario. Según los CDC y los Institutos Nacionales de Salud (NIH), la agrupación de parásitos por clasificación de riesgo microbiológico se presenta en la Tabla 2. Tabla 2. Grupos de riesgo de parásitos según la clasificación de riesgo microbiológico. Parásito Nivel de bioseguridad CDC Grupo de riesgo NIH 1 Ancylostoma duodenale 2 2 2 Ascaris lumbricoides 2 2 3 Ascaris suum 2 2 4 Clonorchis sinensis - - 5 Diphyllobothrium latum - - 6 Echinococcus granulosis 2 2 7 Entamoeba histolytica 2 2 8 Fasciola hepatica 2 2 9 Giardia lamblia 2 2 10 Hymenolepis diminuta - 2 11 Hymenolepis nana 2 2 12 Leishmania braziliensis 2 2 13 Leishmania donovani 2 2 14 Naegleria fowleri 2 2 15 Plasmodium falciparum 2 2 17 Plasmodium vivax 2 2 18 Schistosoma mansoni 2 2 19 Strongyloides stercoralis 2 2 20 Taenia saginata - - 21 Taenia solium 2 2 22 Toxocara canis - 2 23 Toxoplasma gondii 2 2 24 Trichinella spiralis - 2 25 Trichomonas vaginalis - - 26 Trichostrongylus spp. 2 2 27 Trichuris trichiura 2 2 28 Trypanosoma brucei brucei 2 2 _____________________________________________________________________________ pág. 3  GUÍA DE PRÁCTICAS PARASITOLOGÍA – 2024-II E.P. FARMACIA y BIOQUÍMICA Parte 2: Bases y principios de la microscopía Existen varios tipos de microscopios, tales como el microscopio estereoscópico, el compuesto, de campo oscuro, fluorescencia, contraste de fases, de luz ultravioleta; el microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido. Para saber cuál elegir debemos preguntarnos, ¿Qué es lo que queremos observar?, los más usados en los laboratorios de nivel superior son los siguientes: Microscopio compuesto: es el que se utiliza de manera más común en las prácticas de temas biológicos, este microscopio consta de tres sistemas: mecánico, de iluminación y óptico. a) Sistema mecánico: son todas las partes que sirven de soporte al microscopio: base (pie o soporte), brazo, tubo de microscopio, cabezal, platina (carro), revólver, tornillos micrométricos y macrométrico de enfoque. En algunos microscopios, al estar unidos la base y el brazo en una sola pieza, reciben el nombre de estativo. Base (pie o soporte) Brazo Tubo de microscopio Cabezal Platina Revólver Tornillos macrométrico y micrométrico para enfoque b) Sistema de iluminación: Se encuentra situado bajo la platina y tiene la función de iluminar los objetos por medio de luz transmitida, debido a que la mayoría de las observaciones se realizan por transparencia. Está representado por el espejo u otra fuente de iluminación, condensador y diafragma. En algunas clasificaciones se considera al condensador en el sistema óptico. Espejo Condensador Diafragma Foco o fuente de luz c) Sistema óptico: está constituido por oculares y objetivos. Objetivos Oculares Microscopio estereoscópico: este microscopio nos sirve para observar muestras de mayor tamaño, ya sean muestras enteras o parte de ellas, se encuentra compuesto por tres sistemas: a) Sistema mecánico: son todas las partes que sirven de soporte al microscopio: brazo, pie o soporte, tornillo macrométrico de enfoque. Nota: En el brazo de este tipo de microscopio se encuentra una de las fuentes de luz, por lo que a la hora de transportarlo se debe tener cuidado con esta. b) Sistema de iluminación: cuenta con dos fuentes de luz: una situada en la base (parte inferior) del microscopio y la otra situada en el brazo del mismo; el condensador y el espejo, nos son visibles. c) Sistema óptico: En este microscopio únicamente se puede apreciar un objetivo, pero se pueden cambiar los lentes desde 0.8X, 1X, 1.5X, 2X, 2.5X, 3X, 3.5X y 4X dependiendo la marca y el modelo del microscopio. Para saber cuántas veces aumentamos la muestra se hace exactamente lo mismo que con el microscopio óptico, se multiplica el valor del ocular (10X) por el valor del lente que se esté trabajando, por ejemplo, se trabaja con el 0.8X (10X por 0.8X igual a 8) entonces aumentamos la muestra a 8 veces su tamaño real. A diferencia del microscopio óptico en el estereoscópico observamos las preparaciones tal cual, sin invertir por la lente, es decir que si se pone un recorte de alguna palabra se puede leer igual que si trajera _____________________________________________________________________________ pág. 4  GUÍA DE PRÁCTICAS PARASITOLOGÍA – 2024-II E.P. FARMACIA y BIOQUÍMICA unos anteojos o una lupa. En la figura 1, se observan las partes del microscopio óptico compuesto y un estereoscopio. A B Figura 1. A: Microscopio compuesto. B: Microscopio estereoscópico. Parte 3: Principales estrategias para la conservación de muestras parasitológicas. Recolección de la muestra: La recogida de muestras incluye heces, esputo, sangre, raspados de piel, muestras de tejido e incluso orina y otros fluidos corporales como el líquido cefalorraquídeo (LCR) y los aspirados duodenales. Los ectoparásitos suelen rasparse de la piel con una hoja de bisturí o con el borde de un portaobjetos y se examinan utilizando una solución que pueda que permita la tinción o la diferenciación del organismo mediante examen microscópico. El LCR requiere una aspiración con aguja del líquido de las meninges del cerebro y la columna vertebral; la aspiración del líquido duodenal se recoge de la misma manera. El esputo se recoge tras una tos profunda o en forma de lavados bronquiales realizados por un médico. Las muestras para examinar los parásitos de la sangre, como el paludismo intracelular, requieren un sencillo procedimiento de flebotomía (procedimiento para el que se usa una aguja para extraer sangre de una vena). Ocasionalmente pueden encontrarse huevos de Paragonimus westermani o Schistosom hematobium en la orina, o cuando la materia fecal es la fuente del parásito o de sus huevos, así como un ectoparásito casual como la sarna que cae en la orina. Las liendres también se pueden extraer del cabello con unas pinzas para examinarlas al microscopio e identificarlas. Es raro que alguno de los otros fluidos corporales pueda albergar un parásito, y de ser así se trataría de un procedimiento especial utilizando algunas de las mismas técnicas que se utilizan de forma rutinaria en el departamento de parasitología. Los endoparásitos recuperados a partir de una muestra fecal son los más sencillas de recoger. Las posibilidades de recuperar un parásito de una muestra clínica aumentan drásticamente cuando se siguen ciertos procedimientos de recogida. A veces es necesario realizar procedimientos de identificación en más de una muestra, y de forma programada, para para optimizar los porcentajes de recuperación e identificación del organismo. Además, es necesario conocer el ciclo vital y la epidemiología del organismo sospechoso y los criterios de recogida, manipulación y transporte de la muestra. También es conveniente que el profesional del laboratorio siga prácticas seguras como el uso higiene de las manos antes y después de enguantarse y quitarse los guantes, y la limpieza exhaustiva de las superficies de trabajo tras la manipulación de las muestras clínicas. Muchos de estos organismos parasitarios son muy contagiosos y se transmiten fácilmente a la persona incauta que manipula la muestra. Cuando un laboratorio selecciona sus métodos de recolección, la decisión debe basarse en un conocimiento profundo del valor y las limitaciones de cada uno. Uno de los aspectos más importantes de _____________________________________________________________________________ pág. 5  GUÍA DE PRÁCTICAS PARASITOLOGÍA – 2024-II E.P. FARMACIA y BIOQUÍMICA la recogida de muestras es que los resultados finales del laboratorio basados en la recuperación e identificación de parásitos dependerán de la fijación inicial de los organismos. Si no se recogen y procesan adecuadamente las muestras, es posible que no se detecten estas infecciones. Los resultados del laboratorio de diagnóstico de parásitos basados en muestras recogidas de forma incorrecta pueden requerir un gasto excesivo de tiempo y suministros y también pueden inducir a error de diagnóstico. Como parte de cualquier programa general de gestión de la calidad total o de mejora continua de la calidad para el laboratorio, la generación de resultados de pruebas debe comenzar con criterios estrictos de aceptación o rechazo de muestras. Las consecuencias de una muestra mal tomada y/o mal enviada pueden suponer un fracaso en la identificación del agente etiológico Lo ideal es que las muestras se transporten al laboratorio dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Para asegurar la integridad de las posibles formas parasitarias que pueden estar presentes es importante el uso de medios especiales de conservación, o de soporte para el transporte de las muestras que se retrasen más de 30 minutos. Si las muestras no se pueden procesar en cuanto se reciben en el laboratorio, se deben almacenar a temperatura ambiente, o refrigeradas, según el tipo de muestra (tabla 3). Tabla 3. Principales estrategias para la recolección de muestras biológicas con contenido de parásitos. Muestra Contenedor Utilidad diagnóstica Frasco de Heces Helmintos y protozoos boca ancha Test de Graham Cinta adhesiva Enterobius vermicularis Giardia, Strongyloides, Aspirado duodenal o Frasco de boca ancha Clonorchis, yeyunal Enterobius.vermicularis Sangre Tubo con EDTA Plasmodium, microfilarias EDTA: etilediamiotetraacetato Frasco de boca ancha: Las muestras de heces se recomienda recogerlas empleando frascos con medio de transporte para asegurar la viabilidad de las posibles estructuras parasitarias existentes (Fig. 2). Figura 2. Frasco para recolección de muestras fecales Técnica de Graham La prueba de Graham es una técnica relativamente sencilla de realizar que nos permite el estudio de Enterobius vermicularis y, en ocasiones, de Taenia spp. En el caso de E. vermicularis, las hembras de este nematodo realizan la puesta de huevos en la zona anal del paciente, normalmente por las noches, lo cual genera un intenso picor. Y en el caso de Taenia spp., a veces se produce la salida a través del esfínter anal de anillos llenos de huevos o proglótides, lo cual facilita el depósito de estos huevos en la región perianal. _____________________________________________________________________________ pág. 6  GUÍA DE PRÁCTICAS PARASITOLOGÍA – 2024-II E.P. FARMACIA y BIOQUÍMICA Para llevar a cabo esta prueba es necesario tener en cuenta unas recomendaciones durante el proceso de recogida de muestras, que deben ser correctamente explicadas a los pacientes que se vayan a someter a la prueba (figura 3). Fig. 3. Prueba de Graham. Diagrama representativo para la recolección de muestra. Conservación y/o preservación de muestras Conservantes: Hay varias razones por las que puede producirse un retraso desde el momento del paso de la muestra hasta el examen en el laboratorio (por ejemplo, la carga de trabajo en el laboratorio o la distancia o el tiempo de tránsito de la muestra hasta el centro). Para preservar la morfología de los protozoos y evitar el desarrollo continuo de algunos huevos y larvas de helmintos, las muestras de heces pueden colocarse en un conservante inmediatamente después del paso (por parte del paciente utilizando un kit de recogida), también puede utilizarse un termo con hielo en gel para evitar el desarrollo y conservar al parasito. Hay varios fijadores disponibles (Tabla 4); los más comunes, incluyendo formalina (formol), Merthiolate (timerosal)-yodo-formalina (MIF), fenol-alcohol-formol (FAF), acetato de sodio- ácido acético-formalina (SAF), líquido de Schaudinn, alcohol polivinílico (PVA). Independientemente del fijador seleccionado, es imperativo que se mezcle adecuadamente la muestra y el conservante. En la figura 4, se muestra un diagrama de flujo para la conservación y el procesamiento se muestra. Figura 4. Diagrama de flujo para la conservación y el procesamiento de muestras fecales. _____________________________________________________________________________ pág. 7  GUÍA DE PRÁCTICAS PARASITOLOGÍA – 2024-II E.P. FARMACIA y BIOQUÍMICA Otra forma de conservar la muestra es por refrigeración 3-5 0C, permitiendo preservar trofozoítos por varios días. Los quistes en heces normales pueden durar hasta un mes viables a baja temperatura, sin embargo, se debe evitar la deshidratación de la muestra utilizando un frasco hermético, tener en cuenta que la muestra no debe congelarse, debido a que destruiría los componentes de los parásitos. Tabla 4. Principales ventajas y desventajas del uso de conservantes de parásitos. Preparación de un conservante: Solución de formol 5% y 10% Formol al 10% Formol al 5% Formaldehído 100 ml Formaldehído 50 ml 0.85% NaCl 900 ml 0.85% NaCl 950 ml Diluir 100 ml de formaldehído Diluir 50 ml de formaldehído en en 900 ml de solución salina al 950 ml de solución salina al 0.85%, también se puede 0.85%, también se puede utilizar agua destilada en utilizar agua destilada en reemplazo de NaCl. reemplazo de NaCl. Transporte de muestras Para el transporte de muestras se debe utilizar frascos herméticos y de rosca, con la finalidad de evitar derrames y contaminación. En caso de requerir enviar muestras a laboratorio de referencia utilizar el sistema de triple embalaje, se recomienda de manera preferencial enviar las muestras separadas. En cuanto a los preservantes el formol, preserva helmintos y larvas (por años), la conservación en PVA permitirá realizar coloraciones permanentes de trofozoítos y quistes posteriores. El uso de formol permite desodorizar las muestras. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué muestra y procedimiento de recolección usaría para evaluar nematodos en pasturas? 2. ¿Qué diferencias existen entre los diferentes métodos de preservación de muestras que contienen parásitos? _____________________________________________________________________________ pág. 8  GUÍA DE PRÁCTICAS PARASITOLOGÍA – 2024-II E.P. FARMACIA y BIOQUÍMICA 3. Se le ha encargado realizar un estudio de parásitos en un ave corredora que habita en los andes peruanos. ¿Qué estrategias utilizaría para recolectar y conservar la muestra? 4. ¿Cuál es la mejor opción para conservar muestras de parásitos para su posterior observación? 5. Desarrolle un planteamiento de investigación que implique el estudios experimentales utilizando parásitos. BIBLIOGRAFÍA 1. Assafa, D., Kibru, E., Nagesh, S., Gebreselassie, S., Deribe, F. and Ali, J. (2004). LECTURE NOTES Medical Parasitology. 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