Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Parasitologi 2024 PDF

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Parasitologi Disusun oleh : apt. Oemeria Shitta Subadra, M.Farm. apt. Muhammad Anugerah Alam Waris, M.Si. Program Studi Diploma III Farmasi Poltekkes Kemenkes Surakarta 2024  HALAMAN PENGESAHAN Buku petunjuk praktikum Jurusa...

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi & Parasitologi Disusun oleh : apt. Oemeria Shitta Subadra, M.Farm. apt. Muhammad Anugerah Alam Waris, M.Si. Program Studi Diploma III Farmasi Poltekkes Kemenkes Surakarta 2024  HALAMAN PENGESAHAN Buku petunjuk praktikum Jurusan Farmasi, Poltekkes Kemenkes Surakarta dengan judul: MIKROBIOLOGI DAN PARASITOLOGI Telah diperiksa dan telah mendapat pengesahan sebagai buku petunjuk praktikum di laboratorium Jurusan Farmasi. Klaten, Juli 2024 Ketua Jurusan Farmasi Dr. apt. Nutrisia A. Sayuti, M.Sc. NIP. 198101242012122001 i  KATA PENGANTAR Penuntun Praktikum Mikrobiologi & Parasitologi disusun sebagai penuntun bagi mahasiswa dalam melakukan praktikum di Laboratorium Mikrobiologi Farmasi, program studi DIII Farmasi, Poltekkes Kemenkes Surakarta. Tujuan utama penulisan penuntun ini adalah untuk membantu mahasiswa dalam mempelajari teknik dan prosedur Mikrobiologi Farmasi. Materi praktikum meliputi pengenalan alat, penentuan nilai minimum inhibitory control, pembuatan media pertumbuhan, pewarnaan bakteri, isolasi bakteri, penentuan angka lempeng total, angka kapang khamir, most probable number, uji sensitivitas antimikroorganisme, uji potensi antibiotika, uji koefisien fenol dan uji biokimia. Materi-materi tersebut disusun dari berbagai referensi yang membahas tentang mikrobiologi. Penyusun menyadari bahwa penuntun ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, saran dan kritikan untuk perbaikan penuntun ini, sangat kami harapkan. Klaten, Juli 2024 Penyusun ii  DAFTAR ISI Halaman Halaman Judul i Halaman Pengesahan ii Kata Pengantar iii Visi dan Misi iv Daftar Isi v Tata Tertib vi Praktikum I Pengenalan Alat 1 Praktikum II Sterilisasi 6 Praktikum III Pembuatan Media Pertumbuhan 13 Praktikum IV Pewarnaan Bakteri 18 Praktikum V Isolasi Bakteri 30 Praktikum VI Uji Angka Lempeng Total 42 Praktikum VII Uji Angka Kapang Khamir 46 Praktikum VIII Uji Most Probable Number 49 Praktikum IX Uji Sensitivitas Antimikroorganisme (Metode Difusi) 53 Praktikum X Uji Sensitivitas Antimikroorganisme (Metode Dilusi) 58 Praktikum XI Uji Potensi Antibiotik 60 Praktikum XII Uji Koefisien Fenol 62 Praktikum XIII Uji Biokimia 64 Format Laporan 67 iii  TATA TERTIB MEMASUKI LABORATORIUM 1. Praktikan wajib hadir 5 menit sebelum acara praktikum berlangsung. Praktikan tidak diperkenankan mengikuti praktikum apabila keterlambatan lebih dari 15 menit. 2. Praktikan diharuskan memakai jas praktikum dan sandal laboratorium (sebelum memasuki laboratorium), alat pelindung berupa sarung tangan (handscoon) dan masker (pada saat pengambilan dan penimbangan media, inokulasi mikroba, isolasi mikroba dan perlakuan yang berhubungan dengan mikroba, pemakaian jas praktikum dan masker juga diwajibkan saat melakukan pengamatan hasil di luar jam praktikum). 3. Setiap praktikan diwajibkan menjaga kebersihan meja dan alat alat lab yang digunakan. 4. Setiap praktikan harus mencuci tangan sebelum maupun sesudah praktikum dilaksanakan. 5. Setiap praktikan harus mempelajari dan memahami teori dan prosedur kerja sebelum praktek berlangsung. Sebelum praktikum dimulai, praktikan wajib mengumpulkan laporan sementara yang merupakan prasyarat mengikuti acara praktikum pada hari itu. Praktikan yang tidak mengumpulkan laporan sementara, tidak diperbolehkan mengikuti praktikum pada hari itu. 6. Praktikan diharuskan bekerja secara terencana, hati-hati dan teliti. Setelah selesai praktikum, alat-alat maupun bahan yang digunakan harus dikembalikan dalam kondisi bersih dan utuh. Semua praktikan bertanggung jawab terhadap kebersihan dan keamanan ruang praktikum, serta alat-alat yang digunakan. 7. Praktikan yang memecahkan, merusakkan dan atau menghilangkan alat diharuskan melapor ke dosen / pranata laboratorium pendidikan dan mengganti alat tersebut secepatnya. Praktikan yang merusakkan, memecahkan atau menghilangkan alat diwajibkan menuliskan pada blangko yang telah disediakan di laboratorium di bawah pengawasan dosen / pranata laboratorium pendidikan. 8. Praktikan diharuskan menjaga kemurnian bahan-bahan yang dipakai dan menjauhkan segala macam kontaminan yang dapat mengganggu kevalidan hasil praktikum. 9. Setiap praktikan wajib membuat laporan sementara dan disetujui setelah kegiatan praktikum selesai dan wajib mengikuti ujian praktikum. 10. Bagi mahasiswa yang presentase kehadiran praktikum kurang dari 85 persen maka mahasiswa bersangkutan tidak diperbolehkan mengikuti ujian akhir praktikum Mikrobiologi & Parasitologi. iv  PRAKTIKUM I PENGENALAN ALAT I. Tujuan Praktikum Mengetahui tata cara, cara bekerja yang baik dan benar di laboratorium mikrobiologi II. Dasar Teori Alat merupakan salah satu pendukung daripada keberhasilan suatu pekerjaan di laboratorium. Sehingga memudahkan dan melancarkan berlangsungnya praktikum, pengetahuan alat sangat diperlukan. Setiap alat memiliki nama yang menunujukkan kegunaan alat, prinsip kerja atau proses ketika alat digunakan. Beberapa kegunaan alat dapat dikenali berdasarkan namanya. Penamaan alat alat yang berfungsi mengukur biasanya diakhiri dengan kata meter seperti thermometer, hygrometer dan spectrometer, dan lain lain. 1. Mikroskop Salah satu alat untuk melihat sel mikroba adalah mikroskop. Dengan mikroskop dapat diamati sel bakteri yang tidak dapat dilihat secara kasad mata. Pada umumnya, mata tidak mampu membedakan benda dengan diameter lebih kecil dari 0,1 mm. Cara kerja: Lensa objektif berfungsi untuk pembentukan bayangan pertama dan menentukan struktur serta bagian renik yang akan terlihat bayangan akhir serta kemampuan untuk memperbesar objek sehingga dapat memiliki suatu ukuran daya pisah suatu lensa objektif yang akan menentukan daya pisah spesimen sehingga mampu menunjukkan struktur renik yang berdekatan sebagai suatu dua benda terpisah. Lensa adalah lensa yang terdapat dibagian ujung atas tabung berdekatan dengn mata pengamat dan berfungsi untuk memperbesar bayangan yang dihasilkan oleh lensa objektif sampai 4 hingga 25 kali. 1 Lensa kondensor merupakan lensa yang berfungsi mendukung terciptanya pencahayaan pada objek yang akan dilihat sehingga dengan pengaturan yang tepat maka akan diperoleh daya pisah maksimal. Gambar 1. Mikroskop Cahaya 2. Autoklaf Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan seperti media yang akan digunakan dalam praktikum mikrobiologi. Alat ini menggunakan uap air panas bertekanan kira 2 atm(=15 Psi) dengan lama strerilisasi umumnya 15 menit (Gambar 2). Gambar 2. Autoklaf 2 3. Inkubator Inkubator merupakan alat untuk menginkubasikan mikrobia pada suhu yang telah ditentukan (Gambar 3a). 4. Colony counter Adalah alat yang berguna untuk menghitung koloni tang tumbuh dalam cawan petri (Gambar 3b) Gambar 3. a. Inkubator, b. Colony counter 5. Laminar air flow Laminar air flow untuk pengerjaan sacara aseptis karena mempunyai pola pengaturan dan penyaringan aliran udara sehingga aseptis dan aplikasi sinar UV beberapa jam sebelum digunakan. Gambar 4. Laminar air flow 6. Hot plate stirrer dan Stirrer bar Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer) berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan dengan pengadukan. Pelat (plate) yang terdapat dalam alat ini dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses homogenisasi. Pengadukan dengan bantuan batang magnet. Gambar 5. Hot plate stirrer dan Stirrer bar 3  7. Mikro pipet dan Tip Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil, biasanya kurang dari 1000 μL. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet, misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume pipette) antara 1-20 μL, atau mikropipet yang tidak bias diatur volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5μL. Dalam penggunannya, mikropipet memerlukan tip. Gambar 6. Mikropipet dan Tip III. Alat dan Bahan A. Alat elektrik 3. Pipet tetes 1. Mikroskop 4. Tabung reaksi 2. Autoklaf 5. tabung durham 3. Incubator 6. Labu Erlenmeyer 4. Lemari pendingin 7. Glass beads 5. Colony counter 8. Mortar dan stamper B. Alat keramik 9. Beaker glass 1. Cawan porselin 10. Buncen burner 2. Cawam krusible 11. Gelas ukur 3. Corong Buchner 12. Batang L / drugalsky 4. Plat tetes D. Alat non gelas 5. Mortar dan stemper 1. Jarum inokulum C. Alat gelas 2. Pinset 1. Cawan petri 3. Rubber bulb 2. Pipet ukur 4. pH meter 4  5. mikropipet dan tip IV. Diskusi Gambarkan alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini, tunjukkan bagian-bagiannya serta fungsinya. Kerjakan di buku gambar. 2  PRAKTIKUM II STERILISASI I. Tujuan Mahasiswa mengerti dan memahami cara sterilisasi dengan baik. II. Dasar Teori Sterilisasi adalah suatu proses pembebasan suatu bahan atau alat dari semua bentuk organisme hidup. Macam-macam Stresilisasi: Sterilisasi dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu: 1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0,22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotic. 2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan dan penyinaran a. Pemanasan Pemijaran(dengan api langsung) : membakar alat pada api secara langsung, contoh alat: jarum inoculum, pinset, batang L, dll. Panas kering : sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180 C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya Erlenmeyer, tabung reaksi dll. Uap air panas : konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggunakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi. Uap air bertekanan : menggunakan autoklaf. b. Penyinaran dengan UV Sinar UV juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV. 6  3. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alcohol. III. Alat dan Bahan A. Alat 1. Labu Erlenmeyer 2. Batang Pengaduk 3. Gelas ukur 4. Cawan petri 5. Tabung reaksi 6. Pembakar Bunsen 7. Timbangan analitik 8. Pipet volume 9. Autoklaf 10. Pembakar spitus B. Bahan 1. Kasa 2. Kapas 3. Kertas payung 4. Aquades 5. Alkohol 6. Spiritus 7 IV. Prosedur Kerja Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan Teknik aseptis : 1. Desinfeksi meja kerja 8 2. Memindahkan biakan secara aseptis 9 3. Memindahkan Biakan dari Cawan 10 4. Memindahkan Cairan dengan Pipet 11 5. Menuang Media Catatan Kerja Aseptis: 1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung / cawan / Erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang memungkinkan kontaminan masuk) dibakar / dilewatkan api terlebih dahulu. 2. Pinset / batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol 70% terlebih dahulu lalu dibakar. 3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang terjadi. 4. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke bagian api. 5. Jika kerja di safety cabinet tidak perlu menggunakan pembakar Bunsen, tetapi jika di luar safety cabinet maka semakin banyak sumber api semakin terjamin kondisi aseptisnya. 12 V. Diskusi No Alat / Bahan Metode Sterilisasi Alasan 13  PRAKTIKUM III PEMBUATAN MEDIA PERTUMBUHAN I. Tujuan Mahasiswa mengerti serta memahami mengenai media pertumbuhan, fungsi serta cara pembuatan media pertumbuhan. II. Dasar Teori Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikrobia untuk pertumbuhan dan perkembangannya. Dalam mempelajari morfologi maupun fisiologi serta untuk keperluan identifikasi suatu mikrobia umumnya akan sangat berhubungan dengan media pertumbuhan. Media pertumbuhan bagi mikrobia dapat berupa media cair ataupun media padat. Suatu media pertumbuhan umumnya terdiri dari bahan dasar seperti air sebagai pelarut, agar atau gelatin ataupun silica gel yang berfungsi memadatkan media. Disamping itu media pertumbuhan harus mengandung unsur atau senyawa yang diperlukan oleh mikrobia. Unsur-unsur tersebut dapat berupa C, H, O, N dan P (unsur makro), Fe, dan Mg (unsur mikro) serta vitamin serta bahan tambahan lainnya seperti phenol red yang berguna sebagai indikator tingkat kemasaman media dan antibiotik. MACAM_MACAM MEDIA PERTUMBUHAN Berdasakan sifat fisiknya media pertumbuhan dapat dibedakan atas 3 yaitu: 1. Medium padat: medium yang komposisi agarnya 15% 2. Medium setengah padat: medium yang komposisi agarnya 0.4% 3. Medium cair: yaitu medium yang tidak mengandung agar contoh nutrient broth (NB), lactose broth (LB). Berdasarkan komposisnya medium pertumbuhan dikelompokkan dalam : 1. Medium sintetis yaitu medium yang komposisi zat kimianya (glukosa agar dll) diketahui secara jelas dan pasti. 14  2. Medium semi sintetis yaitu medium yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti contoh PDA (Potato Dextrose Agar) yang terdiri dari agar, dekstrosa dan ekstrak kentang (ekstrak kentang tdk dikethui apa komposisi senyawanya) 3. Medium non sintesis yaitu medium yang dibuat langsung dari bahan dasarnya. Contoh tomato juice agar. Berdasarkan tujuan penggunaannya: 1. Media untuk isolasi: umumnya media yang mengandung semua unsure essensial untuk pertumbuhan contoh NA 2. Medium slektif: medium yang selain mengandung nutrisi juga mengandung senyawa tertentu yang berfungsi untuk menghambat atau menekan pertumbuhan mikrobia bukan sasaran. Contoh medium yang ditambah dengan amphisilin untuk menekan mikrobia lainnya. 3. Medium diperkaya: medium yang mengandung bahan dasar untuk pertumnuhanmikrobia tetapi ditambah komponen komplek lainnya seperti serum, kuning telur atau lainnya. 4. Medium untuk peremajaan kultur 5. Medium untuk karakterisasi bakteri. III. Alat dan Bahan A. Alat 1. Labu Erlenmeyer 6. Pembakar Bunsen 2. Batang Pengaduk 7. Timbangan analitik 3. Gelas ukur 8. Autoklaf 4. Cawan petri 9. LAF 5. Tabung reaksi B. Bahan 1. Beef extract 5. Nutrient agar 2. Peptone 6. Aquades 3. Agar 7. NaOH 4. Akuades 8. HCl 15  9. Alkohol 70% 12. Kapas, kassa 10. Spiritus 13. Kertas payung 11. pH stick IV. Prosedur Kerja A. Nutrient Agar Prosedur 1 1. Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitik untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut : a. Beef extract 3g b. Peptone 5g c. Agar 15 g d. Akuades ad 1000 ml 2. Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu bagian untuk melarutkan beef extract dan peptone dan sebagian lagi untuk melarutkan agar. Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih banyak. 3. Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan diatas hotplate (jangan sampai overheat karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah) 4. Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan peptone dan beef extract cukup dengan pengadukan. 5. Setelah keduanya larut, larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk sampai homogen. Kemudian pH media diukur dengan mencelupkan kertas pH indkator. Jika pH tidak netral maka dapat ditambahkan NaOH/HCl. 6. Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilkan dengan autoklaf 7. Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis. Jika diinginkan media tegak atau miring, media pada point 5 langsung dituang ke tabung kemudian di sterilisasi. 2  Prosedur 2 1. Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitik untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut: a. Nutrient agar 23 g b. Aquades ad 1000 ml 2. Larutkan nutrient agar ke dalam 1000 ml aquadest 3. Tuang ke Erlenmeyer dan atur pHnya menjadi 6-7 dengan menambahkan larutan HCl 1 N atau NaOH 1 N dan ukur dengan pH indikator universal. 4. Sterilkan media menggunakan autoclave 5. Apabila sterilisas telah selesai, dinginkan media 6. Tuangkan secara aseptis dalam laminar flow untuk membuat media tegak ataupun miring. B. Nutrient Broth Komposisi untuk media NB sama dengan NA, tetapi tidak memakai agar sebagai pemadat. Proses pembuatannya lebih sederhana. Peptone dan beef extract dilarutkan dengan akuades, kemudian ditampung dalam labu Erlenmeyer atau tabung reaksi dan siap untuk di sterilisasi. Proses ini tidak memerlukan panas, peptone dan beef extract akan mudah dilarutkan pada air suhu kamar jika diaduk V. Diskusi Masing-masing media dibungkus dengan kertas payung, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam. Amati apakah tumbuh bakteri/kapang. 17  PRAKTIKUM IV PEWARNAAN BAKTERI I. Tujuan Mahasiswa mengetahui morfologi dan struktur sel mikroorganisme dengan mewarnai sel. II. Dasar Teori Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang paling umum digunakan, karena pewarnaan sederhana hanya menggunakan satu jenis zat warna. Pewarnaan sederhana memungkinkan dapat membedakan bakteri berdasarkan perbedaan bentuknya yaitu coccus, batang, spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Macam pewarnaan: a. Pewarnaan sederhana 1) Pewarnaan positif 2) Pewarnaan negatif b. Pewarnaan diferensial 1) Pewarnaan gram 2) Pewarnaan acid fast dll c. Pewarnaan khusus 1) Pewarnaan endospore 2) Pewarnaan flagella dll Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat prearat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa 18  lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Cystal violet, methylene blue, safranin, base fuchsin, malachite green dll. Sedangkan warna basa antara lain eosin, congo red dll. Morfologi bakteri: III. Alat dan Bahan A. Alat 1. Object glass 2. Deck glass 3. Pencil glass 4. Mikroskop 5. Pinset 6. Pembakar Bunsen B. Bahan 1. Suspense bakteri 2. Olie immerse 3. Kapas 19  4. Etanol 70%, 96% 5. Aquades 6. Methylene blue 7. Safranin 8. Crystal violet 9. Nigrosin 10. Mordant (Lugol’s iodine) 11. Malachite green 12. HCl IV. Prosedur Kerja A. Pewarnaan Sederhana Pewarnaan positif Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian di fiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tetapi jika terlalu encer maka akan kesulitan saat mencari bakteri di mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya. Cara Kerja : 1. Kaca objek bebas lemak dipanaskan sebentar diatas api. Diberi tanda dengan pencil glass. 2. Jarum ose dipanaskan (disterilkan) diatas api Bunsen kemudian didinginkan 3. Suspense banteri diambil dengan ose steril, kemudian digoreskan pada object glass yang telah diberi tanda. 4. Object glass yang telah digoreskan bakteri didinginkan dan dikeringkan, difiksasi dengan cara melewatkan diatas api Bunsen 3x dan didinginkan. 5. Tetesi zat warna (metilen blue, safranin, cristal violet), diamkan selama 1-2 menit, buang warna berlebih dan keringkan. 6. Tetesi olie immerse, amati dibawah mikroskop dengan menggunakan objective pembesaran 100x. 20 Pewarnaan negatif Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, ehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam. Cara Kerja : 6. Ambil 2 buah object glass, teteskan nigrosine/tinta cina di ujung kanan salah satu object glass 7. Biakan diambil lalu diulaskan/diteteskan dalam tetesan nigrosine tadi, lalu dicampurkan. 8. Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri 9. Biarkan preparat mengering di udara, jangan di fiksasi/dipanaskan di atas api 21 B. Pewarnaan Gram Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiogi, karena merupakan tahapan paling penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membrane sel bakeri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu Gram positif dan Gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan bakteri gram negatif mepunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Cara Kerja : 1. Buat preparat ulas (smear) yang teah difiksasi 2. Teteskan Kristal violet sebagai pewarna utama, tunggu ± 1 menit. Cuci dengan akuades mengalir 3. Teteskan mordant (lugol’s iodine), tunggu ± 1 menit. Cuci dengan akuades mengalir 22 23 4. Beri larutan pemucat (etanol 96% / aseton) setetes demi setetes hingga etanol yang jatuh berwarna jernih. Jangan sampai terlalu banyak (overdecolorize). Cuci dengan akuades mengalir 5. Teteskan counterstrain (safranin) dan tunggu ± 45 detik. Cuci dengan akuades mengalir 6. Keringkan dengan kertas tisu yang ditempelkan di ulasan (jangan sampai merusak ulasan), lalu biarkan mongering di udara. 7. Amati di bawah mikroskop. 8. Ulasan bakteri diamati warnanya, apakah berwarna biru gelap atau ungu (gram positip) atau berwarna merah muda (gram negatif). C. Pewarnaan Endospora Bakteri dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetative, sehingga metabolismenya berifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan, tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (keduany transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Cara Kerja : 1. Buat preparat ulas dari Bacillus subtilis 2. Tetesi ulasan pada object glass dengan malachite green. Letakkan di atas air yang mendidih/panaskan di atas api. Biarkan 5 menit. Dijaga jangan sampai kering. Jika bagian pinggir mulai mengering, tambahkan lagi malachite green. 3. Setelah dingin, bilas object glass dengan akuades mengalir 4. Tetesi dengan safranin sebagai counterstrain, diamkan ± 45 detik 24  5. Cuci kering anginkan, lihat di mikroskop perbesaran 100 x Sel dan endopsora Sel terwarnai, Suhu endopsora normal tidak Sel dan Pemanasan endopsora terwarnai Pemberian Malachite green Endopsora Pelunturan terwarnai, sel tidak Pelunturan dengan air mengalir Endospora berwarna hijau, sel berwarna putih Penambahan safranin Cuci dan keringkan 25 D. Pewarnaan Tahan Asam Pewarnaan ini digunakan untuk membedakan bakteri yang tahan terhadap larutan asam (biasanya genus mycobacterium) dan yang tidak tahan terhadap larutan asam. Bakteri dari genus mycobacterium dan spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoid (berlemak) di dalam dinding-dinding selnya. Hal ini menyebabkan dinding sel relatif tidak permeable terhadap zat-zat warna sehingga sel-sel bakteri tidak terwarnai oleh metode biasa. Cara Kerja: 1. Buat preparat ulas 2. Tetesi ulasan dengan carbol fuchsin. Letakkan di atas air yang mendidih/panaskan di atas api. Biarkan 5 menit. Dijaga jangan sampai sampai kering. Jika bagian pinggir mulai mengering, tambahkan lagi carbol fuchsin. 3. Setelah dingin, tetesi dengan alcohol asam (3% HCl dalam etanol 95%) sebagai decolorize, diamkan selama ± 45 detik 4. Cuci kering anginkan, lihat di mikroskop perbesaran 100x E. Pengamatan Motilitas (Pengamatan langsung dengan tetes gantung) 1. Oleskan vaselin pada 4 sudut deck glass 2. Teteskan biakan bakteri motil seperti Bacillus sp. atau E. coli ke deck glass (sebaiknya dari biakan cair) 3. Tutup dengan object glass, balikkan dengan cepat. 4. Amati mengunakan mikroskop dengan perbesaran 40x. bakteri akan tampak transparan dan pola pergerakannya tidak beraturan. Hati-hati jangan salah membedakan antara sel yang bergek sendiri karna flagel atau bergerak karena aliran air 26 V. Hasil Pengamatan Pewarnaan Bakteri No Gambar Keterangan 1 Pewarnaan Sederhana Morfologi : (Positif) 2 Pewarnaan Sederhana Morfologi : (Negatif) 3 Pewarnaan Gram Morfologi : Warna : Jenis bakteri : Bakteri gram ……………….. 27 4 Pewarnaan Tahan Asam Morfologi: Keterangan : 5 Pengamatan motilitas Morfologi: Keterangan : 28  PRAKTIKUM V ISOLASI BAKTERI I. Tujuan Mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campuran sehingga didapat kultur murni II. Dasar Teori Pada umumnya kita dapat menjumpai mikroba pada setiap tempat baik dalam tanah,udara, air bahkan pada hampir semua yang ada terdapat mikrobia. Tentu saja dalam mempelajari mikroorganisme mahasiswa harus mengerti dan memahami bagaimana mengisolasi dan memisahkan mikrobia tersebut agar didapat biakan murni sesuai dengan yang dikehendaki sehingga dapat dipelajari morfologi, biologi ataupun karakteristik mikrobia tersebut. Sebelum dapat melakukan isolasi maka yang harus dilakukan terlebih dahulu adalah pengambilan sampel atau contoh. Sampel yang diambil dapat berupa tanah, air, bagian tanaman ataupun manusia dan lain- lain. Teknik Pengambilan Sampel 1. Sampel tanah Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, mak cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang diinginkan mikroorganisme rhizofer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung akar. 2. Sampel air Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika berasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali. Jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumnya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar 29 Teknik Preparasi Sampel Sampel yang telah diambil kemudian disupensikan dalam akades steril. Tujuan dari teknin ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparasi bergantung pada bentuk sampel: a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya meja, batu, batang kayu, dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab lebih baik jika cotton bud dicelupkan dahulu dalam larutan atraktan : pepton water. b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun, bunga, dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1:9 (w/v). Contohnya sampel daun ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass c. Masceration (penghancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam sampel dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antara lain bakso, biji, buah, dll. Perbandingan antar 30  berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1:9 (w/v). untuk sampel dari tanah tidak perlu dimaserasi. Teknik Pengenceran Bertingkat Tujuan pengenceran bertingkat yaitu untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran bergantung pada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1:9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisme dari pengenceran berikutnya. Penanaman Penanaman dari suspensi Teknik penanaman ini merupakan lanjutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir. a. Agar tabur (Spread Plate) Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah: ambil suspensi cairan sebanyak 0,1 ml dengan pipet kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah 31  memadat. Kemudian disebarkan dengan menggunakan batang L yang telah disterilkan pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata. b. Agar Tuang (pour plate) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45°C) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Cara ini akan menyebarkan sel- sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut: Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair, teteskan 1 ml secara aseptis. Suspensi sel ke dalam cawan kosong, tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi. 32  Alasan diteteskan bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaan saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate. c. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak) Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. - Goresan Sinambung Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke media baru Cara kerja : Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Putar cawan 180°C lanjutkan goresan sampai habis. Gambar 6. Inokulasi secara goresan sinambung - Goresan T Cara kerja : Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker, inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag. Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna. Lakukan hal yang sama pada daerah 3. 33  Gambar 7. Teknik goresan secara T - Goresan Kuadran (Streak quadrant) Cara kerja : Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal. Gambar 8. Teknik Goresan Kuadran c. Metode miring (slank culture) Cara kerja : menggunakan tabung reaksi, media dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian didiamkan hingga memadat. Jarum ose di celupkan pada suspense bakteri kemudian di tusukkan ke dalam agar. d. Metode tegak (Stalo culture) Cara kerja : menggunakan tabung reaksi, media dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan keadaan miring kemudian didiamkan hingga memadat. jarum ose tadi digoreskan di permukaan agar miring dengan hati-hati dan diletakkan dalam incubator 34 Morfologi Pertumbuhan pada Cawan Petri Pertumbuhan pada Agar Miring 35 Pertumbuhan pada Agar Tegak Ciri-ciri koloni berdasarkan bentuk : Ciri-ciri koloni berdasarkan kebutuhan O2 36  Pertumbuhan pada Media Cair III. Alat dan Bahan A. Alat B. Bahan 1. Petri dish 1. Suspense bakteri 2. Botol 2. Media PDA 3. LAF 3. Media NA 4. Jarum ose 4. Media NB 5. Bunsen 5. Alcohol 70% 6. Tabung reaks 6. NaCl IV. Prosedur Kerja A. Isolasi bakteri dari sampel air 1. Buatlah medium NB di tabung reaksi 2. Ambil sampel air sesuai dengan keadaan airnya (air mengalir, air keran, air tenang). 3. Ambil 1 ml sampel, masukkan ke media NB lalu inkubasi pada suhu 37°C selama 1x24 jam. B. Isolasi Bakteri dari lingkungan 1. Buat media NA di cawan petri 2. Ambil kapas lidi steril, celupkan dalam pengencer steril 37  3. Usapkan di permukaan benda/alat yang terdapat di sekitar laboratorium (lantai, kran, air, meja, dinding, handle pintu, dll) 4. Tanam pada media NA padat dengan metode steak T. 5. Inkubasi pada suhu 37°C selama 1x24 jam. C. Isolasi jamur dari sampel tanah 1. Mengambil tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-5. 2. Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam pada medium PDA cair (metode pour plate) kemudian diputar searah jarum jam 5x dan berlawana arah jarum jam 5x atau membentuk angka 68 sebanyak 5x. 3. Diinkubasi pada suhu 37°C selama 1x24 jam. 4. Koloni yang tumbuh terpisah dipilih kemudian ditumbuhkan ke media PDA baru dalam tabung dengan teknik streak. D. Isolasi bakteri dari suspensi bakteri 1. Buatlah media NA tegak 2. Jarum ose dibakar di atas api, kemudian dicelupkan ke dalam suspensi bakteri. 3. Tusukkan ke dalam media NA tegak 4. Inkubasi pada suhu 37°C selama 1x24 jam. 5. Buatlah media NA miring 6. Ambil sebagian koloni yang tumbuh, goreskan pada media NA miring V. Hasil Penanaman Bakteri Penanaman dari sampel : Penanaman dari sampel : 39  Keterangan : Keterangan : Penanaman dari sampel : Penanaman dari sampel : Keterangan : Keterangan : Hasil Isolasi Bakteri Penanaman dari sampel : Penanaman dari sampel : 40 Keterangan : Keterangan : Penanaman dari sampel : Penanaman dari sampel : Keterangan : Keterangan : 41  PRAKTIKUM VI UJI ANGKA LEMPENG TOTAL I. Tujuan Mengetahui jumlah bakteri dalam sampel dengan metode ALT II. Dasar Teori Populasi mikroba di alam tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai jenis. Di dalam laboratorium, populasi mikroba dapat diisolasi dari sumber / habitat seperti udara, tanah, air, makanan dan lainnya. Hasil isolasi umumnya merupakan biakan mikroba campuran dan perlu dimurnikan untuk memperoleh biakan murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat fisiologi dan biokimiawinya. Isolasi dapat dilakukan menggunakan beberapa teknik berikut : 1. Teknik Pengenceran 2. Teknik Penanaman Teknik isolasi mikroba dengan metode pengenceran bertujuan untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Gambar 4. Metode pengenceran 42  Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dari pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroba dari pengenceran sebelumnya. Cara kerjanya sebagai berikut : Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1 ) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan 27 mengocoknya sampai homogen. Pengocokan dilakukan dengan cara membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Diambil 1 ml dari tabung 10 -1 dengan mikropipet kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa tip mikropipet yang digunakan harus selalu diganti. Penentuan angka mikroba dapat dilakukan dengan metode plate count / hitung cawan (Angka Lempeng Total (ALT) dan Angka Kapang Khamir (AKK)), dan Most Probable Number (MPN). Angka lempeng total adalah angka yang menunjukkan jumlah bakteri mesofil dalam tiap-tiap 1 ml atau 1 gram sampel makanan yang diperiksa. Prinsip dari ALT adalah menghitung pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah sampel makanan ditanam pada lempeng media yang sesuai dengan cara tuang kemudian diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37°C. Angka Kapang Khamir (AKK) menunjukkan jumlah kapang/khamir dalam tiap-tiap 1 ml atau 1 gram sampel. Prinsipnya sama dengan ALT namun suhu inkubasinya adalah pada suhu kamar. MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair. 43 III. Alat dan Bahan A. Alat 7. Mikropipet/pipet 1. Mortar & Stamper volume 2. Labu Erlenmeyer B. Bahan 3. Cawan petri 1. Media PCA 4. Hotplate stirrer & 2. NaCl stirrer 3. Aquades 5. Pembakar Bunsen 4. Sampel makanan uji 6. Laminar air flow 5. Etanol 70% IV. Prosedur Kerja A. Angka Lempeng Total 1. Siapkan 5 buah tabung reaksi steril dan pipet ukur, simpan tabung reaksi tersebut dalam rak tabung reaksi. 2. Masukkan NaCl 0,9% sebanyak 9 ml ke dalam masing-masing tabung reaksi, tutup tabung reaksi menggunakan kapas. 3. Beri label pada setiap tabung reaksi yang akan digunakan, penandaan di mulai dari pengenceran 10-1 – 10-5. 4. Sampel dihancurkan dengan mortar dan stamper, timbang sebanyak 1 g. Apabila sampel berbentuk cair, pipet sebanyak 1 ml. 5. Masukkan ke dalam tabung reaksi dengan tanda 10-1, kocok dengan cara menggoyangkan tabung ke satu arah atau gunakan vortex agar homogen. 6. Pipet 1 ml sampel dari tabung reaksi 10-1, masukkan ke reaksi dalam tabung dengan tanda 10-2, kocok sampai homogen, ulangi prosedur hingga tabung reaksi dengan tanda 10-5. 7. Buat media PCA dengan menimbang sebanyak 2,25 g PCA, dilarutkan dalam 100 ml aquades, panaskan diatas hotplate stirrer pada suhu 270°C sampai larutan jernih. Sterilisasi menggunakan autoklaf. 44  8. Siapkan petri dish sebanyak 5 buah, beri tanda pada setiap petri dish sama seperti pada tabung reaksi. Masukkan media PCA ke dalam petri dish. 9. Pipet 1 ml sampel dari setiap tabung reaksi ke dalam masing petri dish (tabung reaksi 10-1 dimasukkan ke dalam petri dish dengan tanda 10-1, begitu seterusnya hingga tanda 10-5). 10. Putar petri dish searah jarum jam sebanyak 5 kali, kemudian berlawanan arah jarum jam sebanyak 5 kali, atau membentuk angka 8 sebanyak 5 kali. Inkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam. V. Hasil Angka Lempeng Total 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Perhitungan : 45  PRAKTIKUM VII UJI ANGKA KAPANG KHAMIR I. Tujuan Mengetahui jumlah bakteri dalam sampel dengan metode ALT II. Dasar Teori Penentuan angka mikroba dapat dilakukan dengan metode plate count / hitung cawan (Angka Lempeng Total (ALT) dan Angka Kapang Khamir (AKK)), dan Most Probable Number (MPN). Angka lempeng total adalah angka yang menunjukkan jumlah bakteri mesofil dalam tiap-tiap 1 ml atau 1 gram sampel makanan yang diperiksa. Prinsip dari ALT adalah menghitung pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah sampel makanan ditanam pada lempeng media yang sesuai dengan cara tuang kemudian diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37°C. Angka Kapang Khamir (AKK) menunjukkan jumlah kapang/khamir dalam tiap-tiap 1 ml atau 1 gram sampel. Prinsipnya sama dengan ALT namun suhu inkubasinya adalah pada suhu kamar. MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair. III. Alat dan Bahan A. Alat 7. Mikropipet/pipet 1. Mortar & Stamper volume 2. Labu Erlenmeyer B. Bahan 3. Cawan petri 1. Media PDA 4. Hotplate stirrer & 2. NaCl stirrer 3. Aquades 5. Pembakar Bunsen 4. Sampel makanan uji 6. Laminar air flow 5. Etanol 70% 46 IV. Prosedur Kerja 1. Siapkan 5 buah tabung reaksi steril dan pipet ukur, simpan tabung reaksi tersebut dalam rak tabung reaksi. 2. Masukkan NaCl 0,9% sebanyak 9 ml ke dalam masing-masing tabung reaksi, tutup tabung reaksi menggunakan kapas. 3. Beri label pada setiap tabung reaksi yang akan digunakan, penandaan di mulai dari pengenceran 10-1 – 10-5. 4. Sampel dihancurkan dengan mortar dan stamper, timbang sebanyak 1 g. Apabila sampel berbentuk cair, pipet sebanyak 1 ml. 5. Masukkan ke dalam tabung reaksi dengan tanda 10-1, kocok dengan cara menggoyangkan tabung ke satu arah atau gunakan vortex agar homogen. 6. Pipet 1 ml sampel dari tabung reaksi 10 -1, masukkan ke reaksi dalam tabung dengan tanda 10-2, kocok sampai homogen, ulangi prosedur hingga tabung reaksi dengan tanda 10-5. 7. Buat media PDA dengan menimbang sebanyak 4 g PDA, dilarutkan dalam 100 ml aquades, panaskan diatas hotplate stirrer pada suhu 270°C sampai larutan jernih. Sterilisasi menggunakan autoklaf. 8. Siapkan petri dish sebanyak 5 buah, beri tanda pada setiap petri dish sama seperti pada tabung reaksi. Masukkan media PDA ke dalam petri dish. 9. Pipet 1 ml sampel dari setiap tabung reaksi ke dalam masing petri dish (tabung reaksi 10-1 dimasukkan ke dalam petri dish dengan tanda 10-1, begitu seterusnya hingga tanda 10-5). 10. Putar petri dish searah jarum jam sebanyak 5 kali, kemudian berlawanan arah jarum jam sebanyak 5 kali, atau membentuk angka 8 sebanyak 5 kali. Inkubasi pada suhu kamar selama 5-7 hari. 47 V. Hasil Angka Kapang Khamir 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Perhitungan : 48  PRAKTIKUM VIII UJI MOST PROBABLE NUMBER I. Tujuan Mahasiswa memahami tentang pengujian kualitas air. II. Dasar Teori Kualitas air dapat ditentukan berdasarkan parameter biologis / mikrobiologis. Untuk parameter mikrobiologis, terdapat dua parameter yang dapat diukur, yakni koliform tinja dan koliform total. Air yang mengandung koliform tinja berarti air tersebut telah tercemar oleh tinja. Tinja sangat potensial untuk menularkan penyakit yang berhubungan dengan air. Koliform total dapat mengakibatkan penyakit-penyakit saluran pencernaan. Kuman koliform total tidak sepenuhnya apatogen, beberapa tipe dapat menyebabkan disentri pada bayi. Pengujian kualitas air dapat dilakukan dengan metode MPN. Metode ini terdiri dari 3 langkah yaitu : 1. Tes pendugaan (presumptive test) untuk mengetahui adanya bakteri yang mampu memfermentasi laktosa, biasanya dilakukan inokulasi sampel pada media laktosa cair. 2. Tes penegasan (confirmed test) untuk mengetahui adanya bakteri coliform dengan cara menumbuhkan pada media selektif yaitu media BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) 3. Tes pelengkap (complete test) untuk menentukan jenis bakteri coliform dengan cara identifikasi pada media uji biokimia (IMVIC) atau ciri koloni pada media selektif (endo agar) dan hasil pengecatan. Namun untuk menghemat waktu maka dilakukan hanya kedua tes pertama yaitu tes pendugaan dan tes penegasan saja, walau demikian ketepatan akan berkurang sedikit. III. Alat dan bahan A. Tes pendugaan - Lactose broth 0.5 % - Laktosa broth 1,5% - Sampel air 49  B. Tes penegasan - BGLB 2% C. Alat Tabung reaksi, pipet ukur, incubator, rak tabung reaksi IV. Prosedur kerja Tes Pendugaan 1. Siapkan 3 seri media Laktosa broth (LB) 9 tabung yang telah dilengkapi tabung durham, misalnya : - 3 tabung berisi masing-masing 5 ml LB 1,5 %→ kelompok I - 3 tabung berisi masing-masing 10 ml LB 0,5 % → kelompok II - 3 tabung berisi masing-masing 10 ml LB 0,5 % → kelompok III 2. Pipet sampel asli tanpa pengenceran sebanyak : - Masing-masing 10 ml sampel masukkan dalam tabung kelompok I - Masing-masing 1 ml sampel masukkan dalam tabung kelompok II - Masing-masing 0,1 ml sampel masukkan dalam tabung kelompok III 3. Inkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam 4. Amati jumlah tabung yang positif yaitu keruh dan ada gas ditandai dengan adanya ruang kosong pada tabung durham Tes Penegasan 1. Dari tabung yang positif diambil 1-2 ose secara aseptic dan masukkan ke dalam media BGLB cair yang dilengkapi tabung durham 2. Inkubasi pada suhu suhu 37°C selama 24 untuk bakteri Coliform dan pada suhu 44°C untuk Eschericia coli. 3. Amati jumlah tabung yang positif yaitu keruh dan ada gas ditandai dengan adanya ruang kosong pada tabung durham 4. Hasil pengamatan dirujuk pada tabel MPN Untuk sampel yang perlu pengenceran dilakukan seperti cara kerja tanpa pengenceran dengan penyiapan sampel terlebih dahulu dibuat pengenceran 20 bertingkat misalnya 10-1, 10-2, 10-3 dst, lalu pipet sebanyak 1 ml tiap pengenceran masukkan pada seri tabung media kelompok I, II dan III secara aseptik. 1 𝑀𝑃𝑁 = 𝑁𝑖𝑙𝑎𝑖 𝑀𝑃𝑁 𝑑𝑎𝑟𝑖 𝑡𝑎𝑏𝑒𝑙 𝑥 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑡𝑒𝑛𝑔𝑎ℎ Tes pendugaan Sampel air 10 ml 1 ml 0,1 ml 5 ml LB 1,5 % 10 ml LB 0,5 % 10 ml LB 0,5 % Inkubasikan pada suhu 37°C 2x24 jam Tes Penegasan Dari hasil yang positif, pindahkan 1-2 ose pada tabung yang berisi larutan BGLB 2% (10ml) Inkubasi pada suhu 37°C 2x24 jam Inkubasi pada suhu 44°C 2x24 jam 51  Tabel MPN Nomor tabung yang positif Indeks Batas kepercayaan 95% 10 ml 1 ml 0,1 ml MPN/100 Terendah Tertinggi ml 0 0 1 3